차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

차는 전 세계에서 가장 인기있는 음료 중 하나입니다. 살충제는 때때로 해충으로부터 차 식물을 보호하는 데 사용됩니다. 일부 전신 살충제는 티 트리의 효소에 의해 이것을 위해 만들 수 있습니다.

그리고 산화, 가수 분해 또는 환원 반응을 통해 통합됩니다. 식물 세포 현탁액 배양은 농약의 식물 대사 행동을 쉽게 연구하기 위해, 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다.

첫째, 무료 미생물의 조건에서 작동할 수 있으므로 미생물에 의한 농약 분해의 간섭을 피할 수 있다. 둘째, 언제든지 우리에게 일정한 재료를 제공 할 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 또한 단일 실험에서 농약 행동의 이론을 비교 하기 위해 쉽게 사용할 수 있습니다.

이 연구에서는 차 잎의 가변색으로부터 차 세포 현탁액 배양을 확립합니다. 세포 현탁액의 최적 배양 상태는 6 농약의 소멸 행동을 비교하기 위해 사용되었습니다. 이 실험은 자오 웨이팅과 게 구오친에 의해 수행됩니다.

이것은 우리의 차 멸균 화분은 절제의 근원으로 작동 합니다. 가위를 사용하여 멸균 잎의 중간 날개를 따라 잘라. 그리고, 페트리 접시에 약 0.3 배 0.3 센티미터의 작은 조각으로 각 절반을 세분화.

멸균 식소균을 2, 4-D 및 KT가 포함된 MS 시각적 매체에 놓습니다. 6개의 이출은 300 밀리리터 플라스크에 배치할 수 있습니다. 어둠 속에서 섭씨 25도의 일정한 온도에서 잎을 배양합니다. 28 일 후, 유도 된 callus의 첫 번째 세대를 선택한 다음 신선한 플라스크로 전송합니다.

3~4개의 하위 문화권 후에 느슨하고 가변 콜러스를 획득합니다. 멸균 조건하에서 멸균 수술 블레이드를 사용하여 고체 매체에서 가변 및 느슨한 굳은 칼을 작은 조각으로 잘라냅니다. 우리는 캘러스의 작은 조각의 약 3 그램입니다.

콜러스를 2, 4D, KT가 포함된 B5에 넣습니다. 어둠 속에서 흔들리는 인큐베이터에서 일정한 온도로 액체 세포 현탁액을 배양합니다. 7~10일 의 배양 후, 문화 플라스크를 제거하고 몇 분 동안 서 둡니다. 여기에 퇴적물으로 상체를 가지고 신선한 매체에 문화를 강제합니다.

침전된 큰 굳은 굳을 제거합니다. 각각 28일의 4~3개의 서브배양 주기 후에 최종 잘 손질된 세포 현탁액 배양을 획득한다. 생존 력 염색 하기 전에 대조구로 10 분 동안 100 섭씨에서 살아있는 세포의 샘플을 유지 합니다.

원심분리기 는 6, 000 G.에서 8분 동안 모든 세포 현탁액 배양을 제거하고 PBS 버퍼의 5 밀리리터로 세포를 일시 중단하고 손으로 1 분 동안 흔들어 전에 상신제들을 제거합니다. TTC 용액의 2.5 밀리리터를 추가하고 다시 손으로 흔들어 줍니다. 섭씨 13도에서 서있는 인큐베이터에서 1 시간 동안 혼합물을 배양하십시오.

모든 네오니코티노이드 티아메톡삼, 아세티노프리드, 이미다클로프리드, 이미데프로제스의 스톡 솔루션을 살균하기 위해 400마이크로리터의 알리쿼터를 추가합니다. 모든 유기 첫 번째 단계. 디메토이트 및 세포 현탁액 배양으로 각각 omethoate.

일정한 온도에서 살충제와 세포 현탁액의 배양 샘플, 그리고 인큐베이터 속도를 흔들어. 다른 날에 샘플을 가져 가라. 네오니코티노이드를 함유한 시료를 테스트하려면 동질세포 배양의 1 밀리리터 알리쿼트를 제거한다.

1.5 밀리리터 플라스틱 원심분리기 튜브에 넣고 원심분리기는 4, 000 G에서 2분간 배치합니다. HPLC-UV 및 UPLC QTOF에 의해 분석하기 전에 0.22 마이크로미터 필터 멤브레인을 통해 상체를 전달합니다. 샘플을 테스트하려면 유기 첫 번째 단계에서 계속하십시오.

세포 배양의 500 마이크로리터 알리쿼트를 제거하고 35 밀리리터 원심분리기 튜브 또는 1.5 밀리리터 플라스틱 원심분리기 튜브에 넣습니다. 염화 나트륨 0.1 그램과 5 밀리리터 추출물 용매를 500 마이크로리터 샘플의 35 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 1 분 동안 혼합물을 소용돌이.

그리고 10 분 동안 휴식을 취할 수 있습니다. 2.5 밀리리터의 상체를 10 밀리리터 유리 튜브에 넣고 섭씨 14도에서 질소 증발기를 사용하여 거의 건조함으로 증발하십시오. 잔류물을 1밀리리터 아세톤으로 녹입니다.

1 분 동안 소용돌이, GC-FPD에 의해 분석하기 전에 0.22 마이크로 미터 필터 멤브레인을 통과. 15 일 동안 4 리터 플라스틱 냄비에 5 개의 식물을 넣습니다. 밀리리터당 0 마이크로그램 또는 티아메톡삼밀리리터당 100마이크로그램을 플라스틱 냄비에 넣으세요.

이전 방법에 따라 그대로 식물 샘플을 준비, 사전 침을 제외하고 다음 Orbitrap 질량 분광법에 의해 분석. HPLCUV를 사용하여 254 나노미터의 파장에서 티아메톡삼과 아세티모프리드의 함량 및 대사 산물을 감지하고, 270 나노미터의 이미다클로프리드와 이미데프로사제의 함량과 대사 산물을 검출한다. 관 열을 사용하여 GC-FPD에 의한 디메트호이트와 오메토이트 의 함량을 감지합니다.

탄소-18 컬럼을 사용하여 UPRC QTOF를 사용하여 세포 배양에서 살충제의 대사산물을 검출한다. UPLC 궤도 랩 질량 분광법을 사용하여 시험 식물 추출물에서 살충제의 대사 산물을 감지합니다. 한 멸균 화분의 캘러스는 오염 브라우닝이 낮지만 고른 차 잎에서 callus의 유도성이 높습니다.

멸균 잎에서 파생된 캘러스는 항상 밝은 황색이었고, 수확한 잎에서 추출한 캘러스는 갈색 반점이 있는 흰색이었습니다. KT 농도가 리터당 0.1밀리그램이되었을 때, 캘러스는 황색으로 변하고 질감이 느슨했습니다. 2, 4-D 농도가 리터당 1밀리그램이었을 때 콜러스의 성장률은 61.5%까지 가장 높았으며, KT의 농도는 리터당 0.5밀리그램이었다.

캘러스의 성장 데이터가 최고였고 캘러스의 성장률이 46.9%에 가장 높았기 때문에 식물호먼트의 가장 좋은 조합은 KT의 리터당 2, 4D, 0.1밀리그램으로 차 캘러스 성장을 위한 것이었다. 캘러스는 네 번째 하위 문화권에 의해 잎을 완전히 덮었고, 하위 문화 주기가 28 일 이었을 때. 캘러스는 황색과 느슨한 질감과 갈색이 없는 힘차게 성장했습니다.

칼러스의 총 데이터와 세포 현탁액의 색상을 비교한 후, B5 액체 배지는 세포 현탁액 배양에 더 적합하였다. 세포 현탁액 배양의 OD 값은 세포 성장의 양을 나타내는 데 사용되었다. 재배 75일 동안 40밀리리터당 15그램의 비율은 다른 두 비율보다 OD 값이 상당히 높았습니다.

티 셀 서스펜션 배양 내의 세포 생존능력은 TTC 염색에 의해 시험되었다. 무색 TTC 화합물은 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 탈수소 효소에 의해 붉은 포마딘으로 변환될 수 있지만 죽은 세포에서는 색을 변경할 수 없습니다. 그리고 이것은 차 세포 현탁액 배양을 확립하는 전체 과정입니다.

이것은 세포 현탁액 배양 기술을 사용하여 차에 있는 다른 살충제의 물질 대사의 첫번째 비교 연구입니다. 몇몇 살충제 대사산물은 확인되었고, 그 중 일부는 보관된 차 식물에서 더 조사되었습니다. 이 새로운 방법은 차 또는 다른 식물에 농약 대사 연구의 모델로 봉사 할 수 있습니다.