Name: 열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 학습하세요 열과 압력을 이용한 수성 용매화 기술로 재조합 거미 실크 단백질을 용해하는 방법입니다. 이 기술은 생명활성 화합물을 첨가할 수 있어 바이오재료 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자 들은 유타 과학 기술 연구 (USTAR) 이니셔티브의 자금을 기꺼이 인정 하 고 싶습니다.

1. 동결 건조 된 단백질 주식에서 재조합 거미 실크 혼합물 준비
<ol><li>원하는 재료 형성에 필요한 제제 및 체적을 결정 합니다. 일반적인 제제의 범위는 최대 15% (w/v)입니다. 이 선택 항목을 사용 하 여 적절 한 rSSp, 농도 및 비율을 계산 합니다.<ol>
<li>다음의 각각의 제형을 사용 하 여이 프로토콜에 기재 된 각각의 물질을 제조 한다. 하이드로 겔/스폰지/l a 겔 6% 50:50 MaSp1: MaSp2; 필름 코팅 5% 80:20 MaSp1: MaSp2; 접착제 12% 50:50 MaSp1: MaSp2; 섬유, 12.5% 80:20 MaSp1: MaSp2. 주: 대부분의 제형은 특정 형태 및 재료에 적합 하지만 종종 겹칠 수 있는 광범위 한 제형이 있습니다. 또한 최종 rSSp 재료는 형성 및 가공 중에 맞춤화 하 여 원하는 특성을 생성할 수 있습니다. 일반적으로, 각 단백질은 적절 한 또는 유용한 매개 변수를 조사 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>고무 줄 지 어 스크류 캡을 사용 하 여 깨끗 하 고 새로운 8 mL 오토 클레이 브 붕 규 산 유리 배양 바이 알을 선택 하십시오.</li>
	<li>캡을 제거 하 고 빈 유리병을 분석 저울에 놓습니다. 빈 유리병의 질량을 계량 하 여 균형이 0 질량을 읽습니다.</li>
	<li>원하는 동결 건조 rSSp 분말을 각각의 특정 물질에 대해 빈 바이 알에 첨가 한다.<ol>
<li>각 물질에 대해 이러한 특정 질량을 각각의 재료에 사용 하 고, 2 mL 용액을 제조 하는 경우: 하이드로 겔/스폰지/lyogels, 60의 MaSp1 및 60 mg의 MaSp2; 필름/코팅, MaSp1의 80 mg 및 MaSp2의 20 mg; 접착제, 120의 MaSp1 및 120 mg의 MaSp2; 섬유, 200의 MaSp1 및 50 mg의 MaSp2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미 가중치가 부여 된 rSSp 분말이 들어 있는 바이 알에 원하는 양의 초순 수 (최소 2 mL)를 추가 합니다. 참고: 모든 용 매 화 절차에는 최소 2 mL의 용량을 권장 합니다.</li>
	<li>바이 알 캡을 밀봉 하 고, 내용물을 힘차게 소용돌이 하 여 용 매 화 과정에 사용할 수 있는 분산 및 균질 한 rSSp 혼합물을 만듭니다. 초음파 처리 또는 임 펠 러 혼합과 같은 추가적인 균질 화 접근법은, 또는 또한와 류 혼합과 함께 사용 될 수 있다.</li>
</ol>2. 재조합 거미 실크 용 매 화
주의: 용 매 과정에서 높은가 열 및 압력이 발생 합니다. 적절 한 개인 보호 장비, 특히 고글, 긴 소매 및 내 열 장갑이이 과정에 필요 합니다.
<ol><li>바이 알, 용기, 캡의 최종 검사를 수행 하 여 견고 하 고 단단히 조여 졌는 지 확인 하십시오. 그런 다음 일시 중단 된 rSSp 혼합물을 통상적인 전자 렌지로 옮겨 준다. 참고: 700의 전력 범위 내 1500에 있는 마이크로파 유닛은 더 작은 내부 챔버 용량을 보유 하 고 있으며 회전 플랫폼은 더 나은 용 매 화 조건을 제공 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>최대 전력에서 5 초 버스트와 전자 레인지의 작동을 시작 합니다. 각 버스트를 짧게 한 후 문을 열고 조심 스럽게 침전을 방지 하 고 부유 혼합물을 유지 하기 위해 바이 알을 소용돌이.</li>
	<li>상기 혼합물 및/또는 용액이 상기 바이 알의 일부를 함유 하는 용액에 대해 직접 적외선 온도계로 측정 될 때, 적어도 130 ° c의 온도를 얻을 때까지이 마이크로파 공정을 반복 한다. 모든 고체 입자가 완전히 용 해 되어 더 이상 보이지 않는 때까지이 과정을 반복 합니다. 참고: 바이 알과 용액을 때때로 냉각 하는 것이 좋습니다, 특히 제제가 높은 rSSp의 농도가 있는 경우. 200 ° c를 초과 하는 온도는 바이 알 씰 실패의 위험을 증가 시킵니다. 특별 한 주의가 또한 유리병 억제 실패를 초래 하는 물개에 접촉에서 과열 된 혼합물/해결책을 방지 하기 위하여 주어져야 합니다.</li>
	<li>RSSp 혼합물을 용액에 성공적으로 용 매 화 시킨 후 용액 및 바이 알 캡의 온도를 개방 하기 전에 100 ° c (끓는점) 이하로 냉각 시켰다.</li>
</ol>3. 하이드로 겔
<ol><li>마이크로웨이브에서 제거한 후 용액 으로부터 하이드로 겔을 제조 하 고이를 냉각 및 설정할 수 있도록 한다. 완전히 냉각 되도록 하기 전에 하이드로 겔을 특정 형상으로 주조 하십시오. 참고: 다른 Rssp는 하이드로 겔로 전환 하기 위해 다양 한 양의 시간이 필요 합니다. 예를 들어, MaSp2 같은 서 열은 MaSp1 유사 서 열에 비해 더 빠르게 하이드로 겔을 형성 하는 경향이 있다. 단백질 농도, 염도 및 pH는 또한 하이드로 겔로의 전이 속도에 직접적으로 영향을 미친다.</li>
</ol>4. 스폰지
<ol><li>1 차 용 매 화 용액을 먼저 허용 하 여 rSSp 스폰지를 준비 하 여 하이드로 겔을 형성 한다.</li>
	<li>하이드로 겔을 수조에 놓고이 목욕을-20°c의 냉동 실에 놓고 목욕이 완전히 얼어 붙을 때까지 기다리십시오.</li>
	<li>25 ° c에서 냉동 및 해 동 으로부터 동결 된 하이드로 겔 및 수조를 제거 하 여 스폰지 형성 과정을 완료 한다. 결과 스폰지는 이제 해 동 된 물에서 제거 할 수 있습니다.</li>
</ol>5. lyogel
<ol><li>형성 된 하이드로 젤을 수 욕 유무에 관계 없이 직접 동결 하 고 동결 된 하이드로 겔 샘플을 동결 건조 기로 이송 하 여 rSSp lyogel을 준비 합니다.</li>
	<li>수 분 승화가 발생 한 용기 로부터 최종 동결 건조 된 겔 물질을 제거 한다.</li>
</ol>6. 필름 및 코팅
<ol><li>다음 세 가지 방법 중 하나를 사용 하십시오: 솔루션 주조, 용액 분무 또는 딥 코팅으로 rSSp의 필름 또는 코팅을 생성 합니다.<ol>
<li>가용 화 된 실크 용액을 원하는 형상의 PDMS 형태로/상으로 캐스팅 한다.</li>
		<li>200 µ L의 필름 용액을 붓고 확산 하 고이를 테스트 또는 치료를 위해 PDMS 기판에서 벗 겨 내기 전에 건조 시키십시오.</li>
		<li>이러한 건조를 허용 한 후, 기계적 시험을 위해 형성 된 필름을 제거 하거나 기계적 성질을 향상 시키기 위해 필름을 후 처리 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기판 으로부터 제거 될 수 없는 코팅 또는 필름을 제조 하기 위해, 스프레이 또는 딥 코팅을 사용 하 여 박막 층을 생성 한다. 참고: 코트 스프레이,이 프로토콜은 마스터에 어 브러시 모델 페인트 분무기와 성공을 발견 했다.<ol>
<li>선택한 기판을 가용 화 된 rSSp에 간단히 결합 하 고 건조 후에 반복 하 여 원하는 두께를 달성 함으로써 딥 코팅을 형성 합니다.</li>
		<li>최종 코팅의 일관성과 효과를 높이기 위해 딥 코트를 적용 하기 전에 초기 스프레이 코트를 수행 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 접착제
참고: 접착제의 형성은 다음 방법 중 하나를 통해 달성 된다.
<ol><li>가용 화 된 rSSp를 기판에 직접 추가한 다음 용액 상단에 두 번째 기판을 적용 합니다. 조각을 함께 단단히 고정 한 다음 최소 온도 25°c의 최소 온도로 16 시간 동안 오븐에서 샘플을 건조 시키십시오.</li>
	<li>또는 스프레이 코팅으로 두 개의 기판 표면을 분무 한 다음 기판을 함께 고정 합니다.</li>
	<li>딥을 통해 rSSp를 적용 하 여 기판을 코팅 하 고 기판을 부착 하는 방법도 제조 및 접착에 사용 될 수 있다.</li>
</ol>8. 습식 방적 섬유
<ol><li>가용 화 된도 프 용액을 Luer 로크 팁이 있는 동심 주사기에 19G의 글라이드 바늘로 로드 합니다. 기포를 배출 하 고도 프가 주사기의 Luer Lok 끝에 앉도록 하십시오.</li>
	<li>1/16 인치 OD 및 10/32 원뿔에 대 한 PEEK 튜브의 일체형 손가락 꽉 피팅에 PEEK 튜브, 내부 직경 0.01 인치 이상 25mm를 삽입 합니다. 이 피팅을 Luer-록 암 어댑터의 PEEK 튜빙에 부착 합니다.<ol>
<li>로드 된 주사기에 설정 된 19 게이지 바늘을 교체 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>응고 욕에 사용 하기 위해 99% 순수이 소 프로 판 올로 크고 깨끗 한 유리 욕을 채우십시오.<ol>
<li>스트레칭 godets 아래에 있는 스트레칭 목욕을 채우십시오. 첫 번째 스트레치 욕조에 증류수와 20:80이 소 프로 판 올: 증류수를 두 번째 스트레칭 욕조에 80:20이 소 프로 판 올이 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상기 첫 번째 고 데는 응고 욕 후 제 1 고 뎃과 동일한 속도로 회전 하 게 되는 고 뎃 연신 시스템을 설정 한다.<ol>
<li>스트레치 배스 1, 미들 어퍼 고 뎃, 스트레치 배스 2의 첫 번째 밑단의 속도를 동일한 속도로 조정 하 여 첫 번째 스트레칭을 시작 합니다. 이 속도는 초기 파이버 제거 속도 보다 2 배 빠릅니다.</li>
		<li>두 번째 스트레칭을 시작 하는 최종 밑단의 속도를 조정 하 여 스트레칭 목욕 2, 마지막 상단 밑단, 그리고 같은 속도로 와인 더. 이 속도는 첫 번째 스트레치에 사용 되는 속도 또는 초기 섬유 제거 속도의 4 배 만큼 빠르게 2 배가 됩니다.</li>
		<li>섬유를 미 끄 러 지는 것을 유지 하기 위해 중간 godets의 외부에 니트 릴 장갑을 놓으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>응고 욕에 용액을 천천히 돌출 시키기 시작 합니다. 자동 시스템에서는 압출 속도가 10mm/s의 제거 속도와 일치 하도록 설정 합니다.<ol>
<li>얇은 금속 걸이 또는 집게로 사용 하 여 목욕에서 섬유를 당기기 전에 섬유 압출이 균일 해질 수 있습니다. 목욕에서 섬유를 제거 확인 PEEK 튜브 팁 사이에 루프를 생성 하 고, 섬유는 목욕을 떠나는 경로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>섬유는 스트레칭 화장실에 잠겨 있지만, 스풀에 가기 전에 스트레칭 목욕 사이의 공기에 건조 등의 일련의 godets를 통해 검색 된 섬유를 안내 합니다. 이 건조는 높은 배치 중간 godets에 의해 달성 된다. 참고: 섬유 제거 율 및/또는 압출 율은 응고 욕 바닥에 섬유를 풀링 하지 않고 충분 한 응고 시간을 허용 하기 위해 단백질 농도, 첨가제 및 단백질 유형에 따라 조정 해야 합니다.</li>
	<li>테이프를 사용 하 여 와인 더 메커니즘에 스풀에 완전히 뻗어 섬유를 연결 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
<li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li>
<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

저자는 이해관계의 충돌을 선언 하지 않습니다.

재조합 거미 실크 단백질이 정제 된 후에는 물질 형성에 사용 될 수 있는 용액으로 제조 되어야 한다. 동결 건조 된 거미 실크 단백질을 물과 혼합 하 고이 혼합물을 마이크로파 조사에 노출 시 킴으로써, 열 및 압력을 발생 시키고, rSSp 용액을 제조할 수 있다. RSSp 가용 화의 간단 하 고 효율적인 방법으로 다양 한 재료 형태를 생산할 수 있습니다. 각 재료는 원하는 결과와 특성을 달성 하기 위해 고유 하 게 준비 및 처리 되어야 합니다. 초기 제형, 형성 조건 및/또는 처리 매개 변수에 대 한 경미한 변경으로 각 재료는이 방법을 사용 하 여 쉽게 조정할 수 있습니다. 여기에 제시 된 것 보다 더 많은 양식이 있으며 현장에서 다른 사람에의 한 추가 조사를 통해 이러한 재료는이 기술을 사용 하 여 새로운 재료 형태를 탐구 하기 위해 계속 진화 할 것입니다.
용액이 주로 물과 단백질로 구성 되는 경우 (첨가제는 겔 화를 지연 시키고 용액의 안정성을 향상 시키기 위해 이용 될 수...

거미 실크는 강도, 탄력성 및 생체 적합성의 인상적인 조합에 대 한 재료 과학자의 관심을 얻고 있다. 섬유를 다시 만드는 것은 전통적으로 연구의 추력 이었다. 이러한 노력은 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp) 물에 대 한 용해성 뿐만 아니라 전통적인 용 매 화 기술 (차오 트로픽 제 및 세제)의 무 능력으로 수성 용 매를 달성 함으로써 방해를 받았습니다. 또한 rssp의 용 매 화 버전을 위해 개발 된 기술은 모든 rssp 변형에서 작동 하지 않으며, 종종 단백질 손실1,2를 초래 하는 상당한 조작 및 시간이 필요 합니다. 이는 주로 섬유를 형성 하는 용 매로 서 1, 1, 3, 3 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 사용 하는 분야에서, 그리고 다른 한정 된 물질 형태를 초래 하였다. 모든 알려진 rSSp가 HFIP에 용 해 되어 각 연구 그룹 간의 데이터 균일성을 제공 한다는 이점이 있습니다. 단점은 HFIP가 건강 문제와 환경적 고려 사항으로 인해 규모가 비싸고 실용적이 지 않은 독성 용 매 라는 점입니다.
Rssp 용 매 화에 대 한 신규 한 접근법이 개발 되어, rSSp 용 매가 선택적으로 작동 하는 가혹한 유기 용 제 HFIP 및 기타 기술 들 사이의 기술적 간극이 브릿지 되었다. 특정가 열 및 압력의 조합은 rSSp와 물의 현 탁 액에 적용 되었습니다. 결과는 100%의 용 매 화 및 rSSp의 회수 뿐만 아니라 고 단백질 농도와도 같습니다. 다양 한 물질 형태가 hfip 또는 다른 유기 용 매를 사용 하 여 달성할 수 없었던 이들 제제 로부터 가능 하다 고 결정 되었다3,5,6. 이러한 접근법의 목적은 정제 및 건조 된 재조합 거미 단백질을 수 용액에 효율적이 고 용이 하 게 가용 화 하 여 다양 한 재료 형태의 생산을 위해 활용 하는 것 이다.
섬유, 필름, 코팅, 접착제, 하이드로 겔, lyogels, 마이크로 스피어 및 스폰지 물질은 모두이 방법을 사용 하 여 동일한 수성 rSSp 솔루션에서 쉽게 accomplishable. 추가 rSSp 뿐만 아니라 다른 단백질과 함께이 방법의 지속적인 진화는 새로운 물질 형태와 대체 단백질 정제 및 가용 화로 이어질 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Luer-Lok Tip BD가 있는 3mL 주사기</td><td></td><td>309657</td><td>다른 크기의 주사기를 사용할 수 있지만 팁을 계속 사용하려면 luer-lok 팁</td></tr><tr><td>4mL 배양 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 고무 안감 캡이 있는 투명</td><td>Wheaton</td><td>225142</td><td>최소 도프 용량은 1mL, 최대 2mL</td></tr><tr><td>8mL 배양 바이알, 고무 안감 캡이 있는 투명</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>최소 도프 용량은 2mL입니다. 최대는 4mL</td></tr>입니다. <tr><td>99% 이소프로필 알코올, 시약 ACS/USP 등급</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>동결 건조기</td></tr><tr><td>루어 어댑터 여성 루어 x 10-32 여성, Tefzel (ETFE)</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>전자레인지</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120V, 60Hz AC; 1000 와트; 1.1 cu. ft. 용량; 유리 턴 테이블 포함</td></tr><tr><td>일체형 핑거타이트 10-32 콘, 1/16" OD</td><td>IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>PEEK 튜빙 1/16" OD x 0.010" ID</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>분무기: 마스터 에어브러시</td><td>마스터 에어브러시</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

많은 거미 들이 일곱 종류의 실크를 생산 합니다. 6 개의 실크는 거미에 의해 생성 된 형태로 섬유입니다. 이 섬유는 수용 성이 없습니다. 거미 실크의 놀라운 기계적 성질을 재현 하기 위해, 거미는 영토와 식인 것으로 서 이종의 호스트에서 생산 되어야 합니다. 거미 실크의 합성 유사 체는 또한 수 용액에 불용 성 경향이 있다. 따라서, 재조합 거미 실크 연구의 많은 비율은 물질의 대규모 생산에 해로운 유기 용 매에 의존. 우리 그룹의 방법은 이러한 재조합 거미 실크의 용 매를 물에 강제로. 놀랍게도 이러한 열과 압력 방법을 사용 하 여 이러한 단백질을 제조할 때 필름, 섬유, 스폰지, 하이드로 겔, lyogel 및 접착제를 포함 한 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp)의 동일한 용액 으로부터 다양 한 물질 형태를 제조할 수 있습니다. 본 문서는 서 면 재료 및 방법 만으로는 보다 쉽게 이해 되는 방식으로 용 매 화 rSSp 및 재료 형태를 생산 하는 것을 보여줍니다.

설명 된 rSSp 가용 화 방법 으로부터, 도 1에 보이는 바와 같이 다양 한 재료 형태가 달성 될 수 있다. 가용 화의 방법은 종래의 전자 렌지에 의해 생성 된 열 및 압력을 rSSp 및 물 현 탁 액에 적용 하는 것 이다. 중요 한 온도와 압력이 달성 되 면 단백질은 가용 화 될 것입니다. 이 가용 화 rSSp 솔루션에서 필요한 조건은 하이드로 겔, 라이 겔, 스폰지, 접착제, 코팅, 필름 및 섬유의 일곱 가지 재료 형태로 제공 됩니다. 하이드로 겔은 가용 화 rSSp가 냉각 되 고 자연적으로 자기 연관을 할 수 있도록 함으로써 제조 됩니다. 하이드로 겔을 동결 건조 하 여 lyogel을 제조 한다. 스폰지 재료는 물에 침 지 하면서 하이드로 겔을 동결 하 여 형성 된다. 필름은 가용 화 된 rSSp를 PDMS 표면 (및 다른 암 활성화 표면)에 캐스팅 하 고 건조 시켜 제조할 수 있습니다. PDMS를 사용 하면 ...

여기서, 우리는 수용 성 재조합 거미 실크 단백질 용액 및 그 용액 으로부터 형성 될 수 있는 물질 형태를 생산 하는 프로토콜을 제시 한다.

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

재조합 거미 실크를 용해시키는 이 방법은 기존의 가혹한 유기 용매를 사용할 수 없는 재료 형태를 생성합니다. 또한, 이 과정은 곡물로 되어 물에 간단한 단백질 용액을 생성한다. 이 방법을 활용함으로써, 형성또는 생산된 물질은 거미 실크 단백질의 바람직한 특성을 유지한다.재조합 거미 실크를 위한 이 용해화 기술은 한 단계 의 공정에서 재조합 거미 실크의 용해화를 가능하게 합니다. 단백질을 생성하는 이 악명 높게 어려운 것은 광범위한 처리를 통해 분실되지 않기 때문에 이것은 바람직합니다. 또한, 용액은 물에서 단백질일 뿐이므로, 다른 생물학적 활성 화합물이 적용에 바람직한 경우 첨가될 수 있다.특히, 단백질 구조 기능 관계, 이 시스템은 거미가 고농도에서 물과 단백질을 활용한다는 점에서 섬유를 만드는 방법에 대한 밈이다. 이러한 용해성 방법 및 후속 물질 형성을 사용하여 형성되는 물질과 이를 담당하는 구조에 대한 이해를 얻을 수 있어야 한다. 그것은 될 수 있다고 생각, 우리는 그렇지 않으면 솔바테 알칼리성 또는 산성 환경을 필요로 합성 펩티드를 용해시키기위한이 기술을 사용했습니다.이는 이러한 펩타이드에 대한 다운스트림 응용 분야에서 유리할 수 있습니다. 더욱이, 합성으로 발현될 때 알려진 단백질의 숫자는 불용성 분획에서 끝나는 경향이 있다. 이러한 단백질을 다시 접은 다음 다시 접은 것은 종종 큰 손실을 초래하는 힘든 과정입니다.이 기술을 활용함으로써, 용해성 단백질에 대한 회복 과정의 효율성을 높일 수 있습니다. 전자 레인지에 밀봉 된 유리병을 배치하는 것은 과열의 위험을 초래하고 따라서 유리병을 가압 과잉하는 조금 어렵습니다. 열과 압력을 가하는 단계적 접근 방식을 이해하는 것은 매우 중요합니다.둘째, 재조합 거미 실크의 경우, 소금이 존재하는 경우, 소금이 존재하는 양에 따라 기술이 효과적으로 작동하거나 작동할 수 없습니다. 소금 제거가 핵심입니다. 인내심을 가지고 조심하고 유리병 내부의 전자 레인지 시간과 온도를 면밀히 모니터링하십시오.기존의 서면 재료 및 방법 섹션을 통해 전달하기 어려운 동작에 움직이는 부품이 많기 때문에 매우 중요합니다. 적절한 연구를 방해하는 용해도 문제가 있는 단백질이 많다는 점을 감안할 때, 이 방법은 다양한 단백질 공간에 적용되어 분석 기술과 특성화를 개선할 수 있습니다. 먼저 고무 줄 지어 나사 캡이있는 깨끗하고 새로운 8 밀리리터 자동 클러 교정 유리 문화 유리 바이알을 선택하고 빈 유리병을 분석 균형에 놓습니다.빈 바이알의 질량을 찢어서 밸런스가 질량이 0으로 읽힙니다. 원하는 리오필화 된 재조합 거미 실크 단백질 파우더를 특정 물질에 대한 빈 유리병에 넣습니다. 그런 다음, 유리병에 적어도 2 밀리리터, 초순수물의 원하는 양을 추가합니다.바이알 캡을 밀봉하고, 분산되고 균일한 재조합 거미 실크 단백질 혼합물을 만들기 위해 내용물들을 활발하게 소용돌이시다. 바이알 캡의 최종 검사를 수행하여 단단히 단단히 조여졌습니다. 이어서, 700~1500와트의 전력 범위로 종래의 전자레인지에 매달린 재조합 거미 실크 단백질 혼합물을 전달한다.수동으로 켜고 끄기 하여 5초 버스트가 전체 전원을 설정하여 전자레인지 의 작동을 시작합니다. 각 버스트 후, 잠시 문을 열고 조심스럽게 바이알을 혼합하여 침전을 방지하고 중단된 혼합물을 유지합니다. 때때로 바이알과 용액이 냉각되도록 하고 과열된 용액이 씰을 만지지 않도록 합니다.적외선 온도계를 사용하여 바이알 의 일부를 포함하는 용액의 온도를 측정합니다. 온도가 섭씨 130도 이상에 도달할 때까지 전자레인지 공정을 반복하고 모든 고체 미립자를 완전히 용해합니다. 그런 다음 용액의 온도와 유리골 캡이 섭씨 100도 이하로 식힙니다.이 솔루션이 완전히 냉각되기 전에 유리병에서 특정 형상으로 캐스팅하여 하이드로겔을 형성합니다. 하이드로겔이 형성된 후 수조에 놓고 영하 20도의 냉동고로 옮춥시다. 목욕이 완전히 얼어 붙을 때까지 기다립니다.냉동고에서 냉동 하이드로겔과 수조를 제거하고 섭씨 25도에서 해동하여 스폰지 형성 과정을 완료하십시오. 그런 다음 해동 된 물에서 생성된 스폰지를 제거합니다. 리오겔을 준비하려면 냉동 하이드로겔 샘플을 리오필라이저로 옮기다.24시간 후, 최종 리오필화된 젤 물질을 용기에서 제거한다. 재조합 거미 실크 단백질의 필름을 생산하기 위해, 뜨거운 수용성 재조합 거미 실크 단백질의 200 마이크로리터를 유리병으로부터 원하는 모양의 PDMS 형태로 캐스팅한다. 건조 된 후, 테스트 또는 치료를 위해 PDMS 기판을 벗겨.기판에서 제거할 수 없는 코팅을 준비하려면 에어브러시 스프레이를 사용하여 용윤재거미 실크 단백질을 적용하여 기판에 초기 스프레이 코팅을 수행합니다. 건조 후, 코팅된 기판을 용윤재조합 거미 실크 단백질에 담그고 딥 코팅을 형성한다. 원하는 두께를 달성하기 위해 딥 코팅을 반복합니다.접착제를 형성하려면 파이펫을 사용하여 용액 재조합 거미 실크 단백질을 기판에 추가한 다음 용액 의 상단에 두 번째 기판을 가합니다. 조각을 단단히 고정한 다음 최소 16시간 동안 섭씨 25도의 최소 온도로 샘플을 오븐에 건조시로 건조시. 젖은 스펀 섬유를 생성하려면 19 게이지 글라이드 바늘을 사용하고 가용성처리된 도프 용액을 Luer 잠금 팁이 있는 동심 주사기에 적재합니다.기포를 배출하고, 도프가 주사기의 루어 잠금 끝에 앉게합니다. PEEK 튜빙의 1피스 손가락 타이트 피팅에 최소 25밀리미터의 PEEK 튜브를 삽입하여 외경 16인치 이상, 빗 32개 이상 10개에 넣습니다. 19 게이지 바늘을 주사기의 Luer 잠금 여성 어댑터에 이 셋업으로 교체하십시오.그런 다음, 니트릴 장갑을 중간 고데의 바깥쪽에 놓고, 섬유가 미끄러지지 않도록 하고, 모터를 손상시키지 않도록 한다. 99% 순수 이소프로파놀이 있는 키가 큰 투명한 유리 목욕을 구균 욕조로 사용하세요. 첫 번째 스트레치 목욕을 80 대 20 비율로 이소프로판올과 증류수로 채웁니다.두 번째 스트레치 욕조에서는 이소프로판올과 증류수의 20~80비율을 채웁니다. 컴퓨터에 godet 스트레치 시스템을 설정합니다. 섬유 제거의 주요 속도를 조정하려면 섬유가 얼마나 잘 빠르게 형성되는지에 따라 고데 트리플A 속도의 슬라이딩 바를 초당 10~14밀리미터 의 값으로 조정합니다.고데 트리플 B 스트레치 비율의 슬라이딩 바를 2개로 이동하여 스트레치 목욕 1, 중간 상부 고데, 스트레치 목욕 2의 첫 번째 고데를 시작합니다. 스트레치 목욕 2, 마지막 상부 고데, 와인더의 마지막 고데에 대한 고데 트리플 C 스트레치 비율의 슬라이딩 바를 2로 이동하여 두 번째 스트레칭을 시작합니다. 이 설정은 응고 목욕 후 첫 번째 고데, 첫 번째 스트레치 목욕의 첫 번째 고데가 같은 속도로 회전하는 것을 보장합니다.다음으로, 사용자 정의 스핀 라인 악기의 주사기에 실크 솔루션을로드합니다. 자동화 된 시스템에서, 이소프로판올로 채워진 유리 응고 목욕에 실크 용액을 돌출하기 위해, 초당 10 밀리미터로 압출 속도를 설정합니다. 얇은 금속 후크로 섬유를 목욕에서 꺼내기 전에 섬유 압출이 균일해질 수 있도록 하십시오.목욕에서 섬유를 제거하면 PEEK 튜브 팁과 목욕을 떠나는 섬유경로 사이에 루프가 생성되는지 확인하십시오. 섬유가 스트레치 욕조에 잠겨 있지만 스트레치 욕조 사이에 공기 중건조되고 스풀에 들어가기 전에 고개를 끄덕이는 일련의 섬유를 안내하십시오. 재조합 거미 실크 단백질의 용해화를 통해 이 프로토콜에서 다양한 재료 형태를 얻을 수 있다.7개의 재료 형태가 여기에 제시되어 있습니다. 하이드로겔, 리고겔, 스폰지, 접착제, 코팅, 필름 및 섬유. 섬유는 응고 욕조로 압출한 다음 포스트 빈 스트레치 욕조에서 원시 섬유를 연속적으로 스트레칭하여 가장 광범위한 처리가 필요합니다.단백질과 물 용액이 상대적으로 높은 온도와 압력으로 가열된다는 점을 감안할 때, 우리의 경험은 단백질이 솔바드는 시점에서 용액이 멸균된다는 것입니다. 이를 통해 여기에 제시된 모든 물질 형태가 적절하게 처리되는 한 물질에 대한 세포 반응을 연구할 수 있습니다. 확실히이 기술은 접착제와 스폰지 재료를 포함한 새로운 재료 형태의 발견으로 이어졌습니다.섬유 형성이 이 기술의 발달을 통해 개선을 본 분야 중 하나이지만 섬유 형성을 향한 지향성이 반드시 형성되지 않는 물질 형태. 밀폐된 유리병 내부에 열과 압력을 발생시키는 것은 내재된 위험이 있습니다. 이러한 절차를 수행 할 때 항상 개인 보호 장비를 착용하십시오.

material-formation-recombinant-spider-silks-through-aqueous-solvation

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기 우리는 여성의 검은 과부 거미의 복부에서 비단 생산 땀샘을 제거하는 효율적인 전략을 설명합니다. 이 절차는 일곱 별개의 비단 생산이 높은 정화 패션, 거미 실크의 생산 및 섬유 조립을 공부 조사를위한 중요한 프로세스의 분비를의 급속한 고립 수 있습니다.

블랙 위도우 스파이더 실크 생산 땀샘의 Microdissection

거미 실크 옷의 뛰어난 기계적 및 생화 학적 특성에도 불구하고,이 재료는 종래의 방법으로 대량 수확 할 수 없습니다. 여기 차세대 biomaterials 같은 거미 실크의 생산과 사용을 공부 수사관을위한 중요한 과정입니다 인공 거미 실크 섬유를 스핀하는 효율적인 전략을 설명합니다.

실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산

거미 실크 섬유는 특별한 기계적 특성을 표시합니다.

전기 방사 재조합 거미 실크 단백질의 부직포 메쉬를 포함하여 공기 정화 장치

혼합 속성과 결합하여 광범위한 기능과 생체 물질을 생성 할 수있는 효율적인 방법입니다. 다른 천연 실크 단백질 분자 사이의 상호 작용을 예측함으로써, 가변 기계적 복원력 전기적 응답, 광학 투명성, 화학적 가공성, 생분해 성, 또는 열적 안정성을 가진 새로운 실크 실크 단백질 합금 플랫폼을 설계 할 수있다.

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 실크 실크 단백질 합금 재료 설계

미세 회전 및 재생성된 실크 fibroin monofilament의 미세 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

이 프로토콜은 생체 의학 및 환경 응용 분야에서 사용 하기 위해 반응성 잉크젯 인쇄를 활용 하 여 자기 모 타일에 적합 하 고 친환경적 인 마이크로 교 반기를 인쇄 하는 기능을 보여줍니다.

실크 기반 자기 추진 마이크로 교 반기에 대 한 반응성 잉크젯 프린팅 및 추진 분석

플라스미드 DNA, 세포질 단백질과 DNA - 단백질 단지의 시각화를위한 감청 모드 원자 힘 현미경 (AFM) 방법을 설명합니다. 방법은 다음과 같은 생화 학적 조작 AFM 이미징을위한 샘플을 준비 대체 방법을 제공합니다. 특정 단백질 상호 작용하는 지역을 포함하는 DNA는 거의 physiologic 버퍼 조건에서 관찰됩니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

우리는 스텐실 인쇄 및 석판뿐만 아니라 미세하게 패턴에 대한 배양 세포에 방법을 통해 micropattern과 나노 다공성 금 박막에 대한 기술을보고합니다. 또한, 우리는 물질과 주사 전자 및 형광 현미경 기술을 이용하여 배양 된 세포의 형태를 특성화하는 이미지 분석 방법을 설명합니다.

세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

다공성 매체를 모방한 미세유체 장치에서 생물막 형성 연구를 위한 프로토콜에 대해 논의합니다. microfluidic 장치는 마이크로 기둥의 배열로 이루어져 있고 이 장치에 있는 Pseudomonas fluorescens에 의하여 biofilm 대형은 조사됩니다.

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

학습하세요 열과 압력을 이용한 수성 용매화 기술로 재조합 거미 실크 단백질을 용해하는 방법입니다. 이 기술은 생명활성 화합물을 첨가할 수 있어 바이오재료 연구에 활용됩니다.

열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성

더 많은 동영상 탐색