Name: 쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 배우세요 갑상선암 연구를 위한 마우스 이동이식 및 정위적 모델에서 microRNA 억제제를 활용한 생체 내 치료법을 검증하는 방법을. 이 기법은 새로운 항암 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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우리는 라켈 아로차 리스코가 쥐의 치료와 치료에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 박사 J. 블랑코 (사전 화학-CSIC카탈로니아 연구소)와 박사 E. 마토 (인스티투트 드 레세르카 드 l'병원 드 라 산타 크루 i 산트 파우) 바르셀로나 (스페인) CMV-반딧불 luc-IRES-EGFP와 Cal62-Luc 세포를 선물에 대한 각각 감사합니다.

동물 실험은 유럽 공동체 법 (86/609 / EEC) 및 스페인 법 (R.D. 1201/2005)에 따라 수행되었으며, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, 스페인)의 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 세포의 측면 접종 및 종양 내 antagomiR 치료
<ol><li>세포 준비
	<ol>
<li>Cal62 인간 갑상선 암 세포주(KRASG12R 및 p53A161D 돌연변이)를 설계하여 GFP와 루시퍼라아제(CMV-반딧불 Luc-IRES-eGFP)를 구성적으로 표현하는 형질전환 구조를 과발현합니다. 항생 저항에 의해 또는 유세포측정으로 GFP 양성 세포를 분류하여 형질전환 세포를 선택합니다.</li>
		<li>37°C 및 5% CO2에서 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 세포를 성장시킨다.</li>
		<li>4 °C에서 인산완충식염수(PBS)의 50 μL에서 1 x 106 세포를 일시 중단합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스의 측면에 세포 접종
	<ol>
<li>동일한 양의 지하 멤브레인 매트릭스로 세포를 혼합합니다. 예를 들어, PBS 50 μL에 1 x 106 셀을 50 μL의 지하 멤브레인 매트릭스를 추가하고 부드럽게 섞습니다. 참고:</li>
		<li>27G 1/2'(0.4x13 mm) 바늘로 1 mL 인슐린 주사기를 사용하여 6주 된 면역 결핍 BALB/c nu/nu 마우스의 왼쪽 측면에 시료(PBS + 지하 막 매트릭스의 세포)의 100 μL을 피하주사한다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 내 안타미R 치료.
	<ol>
<li>RNase가 없는 증류수의 500 μL에서 안타고미R(재료 표참조) 또는 음의 제어를 일시 중단합니다.</li>
		<li>주사 전에, 각 주사에 대해 생체 내 전달 시약(재료 표참조)과 함께 안아고미R 또는 대조군 2 nmol을 준비한다.<ol>
<li>먼저 안타고미R 용액(재료 표참조)과 복합 버퍼(재료 표참조)를 1:1 비율로 혼합합니다. 예를 들어, 80 μL의 miRNA 억제제 용액(16 nmol)을 80 μL의 복합화 완충제(생체 내 전달 시약 키트에 포함됨, 재료 표참조)를 첨가한다.</li>
			<li>생체 내 전달 시약을 실온으로 가져옵니다. 1.5 mL 튜브에 160 μL을 추가하고 즉시 희석 된 antagomiR 용액 160 μL을 추가하십시오. 남은 시약을 -20°C로 되돌려 보라고 합니다. 필요한 경우, 시약을 해동 후 최대 1주일 동안 4°C에서 보관하십시오.</li>
			<li>소용돌이(10초)는 생체 내 시약-안타미R의 복합화를 보장한다.</li>
			<li>50°C에서 30분 동안 생체 내 전달 시약-안타고미R 혼합물을 배양한다. 샘플을 회수하기 위해 튜브를 잠시 원심분리합니다.</li>
			<li>PBS pH 7.4의 1360 μL을 추가하여 복잡한 것을 6배 희석시키고 잘 섞는다.</li>
			<li>시약-안타고미R 복합체(8 마우스/상태)의 생체 내 전달을 진행하거나, 주입 전 최대 1주일 동안 4°C에서 복합체를 저장한다. 각 종양에 종양 내 200 μL을 주입하십시오 (안타고미R 의 2 nmol). 참고 : 안타고미R의 부피와 양은 종양 부피와 독립적입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>매주 3회(월요일, 수요일, 금요일)에 2주 동안 치료를 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 성장 분석
	<ol>
<li>D-luciferin 기판의 40 mg/mL 용액 50 μL을 27G 1/2'(0.4 mm x 13mm) 바늘로 1 mL 주사기로 각 시점에서 피하적으로 주입합니다. <ol>
<li>8 분 주입 후, 산소와 혼합 3% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취. 페달 반사 (단단한 발가락 핀치)에 의해 마취의 수준을 평가하고 수술 평면을 유지하기 위해 적절하게 마취 전달을 조정합니다.</li>
			<li>건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 바르고 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>생체 내 이미징 소프트웨어로 생물 발광 신호를 이미지화합니다(재료 표참조). 참고: 캘리퍼스는 또한 종양 부피 및 종양 성장을 측정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
</li>
		<li>생물 발광 신호가 수득되면, 두 치료법을 비교하는 종양 성장을 분석하고 t-test를 사용하여 유의성을 결정한다. 그룹 내 분산을 분석하려면 SEM을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 절제
	<ol>
<li>antagomiR 처리의 끝 후에 7 일, 마우스를 희생하고, 종양을 절제하고 미래 분석을 위한 단백질 및/또는 RNA를 추출하십시오. 양자택일로, 종양을 단면도하고 면역성 화학을 위해 그(것)들을 고쳐.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 세포의 갑상선 정형접종 접종 및 전신 안아고미R 치료
<ol><li>세포 준비
	<ol>
<li>Cal62 인간 갑상선 암 세포주 설계를 통해 GFP와 루시퍼라제를 구성적으로 표현하는 형질전환 구조를 과발현합니다. 항생 저항에 의해 또는 유세포측정으로 GFP 양성 세포를 분류하여 형질전환 세포를 선택합니다.</li>
		<li>항생제 (페니실린 및 연쇄상 구균)와 37 °C 및 5 % CO2에서 10 % FBS로보충 된 DMEM에서이 세포를 성장시다.</li>
		<li>PBS의 5 μL에서 1 x 105 세포를 일시 중단합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스의 갑상선으로 세포 접종
	<ol>
<li>진통 (buprenorphine) 및 항생제 (세팔로스포린)의 100 μL을 7 주 된 BALB / c nu/nu 마우스에 피하적으로 주입하십시오. 알코올로 주사 부위를 소독하십시오.</li>
		<li>세포 용액의 5 μL을 마우스의 갑상선에 주입하십시오.<ol>
<li>산소와 혼합 된 3 % 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고 멸균 흐름 캐비닛에 입체 현미경 아래에 놓습니다.  페달 반사 (단단한 발가락 핀치)에 의해 마취의 수준을 평가하고 수술 평면을 유지하기 위해 적절하게 마취 전달을 조정합니다.</li>
			<li>건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 바르고 있습니다.</li>
			<li>각 마우스에 대해, iodopovidone로 목을 소독하고 가위로 피부에 약 2cm의 절개를합니다. 일단 열리면, 침샘을 치수하여 목을 노출시소.</li>
			<li>해부 집게 및 / 또는 가위를 사용하여 스트랩 근육을 해부하여 기관및 갑상선을 노출시하십시오. 10 μL 마이크로리터 주사기를 사용하여 5 μL의 세포 용액을 오른쪽 갑상선 소엽에 주입하고, 크리코이드 연골의 측면에 위치한다.</li>
			<li>타액선을 재배치하고 편조, 코팅, 흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 실크로 절개를 봉합하십시오.</li>
			<li>상처 부위에 iodopovidone을 추가하고 마취에서 회복하는 동안 열 담요에 마우스를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음 날 수술 후, 피하 진통제 (buprenorphine)를 주입하고 액체 이부프로펜의 3 mL를 추가 (40 mg / mL) 에 250 1 주 동안 식수의 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>전신 안타미R 치료 참고 : 생물 발광 신호가 감지 될 때 세포 주입 후 2-3 주 후에이 단계를 수행하십시오.<ol>
<li>증류된 RNase 가 없는 물에 안타고미R 또는 음의 제어를 중단합니다.</li>
		<li>주사 전에, 각 주사에 대한 생체 내 전달 시약과 함께 안타고미R 또는 대조구의 7 nmol을 준비한다.<ol>
<li>안타고미R 및 생체내 전달 시약 용액 제제의 경우 마우스당 miRNA 억제제의 7nmol을 첨가하지만 단계 1.3을 참조한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>마우스의 정맥 부비동의 레트로 궤도 주입에 의해 정맥 내 용액을 투여하십시오. 마취를 유도하기 위해 이소플루란을 사용하십시오. 참고 : 페달 반사 (단단한 발가락 핀치)로 마취 수준을 평가하십시오.</li>
		<li>마우스를 일주일에 3회(월요일, 수요일 및 금요일)에서 2주 동안 치료합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 성장 분석
	<ol>
<li>종양 성장을 계산하기 위해 매주 두 번 종양 생물 발광 신호를 결정합니다.<ol>
<li>피하 주사를 통해 각 시점에서 D-luciferin 기판의 40 mg/mL 용액의 50 μL을 주입하십시오.</li>
			<li>8 분 주입 후, 산소와 혼합 된 3 % 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고 생체 내 이미징 소프트웨어로 생물 발광 신호를 이미지화합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>생물 발광 신호가 수득되면, 두 치료법을 비교하는 종양 성장을 분석하고 t-test를 사용하여 유의성을 결정한다. 그룹 내 분산을 분석하려면 SEM을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 절제
	<ol>
<li>antagomiR 처리 기간이 끝난 후 7일 후에, 마우스를 희생시키고, 종양을 절제하고, 향후 분석을 위해 단백질 및/또는 RNA를 추출한다. 양자택일로, 종양을 단면도하고 면역성 화학을 위해 그(것)들을 고쳐.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+Thyroid+Cancer+Incidence+and+Mortality+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).</li>
<li>Landa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+hallmarks+of+poorly+differentiated+and+anaplastic+thyroid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).</li>
<li>Gregory, R. I., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+biogenesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA biogenesis and cancer.</a> Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).</li>
<li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li>
<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as oncogenes.</a> Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Reserch Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+characterization+of+papillary+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma.</a> Cell. 159 (3), 676-690 (2014).</li>
<li>Li, Z., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+microRNAs%3A+current+status+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).</li>
<li>Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+microRNA+expression+in+thyroid+neoplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).</li>
<li>Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+thyroid+development%2C+function+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).</li>
<li>Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Deregulation+in+Anaplastic+Thyroid+Cancer+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 743450(2014).</li>
<li>Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+Tumours%3A+Advances+in+the+molecular+pathogenesis+of+thyroid+cancer%3A+lessons+from+the+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome.</a> European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).</li>
<li>Riesco-Eizaguirre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-146b-3p%2FPAX8%2FNIS+Regulatory+Circuit+Modulates+the+Differentiation+Phenotype+and+Function+of+Thyroid+Cells+during+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis.</a> Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).</li>
<li>Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA-146b-5p+upregulates+migration+and+invasion+of+different+Papillary+Thyroid+Carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 16, 108(2016).</li>
<li>Lee, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-222+and+microRNA-146b+are+tissue+and+circulating+biomarkers+of+recurrent+papillary+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer.</a> Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-146b-5p+promotes+metastasis+and+induces+epithelial-mesenchymal+transition+in+thyroid+cancer+by+targeting+ZNRF3.+Cellular+Physiology+and+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry.</a> International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).</li>
<li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-146b+promotes+PI3K%2FAKT+pathway+hyperactivation+and+thyroid+cancer+progression+by+targeting+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN.</a> Oncogene. , (2018).</li>
<li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+microRNA+processing+by+DICER1+downregulation+endows+thyroid+cancer+with+increased+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness.</a> Oncogene. , In press (2019).</li>
<li>Xing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+mechanisms+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 논문은 종양 개시 및 진행에 대한 그것의 역할, 갑상선암의 치료 표적으로서의 잠재력을 더 잘 이해하기 위해 miRNA의 생체 내 기능을 연구하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 종양 이종이식 모델은 그들의 생물 발광 신호에 의해 추적될 수 있는 세포의 사용에 기초하며, 치료의 영향하에 생체 내에서 종양 성장의 측정을 허용한다. 또한, 우리는 갑상선 암에 대한 miRNA 기반 치료의 사용을 설명, 이는 초기 단계에 현재.
우리는 먼저 갑상선 종양 세포가 면역 결핍 마우스의 측면에 주입된 피하 이종이식 모형을 사용하여 치료 표적으로 miRNA의 타당성을 시험했습니다. 우리는 그 때 종양 내 안아고미R를 주사했습니다. 이 모델은 인간 암 세포에서 생체 내에서 특정 miRNAs 또는 oncomiRs의 중요성을 테스트하기 위해 여러 암 유형을 위해 사용될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 최소한의 동물 고통으로 수행하기가 비교적 간단하고 또한 빠르다는 것입니다. 기술의 주요 단점은,...

갑상선암은 부각이 증가하는 내분비 악성종양이지만, 일반적으로 좋은결과를 가지고 있지만 1. 그럼에도 불구하고 일부 환자는 치료할 수없는 질병의 공격적인 형태를 개발하고 분자 기지는 제대로 이해되지않습니다2.
miRNA는 많은 조직에서 유전자 발현을 조절하는 22-뉴클레오티드-긴 비코딩 RNA이며, 일반적으로 표적 메신저 RNA(mRNA)의 3' 비번역 영역(3'UTR)에 염기 쌍 결합에 의해 mRNA 분해 또는 번역 억압을 유발합니다. 3개 , 4.마이크로RNA 발현의 규제 완화가 암의 특징임을 보여주는 증거가 증가하고 있는데, 이러한 분자는 증식 신호, 이동, 침입 및 전이를 조절하고 세포 사멸에 대한 저항성을 제공할 수 있습니다. 5,6. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 암 진단 및 예후뿐만 아니라 치료 대상7에대한 잠재적 인 바이오 마커로 miRNAs를 확인, 암 평가 및 치료에 새로운 차원을 제공.
miRNAs는 인간 갑상선 종양학의 핵심 동인으로 인간 분자 종양학의 중심 무대를 취했습니다 8,9,10,11,12. miRNAs 상이 조절 중, miR-146b는 유두 갑상선 암종 (PTC) 종양에서 높게 발현되고 세포 증식을 현저하게 증가시키고, 공격성과 음침한 예후와 연관되는 것으로 나타났다6, 12세 , 13세 , 14세 , 또한,miR-146b는 분화12에관여하는 여러 갑상선 유전자를 조절하고, 또한 PTEN16 및 DICER117과같은 중요한 종양 억제 유전자를 조절한다. 암 생물학에 있는 그들의 중요성에도 불구하고, miRNA 기지를 둔 암 치료는 아직 초기 단계에 있고, 아주 몇몇 연구 결과는 갑상선암을 해결했습니다 - 내분비 종양의 가장 빈번한18. 여기서 우리는 인간 유래 종양을 가진 2개의 상이한 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 기술하며, 여기서 세포 miRNA를 특이적으로 억제하는 합성 miRNA 억제제(antagomiR)를 투여하면 종양 성장을 차단할 수 있다. 먼저 일반적인 이종이식 모델을 사용하였고, 안아고미R의 국소 종양 투여는 종양 발광의 감소로측정된 종양 성장 감소(16). 인간 종양 진행을 모방한 견고한 마우스 모델의 확립은 독특한 치료 접근법을 개발하는 데 필수적이기 때문에, 원발성 인간 종양의 정형화 이식은 신약의 임상 적 검증을 위한 보다 더 가치 있는 플랫폼입니다. 피하 이식 모델. 따라서, 안아고미R의 치료 잠재력을 더 잘 평가하기 위해, 우리는 혈류에서 전신 전달을 가진 직교 마우스 모델을 사용하여 동일한 결과를 얻었다.

<table><tbody><tr><td>AntagomiR: mirVana miRNA 억제제</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464088</td><td>In Vivo Ready</td></tr><tr><td>Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration</td><td>Corning</td><td>#354248</td><td></td></tr><tr><td>DICER 항체</td><td>Abcam</td><td>ab14601</td><td>IHQ: 1/100</td></tr><tr><td>In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>IVF3005</td><td></td></tr><tr><td>In vivo 이미징 소프트웨어: IVIS-Lumina II 이미징 시스템</td><td>캘리퍼 생명 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>음성 대조군: mirVana miRNA 억제제, 음성 대조군 #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464077</td><td>In Vivo Ready</td></tr><tr><td>PCNA 항체</td><td>Abcam</td><td>ab92552</td><td>WB: 1/2,000</td></tr><tr><td>PTEN 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7974</td><td>WB: 1/1,000</td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - K+ 염 생물 발광 기판</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>PBS에 희석</td></tr></tbody></table>

쥐에서 종양 성장을 감소 하는 microrna의 생체 내 억제

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MicroRNAs (miRNAs)는 mRNA를 불안정하게 하고 표적 mRNA의 번역을 억제하는 그들의 기능을 통해 유전자 발현의 중요한 레귤레이터입니다. 점점 더 많은 연구가 miRNAs를 암 진단 및 예후를 위한 잠재적인 바이오마커로, 또한 치료 표적으로 확인하여 암 평가 및 치료에 추가 차원을 추가했습니다. 갑상선암의 맥락에서, 종양 발생은 중요한 유전자의 돌연변이뿐만 아니라 많은 miRNAs의 과발현에서 발생합니다. 따라서, 갑상선 유전자 발현의 조절에서 miRNA의 역할은 암에서 중요한 기전으로서 진화하고 있다. 본 명세서에서, 우리는 인간 종양 이종이식 및 직교 마우스 모델을 사용하여 갑상선암에서 치료 적 양상으로서 miRNA 억제제 전달의 효과를 검사하는 프로토콜을 제시한다. GFP와 luciferase를 발현하는 안정된 갑상선 종양 세포를 공학한 후에, 세포는 종양을 개발하기 위하여 누드 마우스로 주입되고, 생물 발광에 선행될 수 있습니다. miRNA의 생체 내 억제는 종양 성장을 감소시키고 miRNA 유전자 표적을 업조절할 수 있다. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 것 외에도 생체 내에서 결정된 miRNA의 중요성을 평가하는 데 사용될 수 있다.

우리는 miRNA의 중화가 종양 성장을 억압할 수 있었다는 것을 결정하기 위하여 2개의 다른 마우스 모형을 이용했습니다. 따라서, 인간 종양 갑상선 Cal62-luc 세포는 피하적으로 누드 마우스의 측면에 주입되어 제노그래프 모델을 생성하였다. 2 주 후에 종양이 확립되었고 캘리퍼스로 측정 될 수 있었습니다. 그 시점에서, 마우스는 miR-146b 억제제, 또는 적절한 대조군으로 종양 내로 주입되었고, 종양 부피는추가로 2주 동안 뒤따랐다(도 1A). 도 1B에도시된 바와 같이, miR-146b-억제제(anti-146b)(n=8)로 종양 내 주입된 종양의 성장은 음성 대조군(n=4) 또는 식염수 대조군(n=4)에 대하여 유의하게 억제되었다(도시되지 않음). miRNA는 몇몇 표적 mRNA를 통제하기 때문에 유전자 규칙의 중요한 특징입니다. 따라서, 온코미어는 종양 억제 유전자의 중요한 조절제이다. 이 프로토콜은 miRNA ...

이 프로토콜은 마이크로RNA 기반 억제제 치료를 테스트하는 플랫폼으로서 인간 갑상선 종양발생의 이종이식 및 정형외 마우스 모델을 설명합니다. 이 접근법은 비코딩 RNA의 기능과 새로운 치료 표적으로서그들의 잠재력을 연구하는 데 이상적입니다.

쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

갑상선암 모델의 마이크로RNA 억제제에 기반한 첫 번째 치료법을 수행합니다. 이 개발 치료는이 질병의 치료에 대한 약속을 보여줍니다. 이러한 유형의 직교 형 모델, 치료 전달의 전신 경로를 사용하여, 새로운 microRNA 기반 약물의 검증을 용이하게.우리는 마우스 갑상선에 인간 갑상선 암세포를 이식하기 위한 직교 모형을 사용하더라도, 이 모형은 그밖 암 모형을 위한 모든 체계일 수 있었습니다. 줄리아 라미레즈-모야와 아드리안 아쿠나와 함께 절차를 시연하는 것은 라켈 아로샤 리스코입니다. 그녀는 우리 연구소의 기술자입니다.CAL-62 인간 갑상선 암 세포주 불완전배지를 확립한 후, 1회 10~6세포 알리코트에서 PBS 50마이크로리터에서 4도의 마이크로리터를 중단하고, 세포를 동일한 부피의 지하막 매트릭스와 혼합한다. 27 게이지 반인치 바늘을 장착한 1 밀리리터 주사기에 세포를 적재하고 6주 된 면역 결핍 밸브 C 누드 마우스의 왼쪽 측면에 샘플 100 마이크로리터를 피하로 주입합니다. 주입 후 2 주, 1 점 5 밀리 리터 튜브에 생체 내 실온의 160 마이크로 리터에 antagomiR 또는 제어 처리 완충액을 추가합니다.그리고 혼합물의 복합성을 보장하기 위해 즉시 10 초 동안 용액을 소용돌이. 50도에서 30분 동안 치료 용액을 배양하고 마이크로 원심분리기에서 간단한 원심분리기를 제공합니다. 그런 다음, 퇴적처리복합체를 신선한 PBS와 철저한 혼합으로 6배 희석한다.그리고 종양에 직접 치료의 전체 200 마이크로 리터 볼륨을 주입. 리터 당 40 밀리그램의 마이크로리터 50 마이크로리터를 일주일에 2번 피하하여 각 실험 동물에 주입합니다. 이소플루란 마취 후 발가락 핀치에 대한 응답의 부족을 확인합니다.생체 내 생물 발광 이미징 시스템의 챔버에 동물을 배치하고 표준 프로토콜에 따라 생체 내 이미징 소프트웨어로 생물 발광 신호를 이미지화합니다. 그런 다음 종양 성장을 분석합니다. 치료 모두 비교 하 고 T 테스트를 사용 하 여 중요성과 성장 차이 결정.직소 갑상선 종양 세포 접종의 경우 PBS의 5 마이크로 리터에서 CAL-62 세포의 알리쿼트를 중단하고, 7 주 된 판막 C 누드 마우스에 진통제 의 100 마이크로 리터와 100 마이크로 리터를 피하로 주입합니다. 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하다는 것을 확인한 후, 동물을 해부현미경 아래에 놓고 동물의 목을 요오도포비달로 소독한다. 다음으로, 피부에 약 2센티미터 절개를 하고 침샘을 변위하여 목을 드러낼 수 있습니다.해부 집게 및/또는 가위를 사용하여 스트랩 근육을 해부하여 기관지와 갑상선에 노출시키고 10 마이크로리터 주사기를 사용하여 크리시드 연골 측면에 위치한 오른쪽 갑상선 소리에 종양 세포의 5 마이크로리터 양을 주입합니다. 모든 세포가 전달되면 침샘 을 재배치하고 실크 브레이드, 코팅, 흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 절개를 닫습니다. 그런 다음 상처 부위에 요오도포비도네를 적용하고 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 더믹 담요에 놓습니다.갑상선 세포 주입 후 2~3주 후, 입증된 바와 같이 치료 용액을 준비하고, 마취된 갑상선 종양 베어링 동물의 정맥 부비동의 레트로 궤도 주입에 의해 정맥 내용액을 전달한다. 본 대표적인 실험에서, 종양의 성장은 마이크로RNA 146B 억제제 없이 종양내 주입, 음의 대조군에 대하여 현저하게 억제되었다. 일부 증식 마커의 종양 내 발현 수준은 또한 낮은 수준에서 관찰되었다, antagomiR 처리 종양에서, 대조 종양에 비해.또한, 마이크로 RNA 표적의 회수는 종양 추출 RNA, 또는 단백질의 분석을 통해 연구될 수 있다. 개별 적인 micro RNA의 생체 내 억제가 효과적이고 갑상선 암 처리를 위해 치료적으로 이용될 수 있다는 것을 전체적으로 밝히는. 입증된 바와 같이 마우스에서 확립된 갑상선 종양의 조직학적 분석은 종양 조직의 갑상선 여포 아키텍처를 드러내며 종양을 둘러싼 상피 세포에 대한 염색을 허용합니다.특히, microRNA 146B 억제제의 정맥 주사는 확립된 종양으로, 대조군 처리된 동물에 비해 종양 부피가 현저히 감소하는 결과를 낳는다. 또한, 1차 종양에서 새로 설명된 미생물RNA 146B 표적 DICER1의 발현은 항마이크로RNA 146B 치료 후 증가하고, 인성 마이크로 RNA 발현의 억제 가능성을 더욱 강조하고 따라서 갑상선암에서의 치료제로서 표적 유전자의 복원을 강조한다. 이 기술, 그리고 후속 리핀 결과, 갑상선암의 처리를 위한 비 경화 RNA에 근거를 둔 새로운 치료를 탐구의 가능성을 열어.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

대상 아이디 라이브러리 miRNA 목표를 식별하는 데 사용 복제된 cDNA의 플라스미드 기반의 게놈 전체 모음입니다. 여기는 이용 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

이 비디오는 정소성 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 치료제로서 miRNA 억제제의 생체 내 전달을 보여줍니다. 합성 miRNA 억제제 또는 antagomiR의 종양 내 투여는 내인성 miRNA와 결합하고 억제할 수 있도록 하여 mRNA 상향 조절 및 종양 성장 억제를 유발합니다.

miRNA 억제제를 사용한 종양내 치료 모델링: 쥐 모델에서 종양 성장에 대한 miRNA 억제제의 효과를 분석하는 방법

이 비디오는 갑상선암 세포를 마우스 모델의 갑상선에 orthotopic 접종하는 절차를 설명하며, 이는 발암을 평가하고 잠재적인 치료 전략을 발견하기 위한 귀중한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.

Orthotopic Inoculation of Thyroid Cancer Cells into Murine Thyroid: A Procedure to Establish Orthotopic Thyroid Cancer Mouse Model(쥐 갑상선암에 갑상선암 세포의 정소성 접종: 정소성 갑상선암 마우스 모델 수립 절차)

조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.

Vivo에서 심장 관련 예측에 관한-스폰지의 Nanovector 납품

miRNA 치료제 암 진행을 조절에 상당한 잠재력이 있다. 여기 설명 분석 접근 사용 된다 세포 주기 및 신생 중단 조합 미르 치료의 활동의 식별을 위해.

조합 미르 세포 주기 조절 및 신생 치료의 분석

이 프로토콜은 프로브 기반 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석, 3' 번역되지 않은 영역(3' UTR) 클로닝 및 루시퍼라제 분석제를 사용하여 관심 있는 miRNA의 표적 유전자를 확인하고 miRNA의 기능을 이해합니다.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

여기에서는 동물 모델에서 RNA 올리고머를 운반하는 자성 산화철 나노입자를 전이성 유방암으로 생체 내 전달하기 위한 프로토콜을 설명하여 발암성 핵산의 치료적 침묵을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공합니다.

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

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새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

낮은 분야 (L-밴드, 1.2 g h z) 전자 상자성 공명 녹는 nitroxyl 및 trityl 프로브를 사용 하 여 유방암의 마우스 모델에서 종양 microenvironment에 생리 적으로 중요 한 매개 변수 평가 대 한 시연입니다.

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

배우세요 갑상선암 연구를 위한 마우스 이동이식 및 정위적 모델에서 microRNA 억제제를 활용한 생체 내 치료법을 검증하는 방법을. 이 기법은 새로운 항암 치료 전략 개발에 활용됩니다.

쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제

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