Name: 세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 배우세요 세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과를 연구하는 방법을. 쥐 유방 지방 패드의 탈세포화와 하이드로겔 형성 기술을 통해 방사선이 세포외 매트릭스 특성에 미치는 영향을 분석하고 암 재발 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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저자는 GFP- 및 루시퍼라제-4T1 세포를 제공한 로라 L. 브론사트 박사에게 감사드리며, 에드워드 L. 라고리 박사는 1-(4-(실릴라조)-아조(2-naphthol 염색) -2-나프톨 염색, IVIS 및 라이오필러 사용에 대한 크레이그 L. 듀발 박사, 그리고 박사 에 대한 조언을 구해주었습니다. 사용. 이 연구는 NIH 교부금 #R00CA201304 의해 재정적으로 지원되었습니다.

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<li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li>
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<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+and+ECM-like+materials+%E2%80%94+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li>
<li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li>
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<li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li>
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<li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li>
<li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li>
<li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

하이드로 겔 형성의이 방법은 시작 조직의 양에 크게 의존한다. 뮤린 MPS는 작고, 탈세포화 공정은 물질의 현저한감소를 초래한다(표 1). 이 프로세스는 최종 수율을 높이기 위해 더 많은 MF로 반복될 수 있습니다. 밀링은 재료의 손실로 이어질 수있는 또 다른 중요한 단계입니다. 다른 사람들은 극저온 밀로 성공을 보였지만,이 프로토콜은 유봉 부착8,17이있는휴대용 모르타르 및 전기 드릴을 통한 밀링을 기반으로합니다. 이는 자본 비용을 낮추고 재료 손실을 최소화하는 장점이 있지만 최종 제품의 변동성을 유발할 수 있습니다.
탈세포화 및 탈지질의 확인에 대한 도전은 저온 막힘 포함 매체에 지방 조직을 동결에 있습니다. 도 2A는 파라핀에 내장되고 단면화된 비조사되지 않은 MFP의 H&E 염색을 나타...

암은 세포사멸을 회피하고 또한 먼 부위로 전이할 수 있는 세포의 과잉 증식을 특징으로한다1. 유방암은 2018년에 추정된 266,000의 새로운 케이스 및 40,000의 죽음과 함께 미국에있는 여성 중 일반적인 양식의 한개입니다 2. 특히 공격적이고 치료하기 어려운 것은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 및 인간 표피 성장 인자(HER2)가 결여된 삼중 음성 유방암(TNBC)이다. 방사선 요법은 일반적으로 유방암에서 요추 절제술 다음 잔여 종양 세포를 제거하는 데 사용되지만, TNBC 환자의 13 %이상은 여전히 1 차적인 종양 부위3에서 재발을 경험합니다.
방사선 요법은 유방 절제술과 동일한 장기 생존을 초래하기 때문에 전이 및 재발을 완화하는 데 효과적인 것으로 알려져 있습니다4. 그러나, 방사선 치료는 면역 손상 설정5,6에서원발성 종양 부위에 국소 재발과 연관되어 있음을 최근에 나타났다. 또한, 방사선이 섬유증7을유도함으로써 정상 조직의 세포외 기질(ECM)을 변화시키는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 종양 세포 거동을 지시하는 방사선 유도 ECM 변화의 역할을 이해하는 것이 중요하다.
세포화 된 조직은 질병을 연구하기 위해 시험관내 모델로 사용되어 왔다 8,9. 이들 탈세포화된 조직은 ECM 조성물을 보존하고 생체 내 복합체를 재보존한다. 이러한 탈세포화된 조직 ECM은 세포 성장 및기능(10,11)을연구하는데 사용될 수 있는 재구성된 ECM 하이드로겔을 형성하기 위해 추가로 처리 및 소화될 수 있다. 예를 들어, 탈세포화된 인간 리포아스해적 및 심근 조직에서 유래한 주사용 하이드로겔은 비침습적 조직 공학의 방법으로 사용되었으며, 돼지 폐 조직에서 유래한 하이드로겔은 시험관내 시험법으로 활용되었다. 중간 엽 줄기 세포 부착 및 생존력12,13,14. ECM 속성에 정상적인 조직 방사선 손상의 효과, 그러나, 조사 되지 않았습니다.
ECM으로부터 유래된 하이드로겔은 생체내 현상의 시험관내 연구에 가장 큰 잠재력을 가지고 있다. 콜라겐, 피브린 및 마트리겔을 포함한 여러 가지 다른 물질이 연구되었지만, ECM13의조성물을 종합적으로 재구성하기는 어렵다. ECM 유래 하이드로겔을 사용하는 장점은 ECM이 특정 조직에 필요한 단백질 및 성장 인자를 함유한다는 점입니다(14,15). 요추 절제술 동안 정상 조직의 조사는 ECM에 중요한 변화를 일으키고, ECM 유래 하이드로겔은 시험관내에서 이 효과를 연구하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 질병의 더 복잡하고 정확한 시험관 내 모델로 이어질 수 있습니다.
본 연구에서, 우리는 유방 유방 지방 패드 (MFPs)를 방사선 엑보에 실시하였다. MFPs를 탈세포화하고 프리겔 용액으로 만들었습니다. 하이드로겔은 내장된 4T1 세포, 뮤린 TNBC 세포주로 형성되었다. 하이드로겔 물질의 유변학적 특성을 조사하고, 종양 세포 역학을 하이드로겔 내에서 평가하였다. 조사된 MF에서 제조된 하이드로겔은 종양 세포 증식을 강화시켰다. 미래 연구 결과는 치료 다음 암 재발의 맥락에서 세포 세포 상호 작용을 공부하기 위하여 그밖 세포 모형을 통합할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>10% 중성 완충 포르말린, 마개가 있는 큐브</td><td>VWR</td><td>16004-128-2-methylbutane</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Alfa Aesar</td><td>19387-AR</td><td></td></tr> <tr><td>2000ex 유변계</td><td>TA Instruments</td><td>10D4335</td><td>레오미터</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A1933-25G</td><td>-</td></tr><tr><td>칼세인 아세톡시메틸(칼세인 AM)</td><td>Molecular Probes, Inc.</td><td>C1430-D-Luciferin</td><td></td></tr> <tr><td>반딧불이, 칼륨 염</td><td>Biosynth 화학 & 생물학</td><td>L-8820</td><td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt</td></tr><tr><td>DPX Mountant for Histology</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522-500ML-Dulbecco's</td><td></td></tr> <tr><td>phosphate-buffered saline</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>14040133-Eosin-Y with Phloxine</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>71304</td><td>eosin</td></tr><tr><td>ethidium homodimer</td><td>분자 프로브, Inc.</td><td>E1169</td><td>에티듐 호모디머-1 (EthD-1)</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>시그마-알드리치</td><td>F0926-500ML-Fisher</td><td></td></tr> <tr><td>Healthcare Tissue-Plus O.C.T. 화합물</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>저온 유지 물질 임베딩 배지</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>수성 기반 장착 매체</td></tr><tr><td>FreeZone 4.5</td><td>Labconco</td><td>7751020</td><td>동결 건조기</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 용액 (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>청색 형광 염료</td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML-IVIS</td><td></td></tr> <tr><td>Lumina III</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td>생물 발광 이미징 시스템</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td></td><td>섬세한 작업용 물티슈</td></tr><tr><td>n-프로판올(과산화물 무함유/염기서열분석), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1130-500-Oil</td><td></td></tr> <tr><td>Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol</td></tr><tr><td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td>CG-08-02-PBS</td><td></td></tr> <tr><td>(10X), pH 7.4</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>119-069-151</td><td>인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>-</td></tr><tr><td>돼지 위 점막의 펩신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6887-5G</td><td>펩신</td></tr><tr><td>과아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>77240-100ML</td><td>-</td></tr><tr><td>팔로이딘-iFluor 594 시약(ab176757)</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>팔로이딘 접합체</td></tr><tr><td>프로필렌 글리콜</td><td>시그마-알드리치</td><td>W294004-1KG-K-Richard-Allan</td><td></td></tr> <tr><td>Scientific 시그니처 시리즈 블루잉 시약</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7301L</td><td>블루잉제</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific 시그니처 시리즈 Hematoxylin 7211</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7211-RPMI</td><td></td></tr> <tr><td>Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093-Sodium</td><td></td></tr> <tr><td>deoxycholate, 98%</td><td>프론티어 사이언티픽</td><td>JK559522</td><td>데옥시콜산</td></tr>, <tr><td>수크로오스</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>S5016</td><td>-</td></tr><tr><td>트리톤, x-100</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>X100-100ML</td><td>t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올</td></tr><tr><td>, 트립신-EDTA(0.25%), 페놀, 레드</td><td>, Gibco</td><td>25200-056-Whatman</td><td></td></tr> <tr><td>정성 여과지, 4등급</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>4등급 질적 여과지</td></tr><tr><td>자일렌(ACS 인증), 피셔 케미</td><td>컬 피셔 사이언티픽</td><td>X5-4</td><td>-</td></tr></tbody></table>

세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

방사선은 삼중 음성 유방암환자를 위한 치료법입니다. 건강한 유방 조직의 세포 외 매트릭스 (ECM)에 대한 방사선의 효과와 1 차종양 부위에서의 국소 재발에 대한 역할은 알려지지 않았습니다. 여기서 우리는 뮤린 유방 지방 패드에서 유래한 ECM 하이드로겔의 탈세포화, 투식, 제조방법을 제시한다. 결과는 탈세포화 과정의 효과에 제시되고, 유변학적 파라미터를 평가되었다. 하이드로겔에 캡슐화된 GFP- 및 루시퍼라제 표지 유방암 세포는 조사된 하이드로겔의 증식증가를 입증하였다. 마지막으로, 남근 컨쥬게이트 염색은 캡슐화된 종양 세포의 세포골격 조직을 시각화하기 위해 사용되었다. 우리의 목표는 종양 세포 행동을 연구하기 위하여 생체 내 유방 조직 환경 및 방사선에 그것의 반응을 모방하는 생체외 연구를 위한 하이드로겔을 제조하는 방법을 제시하는 것입니다.

MFPs는 도 1A에도시된 절차를 사용하여 조사 후 탈세포화되었다. MFPs 전 세포화(그림 1B)및 세포 후 탈세포화 (그림1C)가도시됩니다. 탈세포화는 헤마톡실린 및 에오신(H&amp;E) 염색을 사용하여 확인되었고, 1-[4-(자일릴라조)-아조]-2-나프톨 염색을 사용하여 지질 함량을 평가하는데 사용하였다(도 2). ECM 하이드로겔의 유변학적 특성도 37°C에서평가하였다(도 3). 저장 계수는 모든 조건에 대한 손실 계수보다 높았으며, 안정적인 하이드로겔 형성을 입증했다.
GFP- 및 루시퍼라제 표지된 4T1 유방 암종 세포를 하이드로겔에 캡슐화하였다. 세포 증식은 형광 현미경, 생물 발광 측정 및 캡슐화 ...

이 프로토콜은 생체 조사 후 뮤린 유방 지방 패드의 탈세포화 및 후속 하이드로겔 형성방법을 제시한다.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

이 프로토콜은 방사선이 뮤린 유방 지방 패드에 있는 지방 조직의 세포외 매트릭스 속성에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 탈세포화 모델에 방사선의 추가는 이전에 수행되지 않았습니다. 이 기술은 각각 탈세포화 공정에서 고유한 화학 적 목적을 제공하는 여러 세척 단계를 사용합니다.이 기술의 특이성은 조직 특성을 더 잘 보존하기 위해 부드러운 화학 적 세서히를 허용합니다. 유방암 재발은 특히 삼중 음성 케이스에서, 치료 다음 에서 생깁니다. 조사된 세포외 매트릭스가 종양 세포 거동을 어떻게 변화시키는지 평가하는 것은 재발 메커니즘에 대한 중요한 발견으로 이어질 것입니다.견본을 조사한 후에, 세슘 근원을 사용하여, 조사된 MFP의 및 완전한 RPMI 매체를 생물 안전 캐비닛으로 전송합니다. MFP를 잠수하기에 충분한 미디어로 6센티미터 또는 10센티미터의 요리를 채웁니다. 2일 동안 이산화탄소 5%를 기록하며 섭씨 37도에서 배양합니다.먼저, 트립신-EDTA 솔루션 5밀리리터와 함께 MFP의 6센티미터 요리에 배치합니다. 스프레이와 70%에탄올로 접시를 닦고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 0.7 밀리리터 스트레이너를 사용하여 조직에 물을 세 번 부어 분화물로 MFP의 물을 씻으세요.집게를 사용하여 세차 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오. 다음으로, 섬세한 작업 닦아에 조직을 간단히 말리고 무게를 측정합니다. 말린 조직을 적절한 크기의 교반 바를 포함하는 사전 오토클레이브 비커에 넣고 조직의 그램당 3%t-octylphenoxypolyethoxyethanol의 60 밀리리터로 조직을 덮습니다.실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 그런 다음 비커의 내용을 여과기에 덤프합니다. 비커를 탈온화된 물로 헹구고 조직에 부어 넣습니다.이 헹기 과정을 두 번 더 반복하여 집게를 사용하여 헹도 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오. 그 후, 섬세한 작업 닦아 무게에 조직을 간단히 건조. 조직과 교반 바를 같은 비커에 다시 넣고 조직 그램당 4%의 데옥시콜산 60밀리리터로 덮습니다.실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 다음으로 비커의 내용을 메쉬 스트레이너에 버리고 비커를 탈온화된 물로 헹구고 조직에 부어 넣습니다. 이 헹기 과정을 두 번 더 반복하여 집게를 사용하여 헹도 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.간략하게 섬세한 작업 닦아에 헹구는 조직을 건조하고 무게. 말린 조직을 같은 비커에 넣고 신선한 탈이온된 물과 함께 1%페니실린-연쇄 절제술을 보충합니다. 비커를 파라핀 필름으로 단단히 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 둡니다.다음 날 비커 내용물을 여조로 배출하고, 섬세한 작업 닦아에 조직을 간단히 말리고 무게를 측정합니다. 그런 다음 MFP를 동일한 비커에 적절한 크기의 스터드 바에 배치합니다. 조직의 그램당 4%에탄올과 0.1%의 peracetic산을 함유한 용액의 60밀리리터로 조직을 덮습니다.실온에서 2시간 동안 저어줍니다. 비커의 내용을 0.7mm 여조로 덤프합니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하고 내용물들을 비커에 다시 넣습니다.조직을 1그램당 1X PBS 60밀리리터로 덮어 조직을 씻으시면 됩니다. 실온에서 15분간 저어줍니다. 이 전체 세탁 과정을 한 번 더 반복하십시오.다음으로 비커의 내용을 0.7mm 스트레이너로 덤프합니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하고 내용내용을 비커에 다시 넣습니다. 조직을 1그램당 60밀리리터의 탈온수로 덮어 조직을 씻으시면 됩니다.실온에서 15분간 저어줍니다. 이 전체 세탁 과정을 한 번 더 반복하십시오. 세척된 조직을 섬세한 작업 닦아내고 무게를 닦으십시오.조직과 내용기를 여조기에 버리고 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 내용자를 비커에 다시 넣고 조직 1그램당 100%n-propanol의 60 밀리리터로 조직을 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.그런 다음, 섬세한 작업 닦아에 조직을 간단히 건조하고 무게를. 조직과 내용기를 0.7mm 여조로 덤프하고 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 내용물을 비커에 다시 넣고 조직 1그램당 60밀리리터의 탈온화된 물로 덮어 조직을 씻으시다.실온에서 15분간 저어줍니다. 이 세척 과정을 세 번 반복하십시오. 그 후, 섬세한 작업 닦아에 조직을 간단히 말리고 무게를 측정합니다.표시 된 15 밀리 리터 튜브에 조직을 전송 하 고 부정적인에서 동결 80 섭씨 하룻밤. 첫째, 액체 질소로 얕은 용기를 채웁니다. 냉동고에서 샘플을 제거하고 각 lyophilized MFP의 무게를 측정합니다.박격포에 1개의 샘플을 놓고 극저온 장갑을 사용하여 박격포를 액체 질소에 고정시하십시오. 그런 다음, 휴대용 드릴에 부착된 유봉을 사용하여 샘플을 밀링합니다. 1분 간격으로 밀어 진행 상황을 확인하고 액체 질소에서 장갑을 낀 손을 제거합니다.모든 샘플에 대해 이 밀링 공정을 반복하여 각 샘플 사이에 에탄올로 박격포와 유봉을 분무하고 닦아주세요. 가루 샘플을 15 밀리리터 튜브에 음수 섭씨 80도에 보관하여 사용할 준비가 될 때까지 보관하십시오. 먼저 냉동실에서 샘플을 제거하고 실온에서 해동합니다.시료가 해동되는 동안 펩신을 염산에 섞어 펩신-HCL 용액을 형성한다. 다음으로, 샘플 파우더와 펩신-HCL 용액을 15 밀리리터 튜브에 넣고 작은 교반바를 넣고 48시간 동안 저어줍니다. 그 후 튜브를 얼음 위에 5분간 놓습니다.최종 용액이 1X PBS의 농도를 가지도록 각 샘플에 10X PBS를 추가합니다. 그런 다음 각 솔루션에 10%의 부피/부피, 0.1 어금다 수산화나트륨을 추가하여 pH 7.4에 도달하여 pH 용지를 사용하여 각 솔루션을 개별적으로 테스트합니다. pH 7.4 젤 용액을 사용하여, 겔 용액의 밀리리터 당 500, 000 또는 1, 000, 000 세포의 농도로 4T1 세포로 표지된 펠릿 GFP 및 루시파라제(luciferase)를 재연한다.16웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 젤 셀 용액 16 마이크로리터를 추가하고 30 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그 후 각 웰에 100마이크로리터의 완전한 RPMI 미디어를 추가합니다. 48시간 동안 섭씨 37도에서 계속 배양하십시오.이어서, 형광 현미경을 사용하여 519 나노미터의 발산 파장 및 618 나노미터의 방출 파장에서 세포를 관찰한다. 이 연구에서는 세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상적인 조직 방사선 효과가 연구됩니다. 헤마톡시린과 에신 염색은 핵과 DNA의 다른 흔적의 손실을 통해 탈세포화를 확인하는 데 사용됩니다.오일 레드 O 염색은 지질 함량을 평가하고 디파사이트 형태의 보존을 확인하는 데 사용됩니다. ECM 하이드로겔의 유변학적 특성은 섭씨 37도에서 평가됩니다. 스토리지 계수는 모든 조건에 대한 손실 계수보다 높으며 안정적인 하이드로겔 형성을 보여줍니다.GFP 및 루시파라제는 4T1 유방 암종 세포로 표지된 다음 하이드로겔에 캡슐화됩니다. 세포 증식은 형광 현미경 검사, 조명 측정 및 생존 성 염색에 의해, 캡슐화 후 48 시간 검사됩니다. 조사된 하이드로겔은 종양 세포 증식의 증가 추세를 보여줍니다.Phalloidin 공주게이트는 캡슐화된 세포에서 F-Actin을 시각화하는 데 사용됩니다. 공장 내부에 조직을 배치하기 전에 박격포를 냉각하는 것을 기억, 따뜻한 박격포는 불완전 한 밀링으로 이어질 수 있습니다. n-프로판 및 펩신을 취급할 때주의하십시오, 화학 후드의 밑에 n-propanal 및 그밖 탈세포제 만 열립니다.가능하면 흡입위험이 있기 때문에 화학 후드 아래에 펩신을 계량합니다. 조사 및 탈세포화 후 ECM 조성변화는 질량 분광법 및 라만 분광법을 사용하여 평가될 수 있다. 또한, ECM 하이드로겔의 섬유 구조는 전자 현미경을 스캔하여 분석될 수 있다.이 방법은 종양 세포뿐만 아니라 면역 세포뿐만 아니라 치료의 결과로 방사선 손상을 경험하는 조직에 대한 방사선의 효과를 검사하기 위해 확장 될 가능성이 있습니다. 이 탈세포화 기술은 연구원이 대부분의 암에 있는 중요한 처리 선택권인 방사선 다음 조직의 세포외 매트릭스 속성을 평가하는 것을 허용할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델...

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

이 비디오는 체외 연구를 위해 생체 외 방사선 조사 후 쥐 유방 지방 패드를 탈세포화하여 세포외 기질 하이드로겔을 유도하는 기술을 설명합니다. 이 하이드로겔은 방사선 치료 후 생체 내 유방 조직 환경을 모방하여 종양 세포의 행동을 연구하는 데 도움이 됩니다.

Decellularizing Mammary Fat Pads: Mammary Fat Pads에서 세포외 기질 하이드로겔 도출

이 비디오는 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포외 기질(ECM) 강성의 영향을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 콜라겐이 중첩된 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 생리학적 ECM의 강성을 모방하기 위해 멀티웰 플레이트에 층을 이룹니다. 하이드로겔에 인간 내피 세포를 오버레이하고 세포 내 형광 단백질을 발현하도록 조작된 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아로 세포를 감염시킨 후, 유세포 분석을 사용하여 더 단단한 하이드로겔에 존재하는 세포와 더 부드러운 하이드로겔에 존재하는 세포의 내재화된 박테리아를 비교합니다.

세포외 기질 강성이 박테리아 감염에 미치는 영향을 연구하기 위한 분석

입자 추적 microrheology은 비파괴 정량 및 공간적 차원 종양 모델에서 세포 외 기질 (extracellular matrix) 기계적 성질의 변화를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

본 프로토콜은 맞춤형 UV 조명 장치를 사용하여 3D 매트릭스-모방 배양물에서 환자 유래 교모세포종 세포의 화학요법 반응에 대한 기계적 및 생화학적 단서의 영향을 평가하기 위한 실험 플랫폼을 기술하며, 조정 가능한 기계적 특징을 갖는 하이드로젤의 고처리량 광가교를 용이하게 한다.

하이드로겔 어레이는 3D 종양 모델에서 매트릭스 성분 및 치료제의 스크리닝 효과를 위한 처리량 증가를 가능하게 합니다.

여기에서는 종양 스페로이드를 빠르고 강력하며 저렴하게 제조한 후 하이드로겔 캡슐화를 수행할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 특수 장비가 필요하지 않기 때문에 널리 적용 가능합니다. 스페로이드 매트릭스 상호 작용을 탐색하고 체외 조직 생리학 또는 병리학 모델을 구축하는 데 특히 유용할 것입니다.

스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화

이 프로토콜은 토착 소 폐 조직에 적용되는 두 가지 뚜렷한 탈세포화 방법론을 설명하여 각각의 특성화에 대한 포괄적인 설명을 제공합니다.

탈세포화된 폐 세포외 기질 하이드로겔의 개발 및 특성 분석

배우세요 세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과를 연구하는 방법을. 쥐 유방 지방 패드의 탈세포화와 하이드로겔 형성 기술을 통해 방사선이 세포외 매트릭스 특성에 미치는 영향을 분석하고 암 재발 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구

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