Name: 신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 학습하세요 인간 다능성 줄기세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅 방법을 통해 신경돌기와 시냅스 성숙을 고함량 스크리닝으로 분석하는 기술을. 프로테아제 처리 시간 연장이 세포 생존율을 향상시킵니다.

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이 작품은 정신 질환을 연구하기 위해 국립 협동 세포 연구 그룹 (NCRCRG)의 구성 요소이며 NIH 보조금 U19MH1 2015-0644에 의해 지원되었다. 초기 작업은 또한 NIH 교부금 NS070297에 의해 지원되었다. 우리는 박사 캐롤 마르케토와 프레드 게이지, 신경 전구 세포의 WT 126 라인을 제공, 박사 유진 여와 로렌스 골드스타인, UC 샌디에고 신경 전구 세포의 CVB WT24 라인을 제공에 대한 감사드립니다. 우리는 박사 앤 방의 실험실에서 데보라 프리 감사합니다, 샌포드 번햄 프리디스 의료 발견 연구소, 유용한 토론.

1. 보충 이전의 차별화 기간
<ol><li>10cm 접시에 뉴런을 분화하고, 선택7,8의 프로토콜을 사용하여 뉴런이 그들의 프로세스와 두꺼운 네트워크를 형성하고 MAP2 또는 TuJ1과 같은 초기 뉴런 마커뿐만 아니라 NeuN과 같은 후기 마커를 표현할 때까지.</li>
	<li>
신경 분화 과정 동안 4일마다 선택의 절반 의 배지를 변경합니다. 참고 : 더 광범위하거나 빈번한 매체 변화는 필수 영양 요인을 희석하고 성숙을 불리하게 할 수 있습니다.<ol>
<li>iPSC 유래 WT126 뉴런의 경우, 다음 분화 후 배양 배지 사용: 5 mL 100x N2 보충제, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL 라미닌, 200 μM 아스코르브산, 1 μM 디부티릴-cAMP 및 10 mL SM1 에 대한 500 mL Dulbec의 변형 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12). 점차적으로, 반 배지 변화를 사용 하 여신경 기저 매체 (재료표)와 동일한 보충제로 대체 하십시오.</li>
		<li>iPSC 유래 CVB WT 뉴런의 경우, 다음의 분화 후 배양 배지를 사용하십시오: 500 mL 신경 기저 A 배지 (재료표)및 500 mL DMEM/F12 배지와 2 μg/mL 라미닌, 10 mL 글루타민 보충제 (재료표), 0.75 mg/mL 중탄산나트륨, 5 mL 최소 필수 배지(MEM) 비필수 아미노산, 0.2 mM 아스코르브산, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27, 10 mL 100x N2 보충제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 코팅 멀티웰
<ol><li>전날, 폴리-L-오르니틴(PLO)으로 코팅하십시오. 재고 용액 (10 mg / mL)을 만들기 위해 멸균 물에 PLO를 용해. 이 스톡은 -20 °C에 보관하십시오. 플라스틱 코팅 시 PLO 1:100을 물로 희석하여 유리코팅 시 50 μg/mL의 농도를, 1:1,000 비율(10 μg/mL)의 농도를 생성합니다.</li>
	<li>코팅을 대상 플레이트에 직접 바하십시오. 플레이트 크기에 적합한 코팅의 부피를 사용하십시오(즉, 24웰 플레이트의 경우 웰당 500 μL의 PLO 용액을 적용).</li>
	<li>접시가 실온에서 하룻밤 동안 어두운 색에 앉을 수 있도록 하십시오.</li>
	<li>시료 류의 날에 코팅 된 접시를 회수하고 멸균 생물 안전 성 캐비닛으로 옮니다.</li>
	<li>PLO 용액을 흡인하고 멸균수로 두 번 헹구세요.</li>
	<li>1:400 희석에서 인산완충식염수(PBS)에 라미닌(1.15 mg/mL)을 희석합니다. 참고: 4 °C에서 라미닌을 해동하고 신속하게 라미닌과 고르지 않은 코팅의 응집을 방지하기 위해 PBS에 추가합니다.</li>
	<li>멸균수를 흡인하고 이전에 PLO로 코팅 된 우물에 500 μL의 라미닌 코팅을 적용합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 최소 4-6시간 동안 유리 표면에 대해 최대 16시간 의 긴 배양을 사용하십시오. 일관된 배양 시간을 사용합니다.</li>
</ol>3. 차별화된 뉴런 을 보충
<ol><li>PBS로 분화 뉴런의 플레이트를 한 번 부드럽게 헹구십시오. PBS를 플레이트 의 벽아래로 부드럽게 분산시키고 세포에 직접 직접 가지 말고 방해하지 않도록 하십시오.</li>
	<li>부드럽게 PBS를 흡인, 직접 세포를 만지지 않도록조심하지만 연구원을 향해 팁동안 접시의 가장자리에서 흡인.</li>
	<li>10cm 플레이트당 최소 1 mL의프로테올리산 효소(재료 표)를 바르고 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 조직 배양실이 낮은 습도로 인해 높은 증발속도를 보이는 경우 약간 더 높은 부피를 첨가한다.</li>
	<li>판에서 그(것)들을 분리하고 신경 네트워크 내의 그밖 신경에서 그(것)들을 분리하기 위하여 40-45 분 동안 proteolytic 효소로 세포를 배양합니다. 참고: 이 단계의 타이밍은 매우 중요합니다. 프로테아제를 너무 일찍 담금질하면 보충 후 세포 사멸이 증가할 수 있습니다. 프로테오리액 효소 제조업체는 37°C보다 훨씬 낮은 온도를 세포주 통과(예: 4°C에서 하룻밤)에 대한 더 긴 잠복기와 함께 사용할 것을 권장합니다. 그러나, 4 °C에서 신경 을 취급 하는 것은 피해 야 한다, 그들은 종종 차가운 노출 후 가난한 생존을 보여. 제조자는 또한 37°C에서 효소를 가진 60 분 배양이 효소 불활성화로 이끌어 낸다는 것을 명시합니다. 그러나, 저자의 경험에서, 37°C에서 hiPSC 유래 뉴런 배양의 40-45분 배양은 반응시 효율적인 해리 및 우수한 뉴런 생존에 충분하다.</li>
	<li>인큐베이션 시간 동안 상 대비 현미경으로 뉴런을 확인하고 신경망이 플레이트에서 완전히 분리되고 아래 판을 잠깐 흔들면 작은 시트에서 분리되기 시작할 때까지 프로테아제 치료가 계속될 수 있습니다. 현미경.</li>
	<li>10 cm 플레이트에서 프로테아제 1mL당 5 mL의 신선한 DMEM 미디어를 사용하여 프로테아제 활성을 담금질하여 소화를 중지합니다. 혈청학적 파이펫을 사용하여 네트워크를 방해하기 위해 플레이트에 대해 5-8 회 부드럽게 삼중 화합니다. 차별화된 뉴런이 취약하기 때문에 삼중화 시 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의하십시오. 끝이 너무 날카롭고 좁기 때문에 P1000 팁을 사용하지 마십시오.</li>
	<li>100 μm 직경의 메쉬가 있는 셀 스트레이너를 통해 세포로 용액을 신선한 50 mL 원점 튜브 드롭에 한 방울씩 바릅니다.</li>
	<li>세포가 여과된 후 신선한 DMEM 매질 5mL를 추가로 헹구는 스트레이너.</li>
	<li>벤치탑 원심분리기의 스핀 셀을 1,000 x g에서 5분 동안 회전시다.</li>
	<li>원유관을 생체 안전 성 캐비닛으로 되돌려 서 대부분의 매체를 흡인하여 세포가 수분을 유지하도록 약 250 μL을 남깁니다.</li>
	<li>신선한 DMEM 매체 2mL에서 세포를 부드럽게 다시 일시 중단합니다. 튜브 측면에 펠릿을 피펫하지 마십시오. 대신, 원추형 2-3회 부드럽게 반전하고 5 mL 의 혈청학적 파이펫 끝을 통해 세포를 통과하여 빼냅니다.</li>
	<li>10 μL의 재중단 된 뉴런을 혈세포계의 가장자리에 적용하십시오.</li>
	<li>이 재서스펜션 단계 도중 세포 생존가능성을 평가하기 위하여 세포의 방울에 트리판 블루의 8-10 μL를 추가하십시오. 이 혼합물의 10 μL을 혈전계 또는 기타 자동 세포 카운터에 적용하십시오. 단계 밝은 그 세포를 실행 가능한 평가 하 고 trypan 블루 염료를 제외.</li>
	<li>생존 세포 /mL의 양을 결정하고 원하는 세포 밀도에 따라 원점 튜브의 내용을 희석 할 준비를하십시오.</li>
	<li>플레이트 ~10,000 웰 당 384 웰 플레이트; 플레이트 ~ 150,000-200,000 세포 24 웰 플레이트에 대한 웰 당.</li>
	<li>적절한 희석을 달성하기 위해 재 중단 된 세포의 원추형 튜브에 신선한 DMEM을 추가하고 특정 세포주 요구 사항에 따라 B27 및 / 또는 BDNF와 같은 추가 적절한 보충제를 추가하십시오.</li>
	<li>원유튜브를 부드럽게 기울여 2-3회 섞습니다.</li>
	<li>24 웰 플레이트에서 래미닌 코팅, 또는 PBS로 16 채널 파이펫을 사용하여 384 웰 멀티 웰 플레이트에서 한 번 헹구는 다중 웰 플레이트.</li>
	<li>24웰 플레이트에 대한 P1000, 또는 384웰 플레이트용 16채널 파이펫을 사용하여 PBS를 흡인한다.</li>
	<li>응집을 피하기 위해 그림 8 모션에서 각 잘 셀 솔루션을 적용합니다. 자동 액체 처리 장치를 사용하여 도금 균일성을 최적화할 수도 있습니다. 참고: 2-4일 후부터 매질에 라미닌을 첨가하면 세포의 균질한 분포를 유지하는 데도 도움이 된다.</li>
	<li>각 웰에 대해 3.19 단계와 3.20 단계를 반복합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C 및 5% CO2로 설정된인큐베이터로 되돌려 놓는다.</li>
	<li>2일 후, 섹션 1.2에 기재된 분화 후 배양 배지를 사용하여 4일마다 배지의 절반을 변경하기 시작한다. 원하는 성숙 시간 후, 실험 요건에 따라 37°C에서 3.7% 포름알데히드를 사용하여 배양을 수정하고 얼룩 세포를 염색한다.</li>
</ol>4. 세포 생존 성 시험 사후 보충
<ol><li>스톡 용액을 간략하게 소용돌이치게 한 후 초기 세포 사멸 리포터(VivaFix: 50 μL 스톡 용액당 50μL 배양 배지당 0.5 μL)를 추가했다.</li>
	<li>유리 바닥 멀티웰에서 배양된 살아있는 세포와 죽은 세포를 20분 후에 세척 단계 없이, 세포 내부에 한 번만 염색하기 때문에, 또는 이미징 전에 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및/또는 기타 항체로 염색 및 공동 얼룩을 고치고 공초점 현미경을 사용하여.</li>
</ol>5. 면역 염색
<ol><li>37°C에서 20분 동안 PBS에 포름알데히드를 더한 120 mM 자당으로 배양액을 수정합니다.</li>
	<li>실온에서 5분 동안 0.2% 트리톤 X-100으로 헹구고 투과한 다음, 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 30분 동안 차단합니다.</li>
	<li>토끼 항 MAP2 항체 1:1,000, 마우스 항β3 튜불린(TuJ1) 항체 1:2,000, 닭항-NeuN 항체(1:100) 및 랫트 항-CTIP2 항체(1:500), 또는 마우스 항체를 사용하여 실온에서 1시간 동안 헹구지 않고 BSA를 흡인합니다. 1:200), 토끼 항시냅신 1(1:200) 및 시냅스 염색을 위한 닭 안티 MAP2 항체.</li>
	<li>PBS로 헹구고, 37°C에서 45분 동안 알렉사 플루오르-컨쥬게이트 이차 항체와 DAPI로 배양한다.</li>
	<li>마지막으로, 이미징 전에 PBS로 두 번 씻으하십시오.</li>
</ol>6. 칼슘 이미징
<ol><li>AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (살크 생물학 연구소, GT3 핵심 시설)로 배양 된 세포를 10 일 후 보충 및 이미지로 감염하여 3-4 주 후 보충에서 자발적인 칼슘 과도 상태를 평가합니다.</li>
</ol>7. 이미지 수집 및 분석
참고: 취득 시스템에 대한 자세한 내용은 칼라브레스 외12를참조하십시오.
<ol><li>수동 또는 자동 이미지 수집을 위해 이미징 모듈을 사용하고, 형태 측정을 위해 CellProfiler13과같은 이미지 분석 소프트웨어 모듈을 사용합니다.</li>
	<li>동일한 필드 내의 뉴런(DAPI + MAP2 또는 TuJ1 양성 세포)으로 나눈 시야당 총 길이를 측정하여 TuJ1 양성 신경과 MAP2 양성 모수석의 평균 길이를 계산합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 높은 콘텐츠 스크리닝 플랫폼과 호환되는 방식으로 생존, 분화 성공 및 세포 외 이미징을 최적화하는 인간 신경 배양물의 재중단 및 보충을 위한 정직한 절차를 입증했습니다. 및 약물 발견과 관련된 기타 검사. 그림 6은 이러한 응용 프로그램의 전반적인 워크플로우 및 예제를 보여 줍니다.
여기서 우리는 피질 뉴런 운명을 향한 hiPSC 파생 뉴런에 초점을 맞추고 있지만,이 방법은 인간 배아 줄기 세포 유래 뉴런에 동등하게 적용되어야하며, 줄기 세포 유래 뉴런은 다른 뉴런을 향하게할 것으로 예상됩니다. 신경 표현형14,15,16,17,18...

인간 만능 줄기 세포 (hiPSC) 유래 뉴런은 기초 연구, 약물 개발 및 재생 의학 분야에서 점점 더 관련이 있습니다. 워크플로우 및 프로시저들은 그들의 배양 및 유지관리를 최적화하고, 특정 뉴런 아류형으로의 분화효율을 향상시키고, 급속히 진화하고 있다1,2. 모델 시스템으로서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 유용성과 비용 효율성을 향상시키기 위해 약물 발견 및 표적 검증에서 고함량 분석을 수행할 수 있으며, 성숙하고 기능적인 뉴런을 생성하는 데 필요한 배양 시간을 줄이는 것이 유용하다. 최대 견고성, 재현성 및 표현형 관련성을 유지하면서 뉴런을 유지합니다. 3차원 오르가노이드 배양이 신경 발달 연구3에서돌파구를 주도하고 있지만, 2차원 단층 문화는 최소한의 조직 두께로 인해 자동화된 이미징 기반 응용 분야와 특히 호환됩니다.
그러나, 인간 신경및 신경 발달 질병의 모형에 화상 진찰 기지를 둔 검열 방법의 적응은 중요한 도전에 직면합니다. 인간 신경계가 생체 내에서 성숙하는 연장된 기간은 유전자 발현의 자연적인 프로그램을 수용하고 신경 성숙을 달성하기 위해 문화에서 연장 된 시간을 필요로합니다.
긴 신경 분화 프로그램의 한 가지 실질적인 결과는 hiPSC 유래 단층 배양의 유지가 적절한 시냅스 성숙을 달성하기 위해 몇 주 동안 지속되어야한다는 것입니다. 이 시간 동안, 미분화 남아 있는 신경 선조는 분열을 계속합니다. 이들은 신속 하 게 문화를 성장 하 고 실행 가능한 postmitotic 신경 세포를 유지 하는 데 필요한 영양소 콘텐츠를 usurp 수 있습니다. 신경 전구 세포 (NPC)를 적극적으로 분할하는 것은 또한 성장 기판에 대한 뉴런과 경쟁 할 수 있습니다. 이것은 나쁜 접착의 문제, 화상 진찰 기지를 둔 비검사에 적합하지 않은 조건에 그 같은 문화를 렌더링할 수 있습니다. 더욱이, 많은 연구자들은 배양량이 작을수록, 신경분화의 후기 단계를 관찰할 수 있을 만큼 충분히 긴 분화 뉴런의 건강한 집단을 유지하는 데 더 큰 어려움이 있다는 것을 발견한다. 즉, 고함량 스크리닝(HCS) 접근법을 이용한 시냅스 성숙의 어설션은 인간 유래 뉴런에 대해 매우 어려울 수 있다.
이러한 문제 중 일부를 우회하기 위해 이전에 차별화된 hiPSC 유래 뉴런을 다시 일시 중단하고 보충하는 절차가 사용되었습니다. 첫째, 그것은 완전히 헌신 된 뉴런의 인구에서 neurite 파생 (또는 더 정확하게는 neurite 재생)에 대한 연구를 허용합니다. 둘째, 이전에 분화된 뉴런을 대용량(예: 10cm 플레이트 이상)에서 작은 볼륨 형식(예: HCS 호환 96- 또는 384웰 마이크로티터 플레이트)까지 재구성하면 총 배양 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 볼륨 조건이 작습니다. 이것은 시험관내에서 후속 주에 걸쳐 시냅스 조립 및 성숙의 연구를 용이하게한다.
그러나, 이미 긴 neurites및 복잡한 연결 네트워크를 설치한 성숙한 뉴런의 replating는 몇몇 도전을 제출합니다, 그 중 하나는 때때로 높고 가변적인 세포 사멸의 비율입니다. 여기에서, 우리는 우수한 세포 생존 및 재현성 귀착되는 보충 절차를 기술합니다. 일반적으로, 뉴런은 짧은 잠복기 (전형적으로 ~ 3-10 분) 삼조 전에 기질에서 세포를 분리하기 위해 proteolytic 효소에 노출됩니다. 이 짧은 proteolysis 시간은 관례적으로 비 신경 세포 및 미분화 선조4,5,6을포함하여 분할 세포의 많은 모형을 중단하고 통과시키기 위해 이용됩니다. 그러나, 길고 상호 연결된 신경염을 가진 분화한 뉴런의 경우, 기판에서 세포를 분리하는 것뿐만 아니라 손상을 최소화하면서 개별 세포를 격리하기 위해 수지상 및 축색 네트워크를 방해하는 것이 필수적입니다. 실제로, 뉴런의 두꺼운 메쉬 워크는 일반적으로 개별 세포보다는 단일 시트로 기판에서 분리하는 경향이있다. 신경질의 두꺼운 네트워크를 느슨하게하기 위해 주의를 기울이지 않으면 뉴런은 삼중 화 중에 돌이킬 수 없을 정도로 손상될뿐만 아니라 많은 사람들이 덩어리를 제거하는 데 사용되는 필터를 통과하지 못하여 세포 수율이 떨어집니다. 아래에서 우리는 이러한 어려움에 대처하기 위해 널리 사용되는 프로테아제 배양 절차에 대한 간단한 수정을 설명합니다.
아래에 기술된 프로토콜에서, 뉴런은 프로테오용 효소(예를 들어, Accutase)와 같은 가벼운 프로테아제와 함께 40-45분 동안 배양된다. 효소를 첨가한 후 처음 5-10분 동안, 뉴런 네트워크는 시트로서 기판으로부터 들어올린다. 프로테아제와의 인큐베이션은 부드러운 삼각 및 여과로 진행하기 전에 추가로 30-40 분 동안 진행됩니다. 이 추가 배양 시간은 물질의 소화가 세포 간 네트워크를 이완시키는 것을 보장하는 데 도움이, 따라서 후속 삼조는 개별 세포의 현탁액을 생성하는 것을 보장. 이 절차는 세포 사멸을 최소화하면서 보충시 세포 분포의 균일성을 극대화합니다. 우리는 성공적으로 hiPSC 파생된 신경 배양에 이 replating 방법을 다양한 분화 프로토콜7,8 및 hiPSCs의 각종 선에서 생성된 적용했습니다. 절차는 줄기 세포 파생된 신경세포의 대부분 또는 전부와 함께 사용하기에 명목상 에 적당합니다. 우리는 확장 된 프로테아제 배양 시간이 작은 형식 의 플레이트 (예를 들어, 35mm 직경)에서 배양을 보충하는 데 절대적으로 필수적이지 않다는 것을 관찰했습니다. 그러나 여기에서 볼 수 있듯이, 이러한 플레이트의 neurites가 매우 긴 공정을 확장하고 조밀하게 상호 연결된 배열을 형성 할 수 있기 때문에 큰 직경의 플레이트 (예 : 직경 10cm 이상)에서 보충 할 때 상당한 이점을 제공합니다.
여기에서 우리는 이 방법을 설명하고 초기 신생에 대한 분석과 시냅스 성숙에 대한 분석에서 그 적용을 간략하게 설명하며, 이는 수상돌기와 축삭을 따라 전과 후의 후배 단백질을 군집화하는 것을 포함하고, 그 다음에 그들의 후에 시냅스 사이트에서 의 국소화. 이 예제에서는 이 프로토콜이 세포 생존가능성과 재현성을 보존하는 데 제공하는 이점을 강조합니다. 첫째, 그것은 인간 적인 신생에 있는 초기 단계를 공부하는 조사자가 허용합니다. 실험 설정은 설치류 피질 또는 해마 뉴런의 일반적으로 사용되는 기본 문화와 유사하며, 여기서 세포는 늦은 태아 또는 초기 산후 뇌에서 추출되고, 부드러운 프로테아제 치료 후 삼각에 의해 해리되고, 허용 신경을 시작하거나 절차9,10에서절단 된 신경 을 재생합니다. 이러한 설치류 기본 뉴런과 유사하게, hiPSC 유래 뉴런은 보충 후 몇 시간 내에 신경 세포를 형성하거나 재생하기 시작하여 적은 수의 높은 시공간 이미징에 최적 환경에서 성장 원추형 및 신경 세포형성의 이미징을 허용합니다. 미분화 세포를 둘러싸고 있습니다. 우리는 뉴런이 처음 선조 집단과 구별하기 시작할 때 볼 수있는 가변 지연 및 다른 파생 속도에 비해 neurite 의 성장은 더 동기화되는 것을 관찰했습니다. 또한, replating은 피질 층 5/6 전사 인자 CTIP2 (치킨 ovalbumin 업스트림 프로모터 전사와 같은 신경 발달에서 일반적으로 나중에 나타나는 신경 아류형 마커를 발현하는 뉴런의 분석분석서를 가능하게 합니다) 인자 상호 작용 단백질 2), 또는 범 뉴런 마커 NeuN11. 리피팅 접근법의 특히 유용한 특징은 시냅토발생이 HCS와 호환되는 시간 프레임 내에서 진행된다는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Post Replating Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>N2B27 매체 1L에 200mM 스톡 1mL 추가</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>Human BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml 최종 농도</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17504044</td> Glutamax Thermofisher Scientific 31331093를 사용하여 <td>1 L N2B27 배지</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td>에 20 mL 추가 <td></td><td></td><td>N2 추가 및 50 mL 원추형으로 분배; 파라필름 랩 뚜껑</td></tr><tr><td>Human GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050038</td><td>1 L N2B27 매체에 10 ml를 추가합니다. 글루타민 보충제</td></tr><tr><td>Mouse Laminin</td><td>Sigma</td><td>P3655-10mg</td><td>100 &micro를 추가합니다. L - 50 mL N2B27</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11140035</td><td>1 L에 5 mL 추가 N2B27 배지</td></tr><tr><td>N2 (100x) Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>5 mL - 500 mL 배지 추가</td></tr><tr><td>Neurobasal A 배지 Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>10888022</td><td>DMEM/F12와 결합하여 CVB wt 세포용 N2B27 배지 생성; 신경 기저 A 배지</td></tr><tr><td>Neurobasal 배지</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>WT126 세포용 21103049; 신경 기초 매체</td></tr><tr><td>SM1 보충제</td><td>StemCell Technologies</td><td>5711</td><td>배지에 1:50 첨가</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25080-094</td><td>1 L N2B27 배지에 10 mL 첨가</td></tr><tr><td>Plate Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 조직 배양 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772-E</td><td>플라스틱 TC 처리 접시</td></tr><tr><td>6웰 조직 배양 접시</td><td>Thomas Scientific</td><td>1194Y80</td><td>NEST 플레이트</td></tr><tr><td>마우스 Laminin</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>플라스틱에 1:400 추가</td></tr><tr><td>Poly-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655-10mg</td><td>플라스틱에 1:1,000 추가</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>희석하기 위해 Poly-L-Ornithine</td></tr><tr><td>Replating Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>Sterile, 개별 포장</td></tr>된 <tr><td>384웰 플레이트,</td><td>PLO 및 Laminin</td>DPBS Life Technologies가 포함된 코팅되지 않은 <td>PerkinElmer</td><td>6007550</td> Coat</tr><tr><td></td><td></td><td>14190144</td><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates</td><td>PerkinElmer</td><td>6057500</td><td>코팅 전 헹굼</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>1 mL/10 cm 플레이트를 30-45분 동안 적용; 단백질 분해 효소</td></tr><tr><td>Fixation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-1</td><td>PBS</td></tr><tr><td>에 용해Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-12</td> 고정액<강력>면역염색 재료<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 항-마우스</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 염소 항닭</td><td>Invitrogen</td><td>A-11041</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 염소 항닭</td> <td>10mL당 0.8 gInvitrogen</td><td>A-21449</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 561 Goat anti-rat</td><td>Invitrogen</td><td>A-11077</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>은</td></tr><tr><td>b3-tubulin (TuJ-1)에 대한 DNA 마우스 항체</td>를 시각화합니다.<td>Neuromics</td><td>MO15013</td><td>early stage neuronal marker</td></tr><tr><td>CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td>layer 5/6 cortical에 대한 Rat 항체 뉴런</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B290</td><td>초기 단계 뉴런 마커</td></tr>에 <tr><td>대한 닭 항체 NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN91</td><td>후기 뉴런 마커</td>에</tr><tr><td>대한 닭 항체 MAP2</td><td>Shelley Halpain</td>에 대한 토끼 항체 <td>N/A</td><td>초기 뉴런 마커</td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Sigma</td><td>P-246</td><td>시냅스 후 마커에 대한 마우스 항체</td></tr><tr><td>Synapsin 1</td><td>Millipore</td><td>AB1543</td><td>pre-synaptic marker</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td>에 대한 토끼 항체 (BSA)<td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30574.02</td><td>10% Titon</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Sigma</td><td>9002931</td> 투과성화Viability Markers<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivafix 차단을 위해 PBS에서 0.2%로 희석 649/660</td><td>Biorad</td><td>135-1118</td><td>세포 사멸 마커</td></tr><tr><td>칼슘 이미징</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시약명/ 장비</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트/설명</td></tr><tr><td>AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td><td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td><td>N/A</td><td>바이러스 전달 시스템의 칼슘 리포터</td></tr><tr><td>hiPSC 유래 NPC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WT 126 (Y2610)</td><td>Gage lab</td><td>N/A</td><td>Marchetto et al., 2010</td></tr><tr><td>CVB WT24</td><td>Yeo and Goldstein labs</td><td>N/A</td><td>미공개</td></tr></tbody></table>

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

인간 다능성 줄기 세포 유래 신경 전구 세포 (NPC)에서 2 차원 배양으로 분화 된 뉴런은 질병 메커니즘을 탐구하고 화합물을 심문하는 고함량 스크리닝 (HCS)을 수행하는 강력한 모델 시스템을 나타냅니다. 라이브러리 또는 유전자 돌연변이 표현형을 식별합니다. 그러나, 인간 세포와 함께 NPC에서 기능으로의 전환, 성숙한 뉴런은 몇 주가 필요합니다. 시냅스는 전형적으로 단층 배양에서 분화의 3 주 후에 형성하기 시작하고, 몇몇 신경 특이적 단백질, 예를 들면 나중에 pan-neuronal 마커 NeuN, 또는 층 5/6 대뇌 피질 신경 마커 CTIP2를 발현하는, 발현하기 시작합니다 약 4-5 주 후 차별화. 이 긴 분화 시간은 소량의 다중 웰 HCS 플랫폼에 사용되는 최적의 배양 조건과 호환되지 않을 수 있습니다. 많은 과제 중 에는 최소한의 세포 군집으로 잘 부착되고 균일하게 분포된 세포와 장기적인 생존력과 기능성 시냅스 성숙을 촉진하는 배양 절차가 필요합니다. 한 가지 접근법은 큰 볼륨 형식으로 뉴런을 분화한 다음 HCS 호환 멀티 웰의 나중 시점에서 뉴런을 재플레이트하는 것입니다. 이 보충 접근법을 사용할 때 몇몇 주요 도전은 수지상 및 축색 네트워크의 스트레스 중단 때문에 재현성 및 세포 생존을 염려합니다. 여기에서 우리는 4-8 주 동안 대용량 형식으로 분화 한 후 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 파생 뉴런을 효소적으로 재중단시키는 상세하고 신뢰할 수있는 절차를 입증하여 384 웰 마이크로 티터로 옮김합니다. 플레이트, 우수한 세포 생존과 함께 추가로 1-3 주 동안 그들을 배양. 인간 뉴런의 이 보충은 시냅스 어셈블리의 연구와 보충에서 2 주 안에 성숙의 연구를 허용할 뿐만 아니라, 또한 신경질성 재생 및 성장 콘 특성의 연구를 가능하게 합니다. 우리는 384 웰 플랫폼을 사용하여 신생 및 시냅토 발생에 대한 확장 가능한 분석의 예를 제공합니다.

여러 주 동안 차별화 된 hiPSCs 파생 된 뉴런의 replating 몇 가지 장점을 제공 합니다. 그러나, 길고 상호 연결된 모수석과 축산(그림1A)이 있는 분화된 뉴런을 분리하고 보충하면 돌이킬 수 없는 손상된 뉴런의 높은 분획을 초래할 수 있다.
프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이, 우리는 기질에서 뉴런을 분리하기 위해 프로테오리틱 효소로 배양을 사용했습니다. 전형적으로, 신경염의 그들의 두꺼운 메쉬워크 때문에 (그림1A), 세포는 수시로 우물에 떠 있는 것을 시작하는 단 하나 syncytial 같이 층으로 한 번에 모두 분리하는 경향이 있습니다 (그림1C). 이것은 상당히 빨리 일어나고, 대부분의 실험실이 선택의 그들의 pr...

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

이 프로토콜은 고함량 스크리닝 애플리케이션을 위한 인간 만능 줄기 세포 유래 뉴런의 사용을 용이하게 합니다. 그것은 특히 잘 시 냅 스를 사화에 적합, 인간의 뉴런에서 긴 문화 기간을 필요로 하는. 우리는 그들의 생존력을 보존하는 방식으로 HCS 호환 멀티 웰에 큰 형식의 요리에서 뉴런의 변환을 보여줍니다.반대로, 우리는 재중단 및 투약 수율을 재현하기 전에 프로테아제 잠복을 연장하면 뉴런 생존이 향상되어 있음을 보여줍니다. 인간 만능 줄기 세포 유래 뉴런은 기본 연구, 약물 개발 및 퇴행성 의학 분야에서 점점 더 관련이 있습니다. 이 부드러운 적정 방법은 프로세스의 두꺼운 네트워크를 갖는 세포의 큰 단층을 재일시 중단하는 데 사용할 수 있습니다.인간 iPSC 이외에, 그것은 1 차적인 뉴런의 문화를 재플레이트하거나 사실 정렬 또는 단하나 세포 순서를 위해 그(것)들을 재중단하는 것을 이용될 수 있습니다. 프로토콜 단계를 신중하게 따르고 자주 플레이트에서 뉴런의 프로테아제 매개 분리를 모니터링하는 것이 중요합니다. 최적의 잠복기 시간은 문화에 따라 다를 수 있습니다.시각적 데모를 사용하면 경험이 부족한 조사자도 이 절차를 재현할 수 있습니다. PBS로 분화 된 뉴런의 플레이트를 부드럽게 헹구는 것으로 시작합니다. 접시의 벽 아래로 PBS를 분산 하 고 그들을 방해 하지 않도록 세포에 직접 하지.접시 가장자리에서 PBS를 흡입하면서 세포를 만지지 않도록주의하십시오. 10센티미터 플레이트당 적어도 1밀리리터의 촉매 효소를 바르는다. 그리고 세포를 인큐베이터로 40~45분 동안 되돌려 보입니다.인큐베이션 도중, 단계적 대비 현미경에 뉴런을 확인하고 신경망이 완전히 접시에서 분리하고 분해하기 시작할 때까지 protease 처리를 계속합니다. 뉴런이 분리되면 프로테아제 1밀리리터당 신선한 DEMEM 미디어 5밀리리터를 추가하여 소화를 중단하십시오. 세로지학적 파이펫을 사용하여 5~8번 플레이트에 세포를 부드럽게 적시하여 너무 많은 압력을 가하지 않도록 하십시오.100 마이크로미터 메쉬를 통해 세포를 50 밀리리터 원내 튜브로 변형시켜 떨어뜨리십시오. 그리고 신선한 DMEM 미디어의 추가 5 밀리리터와 스트레이너를 헹지. 벤치 탑 원심분리기를 사용하여 5분 동안 1000배 G로 셀을 회전시합니다.원심 분리 후, 원심 관을 생물 안전 캐비닛에 반환하고 대부분의 미디어를 흡습하여 250 마이크로 리터를 남기고 세포를 촉촉하게 유지하십시오. 신선한 DMEM 매체의 2밀리리터에서 세포를 부드럽게 재연한 다음 5밀리리터 세로지피트의 끝을 통과합니다. 마지막으로 튜브를 2~3번 반전시다.헤모세포계와 삼중파를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산합니다. 그리고 원하는 농도에 DMEM. 특정 세포주 요구 사항에 따라 튜브에 적절한 보충제를 추가하고 원문 튜브를 2 ~ 3 번 기울여 세포를 부드럽게 혼합하십시오.24웰 플레이트에서 라미닌 코팅을 흡인하고 PBS로 한 번 헹구세요. PBS를 흡인합니다. 그리고 응집하지 않도록 도면 8 모션으로 각 웰에 셀 용액을 적용합니다.세포를 도금이 완료되면 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 설정된 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 초기 세포 사멸 기자의 주식 용액을 간략하게 소용돌이치며 원고 의 지시에 따라 우물에 추가하십시오. 20분 간 기다립니다.그리고 유리 바닥 멀티 웰에 라이브 및 죽은 세포를 이미지. 프로테아제 잠복을 연장하면 세포의 해제 된 시트 내에서 신경 망을 느슨하게 할 수 있습니다. 이것은 해리의 시간에 감소된 세포 죽음 결과 뿐만 아니라 다음 일 동안 더 효율적인 복구 결과.확장된 효소 인큐베이션 절차를 사용하여, 배양은 세포 생존가능성의 대략적인 두 배로 나타낸 후 며칠 동안 세포 생존력과 죽거나 죽어가는 세포의 낮은 밀도를 나타낸다. 신경 분화의 전이 단계는 세포가 점차적으로 후기 신경 마커를 표현하는 동안 며칠 에 걸쳐 일어난다. 이러한 마커는 4주 간의 사전 분화 후 보충된 배양에서 즉시 검출된다.확장된 프로테아제 프로토콜은 또한 중성구 아웃성장을 적당히 향상시킵니다. 총 중성구 길이와 수상월화 증가가 모두 개선됩니다. Replating은 시냅스를 공부하는 데에도 유용합니다.상대 화 후 불과 1 주일, 사전 및 시 냅 스 후 단백질에 대 한 마커 관찰 되었다. 더욱이, 자발적인 탈극화 및 합성 중심 전류로부터의 전기 활동은 칼슘 이미징 또는 다중 전극 어레이를 사용하여 검출할 수 있다. 이 상대화 절차는 여러 유형의 응용 프로그램에 맞게 조정할 수 있습니다.잠재적인 치료 화합물을 식별 하기 위해 높은 콘텐츠 스크리닝 이외에, 그것은 이미징 성장 콘 또는 다중 전자 배열 기록에 사용할 수 있습니다. 이미 긴 과정을 형성 한 뉴런의 기계적 해리는 스트레스입니다. 길쭉한 효소 배양과 세포의 부드러운 적정은 이 절차의 성공을 위한 필수적인 단계입니다.

post-differentiation-replating-human-pluripotent-stem-cell-derived

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 흥분성 피질 뉴런을 생성하는 방법을 보여줍니다. 독시사이클린 유도 시, hiPSC는 신경 특이적 전사 인자인 뉴로게닌-2를 과발현합니다. 특정 배지를 사용하고 성상세포와 공동 배양함으로써, 이 과정은 hiPSC가 시냅스 연결을 가진 뉴런으로 분화하는 것을 용이하게 합니다.

Differentiating human-induced pluripotent stem cells into neurons on micro-electrode arrays (인간 유도 만능 줄기세포를 마이크로 전극 어레이의 뉴런으로 분화)

이 비디오는 가벼운 단백질 분해 효소를 사용하여 인간 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 분리하고 재식하는 방법을 보여줍니다. 여과 및 원심분리 후, 뉴런은 배양을 위해 코팅된 멀티웰 플레이트에 재도금되어 부착 및 성숙을 촉진합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 유래 한 분화 된 뉴런 리플레팅

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

마우스 ES 세포를 기능적 시냅스와 창발적 네트워크 행동을 나타내는 매우 순수한 뉴런의 정의된 집단으로 구별하기 위한 사용자 정의 프로토콜이 설명됩니다. 전기생리학적 분석은 보툴리눔 신경독소 혈청형/A-/G 및 파상풍 신경독에 노출된 후 시냅스 전달의 상실을 보여줍니다.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

우리는 성숙한 올리고드로시테스로 분화하는 태아 또는 성인 신경 줄기 세포에서 유래한 성상세포및 올리고드엔드로시테 전구세포의 혼합 배양, 유해자극의 시험관내 모델링을 설명한다. 셀 기반 고함량 선별 기술과 결합은 신뢰할 수 있고 견고한 약물 선별 시스템을 구축합니다.

태아 및 성인 신경 줄기 세포의 고함량 선별 분화 및 성숙 분석- 유래 올리고드로시테 전구체 세포 배양

학습하세요 인간 다능성 줄기세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅 방법을 통해 신경돌기와 시냅스 성숙을 고함량 스크리닝으로 분석하는 기술을. 프로테아제 처리 시간 연장이 세포 생존율을 향상시킵니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

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