Name: PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 배우세요 PiggyBac 벡터를 활용한 iPSC에서 척추 및 두개골 운동뉴런으로의 신속한 분화 방법. 이 기술은 ALS 등 운동뉴런 질환 모델링과 약물 스크리닝을 가속화합니다.

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저자는 생명의 나노 과학 센터에서 이미징 시설에 감사 하 고 싶습니다.,이 스 티토 하세가와 디 Tecnologia, 지원 및 기술 조언을. 우리는 생명 나노 과학 센터의 회원 들에 게 도움이 되는 토론에 감사 드립니다. 이 작품은 AriSLA (파일럿 그랜트 2016 "StressFUS")의 보조금에 의해 부분적으로 AR에 지원 되었다.

1. 인간 iPSCs의 유지 보수
<ol><li>
매트릭스 코팅 플레이트의 제조
	<ol>
<li>4 ° c에서 하룻밤 동안 매트릭스의 5 mL 유리병 1 개를 해 동 ( 재료 표참조) 합니다. 원래 매트릭스 주식은 다른 주식 농도에서와 서, 개별 로트에 대 한 특정 데이터 시트에 표시 된 희석 계수에 따라 만들어집니다. 이 매트릭스의 조기 겔 화를 방지 하기 위해 바이 알 및 튜브 얼음 추위를 유지 하는 것이 중요 하다. 얼음에 미리 냉장 된 저온 튜브에 매트릭스를 추출 합니다. 미사용 분 취 액을-20°c에서 고정 합니다.</li>
		<li>약 2 시간 동안 얼음에 1 개를 넣고 해 동 합니다.</li>
		<li>50 mL 원뿔형 튜브에서 20 mL의 콜드 DMEM/F12를 사용 하 여 매트릭스의 취 액을 희석 하십시오.</li>
		<li>잘 섞어서 희석 된 매트릭스 1 mL을 35 mm의 접시에 덜어 냅니다 (다른 요리의 표면적 당 균등 한 양).</li>
		<li>코팅을 허용 하기 위해 실 온에서 1 시간 동안 희석 된 매트릭스를 포함 하는 접시를 보관 하십시오. 참고: 파라 필름으로 밀봉 된 요리는 최대 2 주 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
부드러운 세포 해리 시 약의 원 액 (20ml) 및 1x 작동의 제조 ( 재질 표참조).<ol>
<li>분말을 PBS에서 10 밀리 그램/mL에 녹여드 십시오.</li>
		<li>필터는 0.22 μ m 필터 멤브레인을 통해 멸 균 합니다.</li>
		<li>20 분의 1을 준비 하 고 20 ° c에서 보관 하십시오.</li>
		<li>사용 하기 전에 PBS에 1 개를 희석 하십시오 (Ca2 +/밀리 그램+ 무료). 참고: 1 배 작업을 할 경우 최대 2 주 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간 iPSCs를 통행.
	<ol>
<li>시작 하기 전에: 4°c에서 저장 하는 경우, 37 ° c에서 20-30 분 동안 인큐베이터에서 사전 따뜻한 매트릭스 코팅 플레이트 인간 iPSC 배지 ( 재료 표참조)의 양이 필요 합니다. DMEM/F12를 미리 따뜻하게 합니다.</li>
		<li>흡 기 배지.</li>
		<li>PBS로 iPSCs를 헹 구 십시오 (2 +2 + 무료).</li>
		<li>1x 부드러운 해리 용액 (0.5 35 mm 접시)을 추가 합니다. 콜로 니의 가장자리가 플레이트에서 분리 되기 시작할 때까지 37 ° c에서 배양, 일반적으로 3-5 분.</li>
		<li>IPSC 콜로 니를 분리 하지 않도록 조심 하면서 부드러운 해리 용액을 흡입 합니다.</li>
		<li>세포를 DMEM/F12 (35 mm의 접시)로 씻고 세포를 분리 하지 않도록 주의 하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>인간의 iPSC 배지를 추가 (35 mm 접시에 대 한 1 mL).</li>
		<li>셀 리프 터로 콜로 니를 부드럽게 분리 하 고 15 mL 튜브로 이동 합니다.</li>
		<li>P1000 pior 3-4 시간으로 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 덩어리를 부드럽게 분해 하십시오.</li>
		<li>매트릭스 코팅 플레이트 (들) 로부터 상층 액을 흡입 한다.</li>
		<li>인간 iPSC 배지의 적절 한 배양 부피에서 세포를 종자. 분할 비율은 라인 마다 다를 수 있으며 약 1:4-1:8입니다. 매일 배지를 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NIL 및 닙 유도성 iPSC 라인의 생성
<ol><li>
세포 형질 감염.
	<ol>
<li>PBS로 세포를 헹 구 십시오 (2+ 2 + 무료).</li>
		<li>세포 해리 시 약 ( 재료 표참조) (35 mm 접시 0.35)을 추가 하 고 단일 세포가 분리 될 때까지 37 ° c에서 배양 합니다 (5-10 분).</li>
		<li>P1000 pior 3-4 번을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 분리를 부드럽게 완료 합니다.</li>
		<li>15ml 튜브에 넣고 10ml에 PBS (2 +/밀리 그램2 + 무료)를 추가 합니다. 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>펠 렛 (전기 천공 셀 키트에 포함 된 버퍼 R의 100 μ l에서6 개의 세포와 소생 된 10p(1 개 물질 표참조).</li>
		<li>형질 감염에 대 한 플라스 미드 DNA 추가: transposable 벡터의 4.5 μ g (epB-Bsd-닐 또는 epB-Bsd-TT-닙) 및 0.5 μ g의 피 gybac transposable 플라스 미드13.</li>
		<li>형질 주입는 다음 매개 변수를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 앞에서 설명한3 과 같이 셀 전기 천공 시스템 ( 재료 표참조)을 사용 합니다. 1200 V 전압, 30ms 폭, 1 펄스 6mm 매트릭스 코팅 접시에 10 μ m Y-27632 (락 저 해제, 물질 표참조)로 보충 된 인간 ipsc 배지에서 세포를 종자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항생제로 선택.
	<ol>
<li>형질 감염 후 이틀 후, 배양 배지에 5 μ g/m l blasticidin을 첨가 한다.</li>
		<li>비 형질 세포의 대부분은 blasticidin 선택의 48 시간 이내에 죽을 것 이다. 게놈에서 트랜스 유전자를 통합 하지 않은 세포를 반대 선택 하기 위해 적어도 7-10 일 동안 blasticidin의 세포를 유지 한다.</li>
		<li>서로 다른 수의 트랜스 유전자와 상이한 통합 부위를 가진 세포로 구성 된 혼합 집단으로 서 안정적으로 형질 감염 된 세포를 유지 하거나 단일 클론을 격리 한다.</li>
		<li>트랜스 유전자의 효과적인 발현을 확인 하기 위해 추가의 요리를 준비 하 고, 1 μ g/m l의도 자일로 핀 유도 시, Ngn2에 대 한 유전자 이식 특이 적 프라이 머를 RT-PCR에 의해 (앞으로) 역: 앞에서 설명한 바와 같이,12.</li>
		<li>이 단계에서, 인간 Ipsc를 위한 냉동 매 질에서 신규 한 전무 및 닙-iPSC 라인의 주식을 동결 한다 ( 물질 표참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 모터 신경 분화
<ol><li>설명 된 대로 세포 해리 시 약으로 셀을 해리 합니다 (단계 2.1.1. 15 mL 튜브에서 해리 된 세포를 수집 하 고 DMEM의 5 볼륨/F12로 희석 하십시오. 10 μ m 록 억제제로 보충 된 인간 iPSC 배지에서 세포 및 소생을 펠 렛. 62500 셀/cm2의 밀도로 매트릭스 코팅 요리의 세포와 종자를 계산 하십시오.</li>
	<li>다음날, 배지를 DMEM/F12로 교체 하 고 안정한 L-글루타민 아날로그 1x 비 필수 아미노산 (NEAA) 세포 배양 보조 제와 0.5 x 페니실린/streptomycin을 보충 하 고 1 μ g/m l doxyine을 함유 한다. 이것은 분화의 첫날 0으로 간주 됩니다. 1 일째에는 배지와 독 시 사이 클린을 새로 고칩니다.</li>
	<li>2 일째에 배지를 신경 기저/B27 배지로 변경 (1x B27으로 보충 된 신경 기저 배지, 1 배 안정한 L-글루타민 아날로그, 1x NEAA 및 0.5x 페니실린/streptomycin), 5 μ m DAPT, 4 μ m SU5402 및 2 μ g/mL의도 시 사이 클린을 함유 합니다 (재료 표 참조). ). 5 일째까지 매일 배지와 독 시 사이 클린을 새로 고칩니다.</li>
	<li>
5 일: 세포 해리 시 약으로 세포 해리 ( 재질 표참조).<ol>
<li>PBS로 세포를 헹 구 십시오 (2+ 2 + 무료).</li>
		<li>세포 해리 시 약 (0.35 35 mm 접시)을 추가 하 고 전체 세포 단층이 접시에서 분리 될 때까지 37 ° c에서 배양 합니다. 단 하나 세포는 인큐베이션 도중 분리 되지 않을 것 이라는 점을 유의 하십시오.</li>
		<li>DMEM/F12 1 mL를 넣고 15 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>P1000 pior 10-15 번을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 분리를 부드럽게 완료 합니다.</li>
		<li>DMEM/F12의 4 mL를 추가 하 고 셀을 카운트.</li>
		<li>이 단계에서, 냉동 모터 뉴런은 제조 지침에 따라 세포 동결 매체 ( 재료 표참조)에서 조상.</li>
		<li>10 μ m 록 억제제로 보충 된 세포와 소생 된 뉴런 배지 (20 ng/mL BDNF, 10ng/ml GDNF 및 200 ng/ml 의L-아 스 코르 브 산을 보충 하는 것과 함께 보완 된 신경 기저/B27 배지를 펠 렛.</li>
		<li>폴 리 오 르 니 틴/라미 닌 또는 대안적으로 10만 세포의 밀도에서 매트릭스 코팅 지원에 세포를 종자/cm2. 면역 염색 분석을 위한 고분자 커버 슬립 ( 재료 표참조)과 함께 µ 플라스틱 지지대를 사용 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 일째에, 록 억제제가 없는 신선한 신경 매체를 사용 하 여 배지를 변경 하십시오. 다음 날, 매 3 일 마다 미디어의 절반을 새로 고칩니다. 배양 액은 표면 으로부터의 박 리를 방지 하기 위하여 매우 신중 하 게 변경 되어야 한다.</li>
</ol>4. 면역 염색 분석
<ol><li>세포 고정. 세포를 PBS로 헹 구 고 (Ca2+/mg2 +) 실 온에서 4% 파라 포름알데히드 (ca 2+/mg/2 +)로 15 분간배양 합니다. 주의: 파라 포 름 알 데히드는 독성이 며 암을 유발 하는 것으로 의심 됩니다. 피부와 눈에 닿지 않도록 하 고 화학 증기 두건에서 다루십시오.</li>
	<li>상 온에서 5 분 동안 0.1% 트리톤 X-100을 함유 하는 PBS (Ca2 이상/2 +)와의 투과.</li>
	<li>항 체 차단 용액에서 상 온에서 30 분 동안 배양 하 여 Ca2 +/Mg2 +와 함께 PBS에서 3% BSA를 사용 합니다.</li>
	<li>아 BS에 있는 1 차적인 항 체를 가진 상 온에서 1h를 위해 배양 하십시오: 반대로 TUJ1 (1:1000; 1:200 Oct4) 및 안티-채팅 (안티-콜린 1:150 Acetyltransferase; 재료 표를 참조 하십시오.</li>
	<li>적절 한 당나귀 2 차 항 체를 사용 하 여 상 온에서 45 분 동안 배양 합니다. 안티 마우스 알 렉 사 Fluor 647 (1:250), 안티 토끼 알 렉 사 fluor 594 (1:250) 및 안티 염소 알 렉 사와 플 라 이나 488 (1:250). 재료 표를 참조 하십시오.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 0.4 μ g/mL DAPI를 배양 하 여 핵에 라벨을 지정 합니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 이미징 하기 위해 장착 매체 ( 재료 표참조)로 셀을 마운트합니다.</li>
</ol>5. 패치 클램프 레코딩을 통한 기능적 특성화
<ol><li>다음과 같이 헤 지-평형 외부 용액 (NES)을 준비 합니다. 140 염화 나트륨, 2.8 mm의 CaCl2, 2Mm mgcl2, 10mm 헵 및 10mm 포도 당. 오 스몰 농도를 290-300 m ω 사이로 설정 합니다. 1N NaOH를 사용 하 여 pH를 7.3로 조정 하 고 4°c에서 용액을 저장 한다.</li>
	<li>내부 솔루션 준비: 140 Mmk 글 루 콘 글 루 콘, 5mm 바 브, 2mm의 MgCl 210mm헵, 0.3 mm NA-gtp. 1M KOH로 pH를 7.3로 조정 하 고 오 스몰 농도 290 m ω으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 용액을-20°c에서 작은 알리 쿠 트에 고정 하십시오.</li>
	<li>실험을 실행 하기 전에, 물 욕조에 NES 용액을 약 28-30 ° c로 예 열 한다.</li>
	<li>일부 붕 규 산 마이크로 피 펫을 당겨 (ID 0.86 mm; OD 1.5 mm) 팁 저항 베어링: 5-6 m ω을 입력 하 고 피 펫 홀더에 장착 하기 전에 세포내 용액으로 채웁니다. 참고: 와이어 표면에 AgCl의 균일 한 층을 형성 하기 위해 적어도 30 분 동안 표 백제에 기록 전극 및 기준 전극의 염화 물은 와이어를 기억 한다.</li>
	<li>기록 챔버에서 페 트리 접시를 전송 하 고 1-2 m l/min에서 NES 솔루션 챔버를 보자. 용액을 따뜻하게 유지 하기 위해 30 ° c의 온도에서 설정 된 인라인 히터를 통과 하는 흐름을 보자.</li>
	<li>전기 생리학적 기록 챔버를 직 립 현미경으로 배치 합니다. 패치 클램프 증폭기로 멤브레인 전류를 기록 하 고 적절 한 소프트웨어로 데이터를 수집 합니다.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어를 열고 값 1과 베셀 필터의 신호 게인을 10Khz로 설정 합니다. Bessel 필터가 샘플링 주파수 보다 2.5 배 낮은 지 확인 하십시오.</li>
	<li>기록 소프트웨어에서 전압 클램프 및 전류 클램프 실험에 대 한 실험적 프로토콜을 설정 합니다.</li>
	<li>프로토콜 설정에서 에피소드 자극 모드를 선택 하 고 샘플링 주파수를 25khz로 설정 합니다. 그런 다음 파형 탭으로 이동 하 여 전압 또는 현재 단계 진폭 및 길이를 다음과 같이 입력 합니다.</li>
	<li>전압 게이팅 나트륨 전류의 경우-100 mV ~ + 40 mV (10mv 증가)에서 15 개의 전압 단계 (각각 50 밀리초)를 사용 합니다. 패치 된 셀에 적용 한 후 증폭기를 통해-60 mV의 보유 전위를 유지 한 후 프로토콜을 실행 합니다. 마찬가지로, 전압 게이팅 된 칼륨 전류는 기록 된 셀을-40 mV를 유지 하는-30mv ~ + 50 mV (10mv 증분)에서 전압 단계 (각각 250 ms 지속 시간)에 의해 유발 됩니다.</li>
	<li>IPSC 유래 두개골과 척추 MNs의 소성 특성을 조사 하는 경우, 전류 클램프 모드에서-70 mV의 멤브레인 전위를 사용 하 고 증가 하는 진폭 (+ 20pa ~ + 80 pA에서 4 개의 전류 펄스)을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>각 셀 전압 활성화 전류를 획득 하 고 전체 셀 커패시턴스 (Cm), 세포 막 저항 (Rm) 및 휴식 막 전위 (RMP)로 서의 소성 활성 및 3 개의 패시브 특성을 유발 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+%28iPSCs%29+derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li>
<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+journal+of+rare+diseases%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS%2Fdementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li>
<li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960(2016).</li>
<li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li>
<li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells%2C+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li>
<li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons%2C+Skeletal+Myocytes%2C+and+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li>
<li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없다.

이 프로토콜은 효율적으로 인간 ipscs를 척추 및 두개골 운동 뉴런으로 변환 하 여 계보 관련 특정 전사 인자의 자 궁 외 발현을 가능 하 게 합니다. 이들 트랜스 유전자는 독 시 사이 클린에 의해 유도성 되 고, piggyBac 전치 자 기반 벡터 덕분에 게놈에 안정적으로 통합 된다. 혼합 된 집단에서, piggyBac 벡터의 하나 또는 여러 사본은 개별 세포의 게놈에 무작위로 통합 될 것이 고, 게놈 완전성 변경의 리스크를 증가 합니다. 더욱이, iPSC 서브 클론의 진보적인 선택은 분화에 대 한 가능한 결과와 질병 및 대조 군 세포 선의 비교 분석을 위해 시간이 지남에 따라 발생할 수 있습니다. 모두, iPSC-유래 MNs이 프로토콜을 얻은 재생 의학에 적합 하지 않습니다. 그러나, 우리의 방법은 생체 외 운동 신경 질환 모델링에 특히 유용 할 수 있다. 주요 강도 지점은 매우 단순화 된 배양 조건, MN 변환의 신속성, iPSC 유래 MNs의 높은 성숙도 및 이전에 입증 된 것 처럼 척추 및 두개골 MNs를 모두 얻을 ...

운동 뉴런 (MN) 변성은 근 위축 성 측 삭 경화 증 (ALS)과 척추 근육 위축 (SMA)과 같은 인간의 질병에서 원인 역할을 한다. 인간 MN의 복잡성을 탈환 하는 적절 한 시험관 내 셀 모델 시스템을 확립 하는 것은 새로운 치료 접근법의 개발을 향한 중요 한 단계 이다. 유도 만능 줄기 세포 (ipscs)는 주목할 만한 복수형 다이 신 분화 특성을 부여 받고 있으며, 이제는 운동 신경 질환1,2에 의해 영향을 받는 많은 환자 로부터 유래 되었다. MN 질환에 관련 된 병원 성 돌연변이를 운반 하는 추가 iPSC 라인은 제어 "건강 한" 만능 줄기 세포 로부터 시작 하 여 유전자 편집에 의해 생성 되었다3. 이들 라인은 MNs로의 iPSC 분화를 위한 적절 한 방법이 제공 되는 경우 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 유용한 도구를 나타낸다. 이 방법의 개발 뒤에 이론적 근거는 성숙한 기능적인 MNs를 초래 하는 빠르고 능률적인 분화 프로토콜을 가진 MN 질병에 관심 있는 과학적인 공동체를 제공 하기 위한 것입니다. 이 방법의 첫 번째 이점은 실행 시간입니다. 또 다른 강도의 포인트는 정제 단계의 제거에서 온다. 마지막으로, 프로토콜은 모터 뉴런의 두 개의 별개의 인구를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
MNs의 다른 특수형을 생성 하는 가능성은 MN 질병의 모형 화를 위해 특히 관련 됩니다. 모든 MN 특수형은 ALS와 SMA에서 동등 하 게 취약 하 그리고 다른 모터 단위에 있는 현상의 개시는 크게 예 후에 영향을 미칩니다. ALS에서, 상부 및 하 부 사지에서 시작 하는 현상에 척추 발병은 약 3-5 년에서 죽음으로 이끌어 냅니다4. 반대로, 두개골 MNs의 변성으로 시작 하는 불 바 발병은 최악의 예 후를가지고 있습니다. 더욱이, 불 바 발병의 비율은 RNA 결합 단백질 인 스와 TDP-43의 돌연변이 환자에서 SOD1 돌연변이를 가진 개인 보다 현저히 높다5. 대체 MN 분화 프로토콜의 총합은 레 틴 산 (RA)의 활동에 의존 하 여 ipscs6,7,8을 차별화 하는 척추 문자를 부여 합니다. 이것은 특정 MN 특수형9,10에서 방어적 일 수 있던 본질적인 요인 연구의 가능성을 제한 합니다.
마우스 배아 줄기 세포 (11)의 이전 작업과 일치 하 여, 우리는 최근에 인간 Ipscs에서 Ngn2, Isl1 및 LHX3 (전무)의 발현이 척추 MN 동일성을 유도 하는 반면 Ngn2 및 Isl1 플러스 PHOX2A (닙)는 두개골 MNs (12)를 지정 하는 것으로 나타났다. 우리는 따라서 효율적인 프로토콜을 개발 하 여 12 일의 턴 어 라운드에서 기능적 특성을 부여 하는 인간 MNs의 생산으로 이끌어 냅니다. 이 방법의 목적은 정제 (예를 들어, FACS)에 대 한 필요 없이 짧은 시간 프레임에서, 척추 또는 두개골 동일성을 가진 MNs에 대해 고도로 농축 된 세포 집단을 구하는 것 이다.

<table><tbody><tr><td>5-Bapta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926-1G</td><td>전기생리학적 솔루션을 위한</td></tr><tr><td>화학물질 Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML&nbsp;</td><td>세포 해리 시약</td></tr><tr><td>안티-챗</td><td>EMD 밀리포어&nbsp;</td><td>AB144P</td><td>항콜린 아세틸전이효소. 면역염색 분석에 사용되는 1차 항체. RRID: AB_2079751; 로트 번호: 2971003</td></tr><tr><td>안티-염소 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>A11055</td><td>immonofluorescence assay에 사용되는 2차 항체. RRID: AB_2534102; 로트 번호: 1915848</td></tr><tr><td>안티-마우스 Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A31571</td><td>immonofluorescence assay에 사용되는 2차 항체. RRID: AB_162542; 로트 번호: 1757130</td></tr><tr><td>anti-Oct4&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>면역염색 분석에 사용되는 1차 항체. RRID: AB_398736; 로트 번호: 5233722</td></tr><tr><td>anti-Phox2b</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-376997</td><td>면역염색 분석에 사용되는 1차 항체. 로트 번호: E0117</td></tr><tr><td>안티-토끼 Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Immunological Sciences</td><td>IS-20152-1</td><td>immonofluorescence assays</td></tr><tr><td>anti-TUJ1에</td> 사용되는 2차 항체;<td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>T2200</td><td>면역염색 분석에 사용되는 1차 항체. RRID: AB_262133</td></tr><tr><td>B27</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-566</td><td>신경 세포 유지를 위한 무혈청 보충제</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>NGE-BB02</td><td>세포 동결 매체, 운동 뉴런 전구 세포에 사용</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-02</td><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td>원핵생물 및 진핵생물에서 단백질 합성을 억제하는 뉴클레오시드 항생제</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2153</td><td>소 혈청 알부민. 면역염색 분석에서 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위한 차단제</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>전기생리학적 솔루션용 화학물질</td></tr><tr><td>Clampex 10 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10</td><td>멤브레인 전류 기록 시스템</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC 인증 Matrix</td><td></td><td>Corning 354277</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 마우스 육종에서 재구성된 기저막 준비. 플라스틱 및 유리 지지대에 iPSC를 접착하는 데 사용</td></tr><tr><td>CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td><td>Biological Industries</td><td>05-710-1E</td><td>인간 iPSC용 동결 매체</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146</td><td>전기생리학적 솔루션용 화학 물질</td></tr><tr><td>DAPI 분말</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>4&prime;, 6-디아미디노-2-페닐린돌. 아데닌&ndash에 결합하는 형광 염색제; DNA에 티민이 풍부한 영역이 있는데, 이는 immonofluorescence assay에서 핵 염색에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>DAPT</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CR1-0016-M005</td><td>감마 분비효소 억제제</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>인간 iPSC의 부드러운 해리를 위한 시약</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421-500ML</td><td>세포 배양을 위한 기초 배지</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G& 주의;</td><td>epB-Bsd-TT-NIL 및 epB-Bsd-TT-NIP 벡터에서 전이유전자 발현을 유도하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>DS2U&nbsp;</td><td>WiCell</td><td>UWWC1-DS2U</td><td>상업용 인간 iPSC 라인</td></tr><tr><td>E.Z.N.A 총 RNA 키트&nbsp;</td><td>Omega bio-tek</td><td>R6834-02</td><td>배양된 진핵 세포에서 RNA를 완전히 추출하기 위한 키트</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-10</td><td>신경교세포 유래 신경 영양 인자</td></tr><tr><td>Gibco Episomal hiPSC 라인</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>상업용 인간 iPSC 라인</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>안정성이 향상된 L-글루타민의 대안. 세포 건강을 개선합니다.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>전기생리학적 솔루션을 위한</td></tr><tr><td>화학물질 iScript 역전사 슈퍼믹스 RT-qPCR용&nbsp;</td>Real-Time qPCR <td></td> iTaqTM Universal SYBR Green Supermix<td>를 사용한 유전자 발현 분석을 위한</td> <td>Bio-Rad</td> 1708841 키트</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>172-5121&nbsp;</td><td>모든 Real-Time PCR 기기에서 염료 기반 정량 PCR(qPCR)에 최적화된 즉시 사용 가능한 반응 마스터 믹스</td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>전기생리학적 용액용 화학물질</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>전기생리학적 용액용 화학물질</td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>LKT Laboratories</td><td>A7210</td><td>세포 배양에 항산화제로 사용</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11243217001</td><td>in vitro에서 신경 세포의 부착 및 성장 촉진</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>올림푸스</td><td>&nbsp; 면역 염색 이미지 획득을 위한 iX83 FluoView1200</td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>전기생리학적 솔루션을 위한 화학물질</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>화학물질 전기생리학적 솔루션을 위한</td></tr><tr><td>화학물질 장착 매체&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>50001</td><td>컨포칼 현미경 검사 및 면역 형광 분석에 사용되는 마운팅 솔루션</td></tr><tr><td>멀티클램프 패치 클램프 증폭기</td><td>분자 장치</td><td>700B</td><td>멤브레인 전류 기록 시스템</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>전기생리학적 솔루션용 화학 물질</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td>전기생리학적 솔루션용 화학 물질</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>비필수 아미노산. 세포 성장과 생존력을 높이기 위해 세포 배양 배지의 보충제로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>네온 100 &mu; L 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>MPK10096세포 전기천공법 키트</td></tr><tr><td>Neon Transfection 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>세포 전기천공법 시스템</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td> 성상세포 공급층 NutriStem-XF/FF 없이 <td>신경 세포 집단의 장기 유지 및 성숙을 위해 설계된 기저 배지</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>인간 iPSC 배양 배지</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>157-8</td><td>면역 염색 분석에서 세포 고정에 사용</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td>Dulbecco의 인산염 완충액 식염수, 칼슘 포함, 마그네슘</td></tr><tr><td>PBS Ca2+/Mg2+ 무료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Dulbecco의 인산염 완충액 식염수, 칼슘 없음, 마그네슘</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 없음&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>페니실린/스트렙토마이신 용액은 박테리아의 세포 배양 오염을 방지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>폴리-오르니틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4957</td>은 <td>체외에서 신경 세포의 부착 및 성장을 촉진</td></tr>합니다. <tr><td>SU5402</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML0443-5MG</td><td>혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2)의 선택적 억제제</td></tr> <tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td>4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜,&nbsp; t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜&nbsp; tert-옥틸페닐 에테르. 면역염색 분석에서 세포 투과화에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51VI</td><td>현미경은 CoolSnap Myo 카메라가 장착된 전기생리학적 기록에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp; (ROCK 억제제)</td><td>엔조 생명과학</td><td>ALX-270-333-M005&nbsp;</td><td>Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK)의 세포 투과성 선택적 억제제. iPSC 생존율 증가</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Well&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>high&ndash 지원; 고정 세포의 현미경 분석 종료</td></tr></tbody></table>

piggybac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (ipscs)의 전환

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

우리는 여기에서 인간 유도 만능 줄기 세포 로부터 기능적 척추 및 두개골 운동 뉴런을 얻는 방법을 설명 한다 (iPSCs). 운동 뉴런으로의 직접 전환은 전사 인자의 대체 모듈, 즉 Ngn2, Isl1 및 Lhx3 (NIL) 또는 Ngn2, Isl1 및 Phox2a (닙)의 자 궁 외 발현에 의해 얻어진 다. NIL과 닙은 각각 척추와 두개골 운동 신경 정체성을 지정 합니다. 우리의 프로토콜은 NIL 또는 닙이 piggyBac 전치 벡터를 통해 게놈에 안정적으로 통합 되는 수정 된 iPSC 라인의 생성으로 시작 합니다. 트랜스 유전자의 발현은 이어서 독 시 사이 클린에 의해 유도 되 고, 5 일 후에, iPSCs를 MN 조상로 전환 한다. 이후 성숙, 7 일 동안, 척추 또는 두개골 MNs의 동종 인구에 이르게. 우리의 방법은 이전 프로토콜에 비해 몇 가지 장점을 보유: 그것은 매우 신속 하 고 단순화; 그것은 바이러스 감염이 나 추가 MN 격리를 필요로 하지 않습니다; 그것은 활동 전위의 기차를 발사 하는 능력에 의해 입증 된 대로, 성숙의 놀라운 학위와 다른 MN 하위 인구 (척추와 두개골)를 생성 할 수 있습니다. 더욱이, 다 수의 모터 뉴런은 혼합 된 집단 으로부터 정제 없이 얻어질 수 있다. iPSC 유래 척추 및 두개골 모터 뉴런은 운동 신경의 근 위축 성 측 삭 경화 증 및 기타 신경 변성 질환의 시험관 내 모델링에 사용 될 수 있다. 균질 한 운동 뉴런 집단은 세포 형 특정 약물 스크리닝을 위한 중요 한 자원을 나타낼 수 있다.

분화 방법에 대 한 개략적인 설명을 도 1에 나타내 었 다. 인체 iPSCs (WT I 라인3)는 epb-유도성 및 엡-닙으로 서,이 하에서 blasticidin 선택에 의해 생성 되 고, 안정적이 고, 그리고이 하 세포 주 (12) 들을 각각에 펙 스-닐 및 ipscs-닙에 의해 서 형질 감염 시켰다. 분화 세포는 다능 성 마커 OCT4 및 범 뉴런 마커 TUJ1의 발현을 특징으로 하였다. 면역 염색 분석은 TUJ1 양성의 부재 하에, 0 일째에 모든 세포에서 OCT4의 균일 한 발현을 나타내 었 다 (도 2A). 셋째 날, 우리는 OCT4 세포의 수에 있는 강한 감소를 관찰 하였으며,이는 iPSCs의 차별화의 하위 집합에서 TUJ1의 발현에 의해 미러링 되었습니다 (그...

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 유도성 piggyBac 벡터에서 전사 인자의 발현에 의해 척추 또는 두개골 정체성을 가진 모터 뉴런으로 신속 하 고 효율적으로 전환 할 수 있습니다.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

운동 뉴런의 다른 특수형을 생성의 가능성은 근위축성 측삭 경화증과 같은 현대 운동 신경 질환을 모델링하는 데 특히 관련이 있습니다. 이 방법은 짧은 시간 프레임과 정화 단계없이 척추 또는 두개골 정체성을 가진 운동 뉴런에 대해 매우 경직된 세포 집단을 획득 할 수 있습니다. 단순화된 배양 조건 하에서 유도된 만능 줄기 세포 또는 iPSC로부터 인간 모터 뉴런의 생성은 운동 신경 질환에 대한 약물 스크리닝을 용이하게 할 수 있다.프로그래밍 전사 인자의 유도식 발현은 iPSC 리포지토리로부터 뉴런, 골격 근 및 신경교 세포와 같은 다른 세포 유형을 생성하는 데 사용될 수 있다. NIL 및 NIP iPSC 라인 생성의 경우, 37°C에서 5~10분 동안 세포 해리 시약으로 세포를 치료하기 전에 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 인간 iPSC 배양을 헹구는 다. 세포가 배양 용기에서 분리되기 시작하면 P1000 파이펫을 사용하여 세포를 3~4회 부드럽게 수동으로 분리합니다.세포를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 칼슘과 마그네슘없이 신선한 PBS로 최종 볼륨을 최대 10 밀리리터까지 가져 오십시오. 원심분리에 의해 10-6세포를 1회 수집하고 전기기 키트로부터 완충 R의 100마이크로리터에서 펠릿을 재보펜한다. 트랜스포지션 벡터 플라즈마 DNA 4.5 마이크로그램과 피기박 트랜스포사제 플라즈마 DNA0.5 마이크로그램을 추가하여 트랜스페션을 생성합니다.표시된 매개 변수를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 전기 포기 시스템을 가진 트랜스펙트. 그런 다음, 인간 iPSC 배지에서 세포를 6mm 매트릭스 코팅 접시에 10 마이크로몰러 ROCK 억제제 Y-27632로 보충하였다. 이식 후 이틀, 세포가 이식되지 않은 세포를 반성하기 위해 적어도 7-10 일 동안 항생제에 세포를 유지하는 배양 배지에 블라스티시딘의 밀리리터 당 5 마이크로그램을 추가합니다.인큐베이션의 끝에서, 다른 수의 트랜스유전자및 상이한 통합 사이트 또는 분리 단일 클론을 가진 세포로 구성된 혼합 된 집단으로서 안정적으로 전이된 세포를 유지한다. 앞서 설명한 바와 같이 신경게닌-2에 대한 트랜스진 특이 프라이머를 가진 RT-PCR에 의해 평가될 독시사이클린 유도의 밀리리터 당 1 마이크로그램당 트랜스게인의 효과적인 발현을 허용하는 추가 접시를 준비한다. 이 단계에서, 소설 NIL및 NIP iPSC 라인의 주식도 인간 iPSC에 대한 동결 매체에서 동결되어야한다.모터 뉴런 분화의 경우, DMEM/F12 배지의 5부량을 포함하는 15밀리리터 튜브에서 세포를 수집할 수 있도록 입증된 바와 같이 해리 시약으로 안정적으로 전이된 세포 배양을 해리한다. 원심분리 후, 계수를 위한 마이크로몰라 ROCK 억제제로 보충된 인간 iPSC 배지에서 세포를 재중단한다. 매트릭스 코팅 된 접시에 세포를 씨앗 6.25 시간 10 제 4 세포 센티미터 제곱 밀도.다음 이틀 동안, 초자연적 인 분화 매체로 대체 독시 사이클린으로 보충. 둘째 날에는 감마 분비 효소 억제제, 혈관 내피 성장 인자 수용체 억제제 및 독시실린으로 보충된 신경 물질 B27 배지로 배지를 변경합니다. 5일째에, 입증된 바와 같이 세포를 분리하고 계고를 위해 DMEM/F12 배지의 4밀리리터에서 분리된 세포를 다시 중단한다.피펫팅은 셀의 완전한 해리에 중요합니다. 제조업체의 지시에 따라 세포 동결 배지에서 운동 뉴런 전조의 알리쿼터를 동결하고 원심분리에 의해 나머지 세포를 수집합니다. 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제로 보충 된 신경 매체에서 펠릿을 다시 중단하십시오.폴리오니틴 라미닌 코팅 마이크로슬라이드에 세포를 10번 10번 에서 5분의 1의 제곱밀도로 파종한다. 6일째에는, 지지 표면에서 세포를 분리하지 않고 다운스트림 분석까지 배양억제제 없이 배지를 신선한 뉴런 배지로 신중하게 교체한다. 분만성 마커 옥타머 결합 전사 인자 4 또는 OTC4의 균일한 발현은 팬 뉴런 마커 뉴런 특이적 클래스의 부재시 0일 제로에 세포 배양을 분화하여 3개의 베타-튜툴린 TUJ1 양성성을 관찰할 수 있다.셋째 날에는 OCT4 양성 세포의 수가 크게 감소하는 것이 분명합니다. 즉, 차별화 된 iPSC의 하위 집합에서 TUJ1의 표현에 의해 미러링됩니다. 5일째에는 TUJ1의 일관된 발현과 획득한 뉴런 형태에 대한 일관된 발현을 보여주는 인구에서 OCT4의 발현이 관찰되지 않는다.면역염색 분석 7일 후 운동 뉴런 전구 세포의 투석 후 TUJ1 및 성숙한 운동 신경 마커 콜린 아세틸 트랜스퍼라아제의 균일한 발현을 드러낸다. iPSC NIL 유래 뉴런은 전압에 의존하는 나트륨 전류와 전압 의존성 칼륨 전류를 성공적으로 표시합니다. 현재 클램프 양면에 고정된 iPSC NIL 유래 모터 뉴런의 80%는 현재 펄스60피쿠앰프 이상을 주입할 때 스파이크 트레인을 발동할 수 있다.기록된 세포의 50% 이상에서 반복발사를 유도하는 데 필요한 최소 전류는 약 마이너스 38밀리볼트의 스파이크 임계값과 평균 발사 빈도가 약 8헤르츠의 40피코프를 더한 40피코프를 더한 40개의 피코암프를 더한 플러스40피콥스이며, 이는 iPSC NIL 유래 척추 운동 뉴런이 성숙한 뉴런의 전형적인 기능적 특성을 나타낸다는 것을 시사한다. 척추 및 두개골 운동 뉴런은 병리학적 돌연변이를 운반하는 제어 된 iPSC 또는 iPSC에서 파생 될 수 있으며 이러한 세포는 약물 검사 모델로 또는 약물 스크리닝을 위해 사용될 수 있습니다. 우리의 방법은 다른 모터 뉴런 유닛이 ALS에 의해 차별화적으로 영향을받는 이유를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

conversion-human-induced-pluripotent-stem-cells-ipscs-into-functional

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

이 비디오는 계통 특이적 전사 인자의 이소성 발현에 의해 PiggyBac 전이 시스템으로 인간 iPSC를 transfection하여 운동 뉴런을 생성하는 절차를 보여줍니다.

인간 iPSC에서 PiggyBac Transposon-매개 유전자 편집: PiggyBac Transposon 시스템을 사용하여 인간 iPSC에 관심 유전자를 통합하는 절차

이 비디오는 인간의 iPSC를 운동 뉴런으로 분화하는 과정을 보여줍니다. 그 이유는 특정 전사 인자를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 iPSC를 활용하는 것입니다. 독시사이클린을 함유한 배지에서 배양하면 이 항생제는 전사 인자의 발현을 유발하여 운동 뉴런 전구체로의 iPSC 분화를 촉진합니다. 궁극적으로, 전구 세포는 성숙하고 기능적인 운동 뉴런을 생성하기 위해 뉴런 배지에서 배양됩니다.

공학적 인간 유도 만능 줄기세포를 기능적 운동 뉴런으로 분화시키기

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

이 기사에서는 벤치탑 3D 현탁액 바이오리액터에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

배우세요 PiggyBac 벡터를 활용한 iPSC에서 척추 및 두개골 운동뉴런으로의 신속한 분화 방법. 이 기술은 ALS 등 운동뉴런 질환 모델링과 약물 스크리닝을 가속화합니다.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

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