Name: 정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 배우세요 Duchenne 근영양증 쥐의 심장 기능을 개선하기 위한 근육 전구 세포 유래 엑소좀 분리, 정화 및 심근 내 이식 기법을. 이 방법은 dystrophin 발현 증가와 함께 심장 기능을 향상시킵니다.

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당나라는 미국 심장 협회에 의해 부분적으로 지원 되었다: GRNT31430008, NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

동물은 승인 된 프로토콜 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 오 거 스타 대학에서 조오지 아의 의학 대학의의 동물 복지 규정에 따라 처리 합니다.
1. 격리와 MPC에서 파생 된 Exosomes의 정화
<ol><li>20 mL 완전 한 Dulbecco와 15 cm 세포 문화 접시에 시드 5 x 106 C2C12 셀이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 G 및 100 μ g/mL 스 수정. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.</li>
	<li>진동 물통 회전자를 사용 하 여 4 ° C에 18 h에 대 한 100000 x g 에서 FBS의 ultracentrifugation에 의해 exosome 고갈 매체를 준비 합니다. 펠 릿을 삭제 합니다.</li>
	<li>단층 세포 문화 접시에 80%의 합류를 도달할 때 완전 한 DMEM 매체 exosome 고갈 대체.</li>
	<li>전송 피 펫을 사용 하 여 셀 문화 접시 총 3 번에 대 한 모든 48 h에서에서는 상쾌한 수집. 50 mL 원심 분리기 튜브, 그리고 나머지 셀을 제거 하려면 10 분 동안 150 x g 에서 원심 분리기에 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>상쾌한 세포 파편을 제거 하는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링. Ultracentrifuge exosomes 침전 하 4 ° C에서 120 분 100000 x g 에서 진동 물통 회전자를 사용 하는 매우 명확한 튜브에 필터링 된 매체.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 exosome 포함 된 펠 릿을 resuspend 하 고 PBS를 가진 전체 매우 명확한 튜브를 입력 합니다. 오염 단백질 제거 하 4 ° C에서 120 분 100000 x g 에이 서 스 펜이 션의 ultracentrifugation를 수행 합니다.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 100 µ L PBS에 exosome 펠 릿 resuspend. 나중에 사용-80 ° C에 저장 합니다.</li>
	<li>전자 현미경 분석, 실 온에서 5 분 동안 200 메쉬 구리 전자 현미경 formvar 코팅 그리드에서 3 µ L exosomal 현 탁 액의 장소. 표준 uranyl 아세테이트23얼룩이 계속 합니다. 세미 드라이 그리드 전송 전자 현미경으로 검사 합니다.</li>
</ol>2. Intramyocardial Exosome 배달
참고: 우리는 각 그룹에 6 쥐를 사용합니다.
<ol><li>100 mg/kg BW 케 타 민 10 mg/kg BW xylazine의 함께의 복 (i.p.) 주입으로 DBA/2J-DMDMDX 쥐 (남자 > 10 개월, 몸 무게 (BW) > 18 g) anesthetize 고 발가락 핀치에 의해 마 취의 깊이 확인 합니다.</li>
	<li>각 다리를 확보 하 니 자리에 위 턱을 아래 수평으로 3-0 봉합 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼에 부정사 위치에 각 마우스를 수정.</li>
	<li>피부에서 모피를 제거 하려면 마우스 가슴의 왼쪽을 depilatory 크림을 적용 합니다.</li>
	<li>24 G 카 테 터를 사용 하 여 구강을 통해 endotracheal 삽 관 법을 수행 하 고 마우스 설치류 호흡을 사용 하 여 195 호흡/min의 속도로 방 공기를 환기 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>75% 알코올과 10 %povidone 요오드와 함께 피부를 소독.</li>
	<li>10\u201215 m m 경사 절 개를 왼쪽된 sternal 가장자리에서 왼쪽된 겨드랑이를 확인, 주요 흘리는 pectoralis 미성년자는 시저에 의해 잘라 다음 왼쪽된 thoracotomy 4 있는 공간을 통해 합니다. 부드럽게 확산 10 m m의 폭을 흉 강 견인 밴드 삽입 합니다. 왼쪽된 폐에 손상을 입히지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>두 직선 핀셋을 사용 하 여 심 낭 제거, 떨어져, 그들을 끌어 및 노출 심장 견인 팁 뒤에 그들을 배치. MPC-엑 소 주사 (30 µ L PBS에서 50 μ g) 또는 31 G 인슐린 바늘을 사용 하 여 한 사이트에서 좌 심 실의 앞쪽 벽에 30 μ PBS (컨트롤로) intramyocardially.</li>
	<li>6-0 나일론 봉합을 사용 하 여 시퀀스에서 흉 강, pectoralis 근육과 피부를 닫습니다.</li>
	<li>마우스를 복구 합니다. 리듬, 자발적인 호흡이 있으면 일단 호흡, 그리고 extubate에서 쥐를 제거 합니다. 관찰 하 고 수술 후 마우스 상태를 기록 합니다.</li>
</ol>3입니다. 심장 초음파
참고: 실험적인 그룹에 눈을 멀게 한 관찰자는 심장 초음파 및 데이터 분석을 수행 합니다.
<ol><li>PBS/exosome 이식 후 2 일 anesthetize 1\u20122% isoflurane와 쥐.</li>
	<li>테이프를 사용 하 여 부정사 위치에 마우스를 해결 하 고 따뜻한 어쿠스틱 젤 왼쪽된 가슴 지역에 적용.</li>
	<li>
앞에서 설명한16,24로 심장 초음파로 좌 심 실 기능을 평가 합니다.
	<ol>
<li>2 차원 (B 모드), 좌 심 실 (LV)의 parasternal 긴 축 보기를 얻을 하 고 젖꼭지 근육 수준에서 LV 짧은 축 보기를 얻기 위해 초음파 프로브 90 °를 회전.</li>
		<li>기록 M 모드 echocardiographic 이미지와 왼쪽된 심 실 끝 심장 확장 지름 측정 (LVEDD), 왼쪽된 심 실 끝 심장 수축 볼륨 (LVESD), 좌 심 실 끝 심장 확장 볼륨 (LVEDV), 및 좌 심 실 끝 심장 수축 볼륨 (LVESV) 참고: 분수 단축 (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100, 및 좌 심 실 방출 분 율 (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. Immunohistochemistry
<ol><li>PBS/exosome 이식 후 2 일 anesthetize 마우스 (단계 2.1 참조) 하 고 흉 골 흉 강 폭로 자르면. 열 등 한 베 나 정 맥, 해 부하 고 3 mL PBS, 뒤에 실 온에서 4% paraformaldehyde 3 mL 5 mL 주사기에 부착 된 25 G 바늘으로 나비 카 테 터를 사용 하 여와 좌 심 실 정점 통해 심장 perfuse.</li>
	<li>파라핀에 고정된 마음을 포함 하 고 5 μ m 두꺼운 부분으로 잘라.</li>
	<li>크 실 렌에 슬라이드 deparaffinize 하 고 다음 순서에 따라 에탄올 솔루션에 리하이드레이션: 100% 크 실 렌 (3 분), 100% 크 실 렌 (3 분), 100% 에탄올 (1 분), 100% 에탄올 (1 분), 95% 에탄올 (1 분), 80% 에탄올 (1 분), H2O (1 분).</li>
	<li>실 온에서 8 분 4 %paraformaldehyde 조직 단면도 수정 합니다.</li>
	<li>나트륨 구 연산 염 (0.01 M, pH 6.0)에서 슬라이드를 담가 그리고 항 원 검색기를 사용 하 여 항 원 검색을 수행.</li>
	<li>PBS에서 1% 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르와 실 온에서 1 h 섹션 permeabilize</li>
	<li>5% 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h에 대 한 섹션을 차단 합니다.</li>
	<li>희석된 1 차적인 항 체 (항 체 안티 dystrophin) PBS (1: 100)에 4 ° C에서 하룻밤 섹션을 품 어 다음 5 분 동안 세 번 PBS로 세척.</li>
	<li>희석된 이차 항 체 (알 렉 사 Fluor 488 활용 염소-토끼 IgG) PBS (1:400)에 상 온에서 45 분에 대 한 섹션을 품 어.</li>
	<li>제어 autofluorescence ( 테이블의 자료를 참조) 키트는 냉각 하는 autofluorescence 사용 하 여.</li>
	<li>사용 설치 매체 DAPI 포함 된 슬라이드 마운트 (참조 테이블의 자료).</li>
	<li>Confocal 현미경 슬라이드를 관찰 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자 들은 관심 없음 충돌 선언 합니다.

순수한 exosomes를 분리 하는 방법은 exosomes의 기능을 공부에 대 한 필수적입니다. Exosome 격리에 대 한 일반적인 기술 중 하나는 폴 리 에틸렌 glycols (나무 못) 중재 강수량17,18,25입니다. Exosomes, 구슬에서 시 켰 던 고 저속 원심 분리에 의해 일지도. 못-중재 정화는 매우 편리 하 고, 낮은-비용, 어떤 고급 장비를 필요 하지 않습니다 하지만 exosomes의 순수성에 대 한 우려 다른 지 단백질 함께 침전 될 수 있기 때문에 제거 하기가 어렵습니다. 적용은 exosome 분리, 분자량 및 제외 크기 제한26에 대 한 일상적인 방법입니다. 한 격리 ultracentrifugation 기반으로 분리, 보다 빠릅니다 하지만 그것은 큰 소포에 구조적 손상을 일으킬 수 있습니다. C...

듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD)은 X 연결 된 열성, 진보적인 신경 근육 학 질환 기능 dystrophin1의 손실과 DMD 유전자에 돌연변이 의해 발생. Dystrophin 골격 근육에 심근, 주로 표현 하 고 덜 부드러운 근육, 내 분 비 샘과 신경2,3에 표시 됩니다. DMD는 3500 5000 신생아 소년 전세계4,5에 하나씩의 발생률과 근 위축 증의 가장 일반적인 유형입니다. 개인은 일반적으로 진보적인 근육 괴 사, 손실 초기 청소년 기, 그리고 두 번째 제 3 년간 심장 마비 및 호흡6그들의 생활의 죽음에의 한 독립적인 지나가는의 개발.
동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥 및 심부는 DMD7,8의 일반적인 심장 혈관 발현. 질병을 치료 수 없습니다, 지지 치료 증상을 향상 시킬 수 있습니다 또는 심장 마비의 진행을 지연 하지만 심장 기능9,10개선 하기는 매우 어렵습니다.
DMD 환자, X 연결 된 근이 영양 증과 유사한 (MDX) 마우스 dystrophin 단백질 및 심근11의 현재 증상에 결핍을 따라서 널리 관련 된 DMD 심근 연구에 사용 합니다. 영향을 받는 근육에 dystrophin 복원 하기 위해 수용자 줄기 세포 치료는 DMD12,,1314에 대 한 효과적인 치료로 입증 되었습니다. Exosomes, 30-150 nm 막 소포 다양 한 셀 형식에 의해 은닉 된다 메신저 RNA (mRNA) 등 비 코딩 RNAs15,16,17 유전 소재 전송을 통해 셀을 통신에 핵심적인 역할을 담당 ,,1819,,2021.
우리의 이전 연구 C2C12 셀 줄, 조직적 뿌리 세포 (MPC)에서 파생 된 exosomes dystrophin 전송할 수 있습니다 직접 심장 주입22, 후 호스트 cardiomyocytes에 mRNA의 배달 된 수용자를 나타내는 MPC 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 MDX 쥐에 DMD 유전자 발현을 복원할 수 있습니다. 이 문서는 MPC-엑 소 정화 및 이식 기술에 초점을 맞추고.

<table><tbody><tr><td>0.22 &무; m 필터</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 세포 배양 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>24 G 카테터</td><td>TERUMO</td><td>SR-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>31 G 인슐린 바늘</td><td>BD</td><td>328291</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6-0 봉합</td>사 <td>Pro Advantage by NDC</td><td>P420697</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 항토끼 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액</td><td>Corning&nbsp;</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>항-디스트로피핀 항체</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>항원 회수기&nbsp;</td><td>Aptum Biologics</td><td>R2100-US</td><td>항원 회수</td></tr><tr><td>자가형광 담금질 키트&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Unico</td><td>C8606</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip 고온 소작기</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>HIT</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 Zeiss</td><td></td><td>Zeiss 780 Upright Confocal</td><td></td></tr><tr><td>DBA/2J-mdx 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>코닝&nbsp;</td><td>10-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>소태아 세럼 (FBS)</td><td>코닝&nbsp;</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>191356</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>Henry Schein</td><td>056344</td><td></td></tr><tr><td>DAPI가 있는 장착 매체;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>마우스 견인기 세트</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>설치류 인공호흡기</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-7066</td><td></td></tr><tr><td>SW-28 Ti 로터</td><td>Beckman</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 이미징 플랫폼</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td>초음파 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (XylaMed)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>1XYL003 8XYL006</td><td></td></tr></tbody></table>

정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 exosomes

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Duchene 근 위축 증 (DMD)은 X 연결 된 열성 유전 질환 기능 dystrophin 단백질 부족으로 인 한. 질병을 치료 수 없습니다, 그리고 및 질병 진행 되는 동안, 환자는 동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥, 울 혈 심장 마비의 증상을 개발 합니다. DMDMDX 돌연변이 마우스 dystrophin, 표현 하지 않는 그리고의 DMD 쥐 모형으로 일반적으로 사용 됩니다. 우리의 최근 연구에서 그 intramyocardial 주입 와이드 타입 (WT)의 관찰-조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 연관 되었다 dystrophin DMDMDX 돌연변이 생쥐의 심근에서의 식을 복원 심장 기능을 제안에 일시적인 개선 WT-MPC-엑 소 DMD의 심장 증상을 완화 하는 옵션을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서는 MPC-엑 소 정화 및 DMDMDX 돌연변이 생쥐의 마음에 이식 하는 기술을 설명합니다.

분리 하 고 순화 C2C12 세포에서 exosomes에 대 한 흐름 차트는 그림 1에 표시 됩니다. Exosomes의 존재를 확인, 우리는 전송 전자 현미경 분석을 수행. 전송 전자 현미경 이미지 (그림 1B) 파생 하는 C2C12 exosomes의 밝고 둥근 모양 vesicles의 형태를 보여 줍니다. 서쪽 오 점 분석 exosome 마커, CD63 및 TSG101 등의 존재를 확인 했다 (그림 1C).
심근에 성공적인 분사를 나타내는 intramyocardial MDX 생쥐 (그림 2)의 좌 심 실의 앞쪽 벽에 PBS/MPC-엑 소 주입 후 반투명 부 종 지역을 관찰 합니다....

여기, 선물이 정도 정상 조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes를 이식 하 여 듀 켄 씨 근이 영양 증 쥐에 심장 기능을 개선 하는 프로토콜.

정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

이 프로토콜은 일반적인 근생 선조 세포에서 파생된 엑슨을 이식하여 Duchenne의 근 위축증 마우스에서 심장 기능을 전환적으로 향상시키는 방법을 제시합니다. 외경 이식은 수령인 심혼에 있는 이영양증의 증가한 발현과 관련하여 DMD 마우스에 있는 심장 기능을 향상할 수 있습니다. 엑슨 분리, 정화 및 인트라메요카르방 이식에 적합한 방법은 듀첸의 근이영양증을 가진 마우스의 심장 기능을 향상시키기 위해 엑슨 이식의 성공에 기여합니다.MPC 유래 엑소솜 치료는 엑소좀 매개된 정상 디스트로핀 mRNA 전달에 의한 골격 근육 기능을 향상시킬 수 있다. 이 비디오는 이식 후 외성 정제, 인트라미카르탈 엑소솜 전달 및 에코카르티오그래피를 위한 중요한 기술을 보여줍니다. 에코카르디그래피의 데모는 우리 실험실의 기술자 인 Yan Shen에 의해 수행됩니다.이 절차를 시작하기 위하여는, 10%FBS및 항생제를 포함하는 완전한 DMEM의 20 밀리리터와 15 센티미터 배양 접시에 5백만 C2C12 세포를 종자. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음으로, 100, 000배, 섭씨 4도에서 초원심분리기 FBS에 스윙 버킷 로터를 사용하여 18시간 동안 섭씨 4도에서 엑소좀 고갈된 매체를 준비한다.펠릿을 버리고 상체를 수집합니다. 단층 세포가 배양 접시에 80%에 도달하면 전체 DMEM을 exosome 고갈 된 매체로 대체하십시오. 48시간마다 세포 배양 접시에서 상체를 수집하기 위해 이송 파이펫을 사용하십시오.나머지 세포를 제거하기 위해 10 분 동안 150 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 0.22 마이크로미터 필터를 통해 상체를 필터링하여 세포 이물질을 제거하고 여과된 매체를 초투명 튜브로 옮기습니다. 다음으로, 스윙 버킷 로터를 사용하여 튜브를 100, 00배, 섭씨 4도에서 120분간 사용하여 엑소좀을 침전시합니다.PBS에서 엑소솜 함유 펠릿을 다시 중단한 다음 PBS로 전체 초투명 튜브를 채웁니다. 이 서스펜션은 100배, 00배, 섭씨 4도에서 120분 동안 오염단백질을 제거합니다. 슈퍼네티드를 버리고 PBS의 100 마이크로리터에서 엑소솜 펠릿을 재차 놓습니다.향후 사용을 위해 영하 80도에 보관하십시오. 먼저, 각 마취마우스를 수술 플랫폼의 척추 위치에 고정하여 각 사지를 테이프로 고정시한다. 윗턱을 제자리에 고정시키기 위해 위니 아래에 수평으로 3-0 봉합사를 놓습니다.다음으로, 마우스 가슴의 왼쪽에 디필 크림을 바르면 피부에서 전나무를 제거합니다. 24 게이지 카테터를 사용하여 구강을 통해 내트라큐레이션 삽관을 수행합니다. 설치류 인공호흡기를 사용하여 분당 195회 호흡속도로 실내 공기로 마우스를 환기시합니다.70%의 알코올과 10%의 포비도네 요오드로 피부를 소독합니다. 그런 다음 왼쪽 흉골 가장자리에서 왼쪽 겨드랑이까지 10 ~ 15 mm 경사 절개를 합니다. 가위를 사용하여 가슴 전공을 자르고 가슴은 경미한 것으로 절단하십시오.그리고 네 번째 해안 간 공간을 통해 왼쪽 토라 코타미를합니다. 흉부 구멍을 10mm 너비로 퍼지도록 리트랙터 밴드를 부드럽게 삽입하여 왼쪽 폐를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그 후 두 개의 직선 핀셋을 사용하여 심근을 제거하십시오.그들을 떼어 내고 마음을 드러내기 위해 리트랙터 팁 뒤에 놓습니다. 31 게이지 인슐린 바늘을 사용하여 MPC-엑소 또는 PBS intramyocardially 한 부위에 좌심실의 전방 벽에 주입한다. 그런 다음 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 흉부 구멍, 가슴 근육 및 피부를 순차적으로 닫습니다.PBS 엑소솜 이식 후 2일 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 마취한다. 테이프를 사용하여 마우스를 supine 위치에 고정하고 왼쪽 가슴 부위에 예열 된 어쿠스틱 젤을 바르습니다. 다음으로, 에코카예피를 사용하여 좌심실 기능을 평가합니다.좌심실의 기갑 긴 축 뷰를 2차원에서 얻은 다음 초음파 프로브를 90도 회전하여 유두 근육 수준에서 좌심실 짧은 축 뷰를 얻습니다. 그 후 M-mode 심초음파 이미지를 기록하고 왼쪽 심실 종횡확장기 직경, 좌심실 단부 수축기 부피, 좌심실 단부 확장기 부피 및 좌심실 단부 수축기 부피를 측정합니다. 마우스의 심박수는 심장 측정 기능을 위해 적어도 400 bpm을 제어해야 합니다.엑소좀이 C2C12 세포로부터 분리되고 정제된 후, 이들의 존재는 투과 전자 현미경 분석을 사용하여 확인된다. 전송 전자 현미경 이미지는 C2C12 유래 엑소좀의 밝고 둥근 모양의 소포의 형태를 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 CD63 및 Tsg101을 포함한 엑소솜 마커의 존재를 확인합니다.반투명 부종 영역은 심근내 내 주입이 성공했음을 나타내는 mdx 마우스의 좌심실의 전방 벽에 내트라모니카심을 주입한 후에 관찰된다. 디스트로핀에 대한 면역 형광 염색은 심장 MPC-엑소 전달이 mdx 심혼에 있는 dystrophin 단백질 발현을 복원하는지 결정하기 위하여 그 때 수행됩니다. dystrophin 발현의 부분적인 복원은 심근 세포의 몇몇에 있는 막 국소화로 관찰됩니다.심장 기능은 MPC-엑소의 트랜스포이션이 mdx 마우스의 심장 기능을 향상시키는지 여부를 결정하기 위해 내트라미쿄카르탈 전달 후 이틀 후 에코카르디그래피로 측정된다. MPC-엑소 치료는 PBS에 비해 내부 벽 의 움직임을 개선하는 것으로 보이며, MPC-엑소 이식이 mdx 마우스에서 심장 기능을 향상시킨다는 것을 시사합니다. 약 20도에서 팁과 31 게이지 인슐린 바늘을 사용 하 여 심근에 대부분의 엑소좀의 전달에 대 한 성공에 대 한 중요 한 심근 세포를 호스트 하는 주입 된 엑소좀의 노출을 극대화.시술에 이어, Dystrophin 발현은 MPC 유래 엑소솜 주입 후 면역형광 염색에 의해 검출될 수 있으며 이는 심장 MPC 유래 엑소좀 전달이 dystrophin-protein 발현을 회복한다는 것을 나타낸다. 이 기술은 DNA, mRNA, lncRNA, 또는 microRNAs를 포함하여 엑소좀 운반 치료 유전 물질을 가진 심근병증 처리를 위한 도로를 포장할 것입니다.

purification-transplantation-myogenic-progenitor-cell-derived

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

정지 위성 세포의 순수 인구의 분리 및 배양은 근육 줄기 세포 집단은 근육 줄기 세포 생물학 및 재생뿐만 아니라, 근육 퇴행 위축 및 기타 퇴행성 질환의 치료를위한 줄기 세포 이식의 이해에 중요하다.

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

이 프로토콜은 근이영양증 환자로부터 소변 유래 세포를 분리하기 위한 상세한 절차를 수반하며, 센다이 바이러스 형질전환(Sendai virus transduction)을 통한 효율적이고 신속한 재프로그래밍  을 수반합니다.

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

여기서, 우리는Dmdmdx 마우스 유래 피부 섬유아세포로부터 iPSC에서 디스트로핀 발현을 복원하고 Tet-on MyoD 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 myogenic 전구 세포(MPC)로 직접 분화하는 Cas9 기반 exon23 결실 프로토콜을 제시한다.

iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술

복잡한 인간 질병은 전통적인 실험실 모형 시스템에서 모델링하는 것이 어려울 수 있습니다. 여기에서, 우리는 면역 결핍 마우스로 인간 골격 근 생검의 이식을 통해 인간 근육 질병을 모델링하는 외과 접근을 기술합니다.

면역 결핍 마우스에서 인간 골격 근 이종이식 수행

이 문서에서는, 우리는 EXON 건너뛰기 후에 dystrophin mRNA 및 단백질 수준의 회복을 평가하기 위하여 MYOD1-변환된소변 유래 세포를 사용하여 Duchenne 근이영양증 근육의 능률적인 모델링을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다.

인간 소변 유래 세포에서 얻은 직접 재프로그래밍 된 Myotube에서 건너 뛰는 Exon

이 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법과 2) 자당 밀도 구배와 웨스턴 블롯 분석을 결합한 차등 초원심분리 방법을 사용하여 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

배우세요 Duchenne 근영양증 쥐의 심장 기능을 개선하기 위한 근육 전구 세포 유래 엑소좀 분리, 정화 및 심근 내 이식 기법을. 이 방법은 dystrophin 발현 증가와 함께 심장 기능을 향상시킵니다.

정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes

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