혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용
2019년 8월 20일
여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.
이 프로토콜은 사람들이 다른 유체 전단 응력 하에서 내피 세포 형태와 영역에서 분자의 발현을 분석하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 상이한 유체 전단 응력 하에서 혈관 내피 세포의 직접적인 평가를 제공한다는 것입니다. 이 절차를 수행 할 때, 주요 단계는 갓 준비 파라 포름 알데히드를 사용하고 좋은 관류를 수행하는 것입니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 12주 된 C57BL/6 마우스의 마취로 이 절차를 시작합니다. 꼬리를 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 마우스의 발을 접착제 테이프로 종이 타월 더미에 테이프로 테이프로 놓습니다.
마우스의 피부를 집게로 잡고 복부에서 흉부 꼭대기까지 가위로 피부를 자른다. 날카로운 가위로 흉곽 아래복을 엽니다. 흉골을 집게로 들어 올리고 다이어프램을 자른다.
그런 다음 흉곽을 잘라 흉부 구멍을 노출합니다. 가위로 간 바로 위에 있는 베나 카바를 잘라냅니다. 압력은 5 분 동안 동맥 나무를 pererle, 폐와 간 창백해질 때까지, 왼쪽 심실을 통해, 밀리리터 헤파린 당 40 단위를 포함하는 미리 차가운 정상 식염수와.
그런 다음 PBS에서 4 분 동안 미리 냉각 된 4 % 파라 포름 알데히드와 함께 퍼퓨즈하십시오. 대자가 노출 될 때까지 모든 근육, 장기 및 지방을 제거하십시오. 해부 현미경 아래에 마우스를 놓습니다.
섬세한 집게와 섬세한 가위를 사용하여 해부 현미경으로 대어타를 명확하게 노출시키고 대어타를 따라 결합 조직을 가능한 한 깨끗하게 제거하십시오. 심혼에서 체강 트렁크에 섬세한 가위를 매치하여 흉부 대어를 해부합니다. 대마를 PBS와 함께 6센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다.
대동맥을 세로로 길게 잘라서 먼저 작은 곡선을 따라 잘라낸 다음 마이크로시저를 사용하여 오리지움, 왼쪽 공통 경동맥 및 왼쪽 서브클라비아 동맥을 포함하여 대동맥 아치의 세 가지를 잘라내어 직선 세그먼트가 충족될 때까지 더 큰 곡선을 따라 절단합니다. 10 분 동안 PBS에서 1 % 폴리옥시에틸렌 옥실 페닐 에테르로 대어를 페메아빌화하십시오. 그런 다음 12웰 세포 배양 판에서 실온에서 1시간 동안 2.5%의 폴리소르바테 20을 함유한 트리스 버퍼링 식염수로 10%의 일반 염소 세럼으로 대어타를 차단한다.
다음으로 밀리리터 토끼 안티 VCAM1 당 5 그램을 포함하는 차단 버퍼에서 대어타를 배양하고, 밀리리터 쥐 안티 VE-Cadherin 당 5 그램, 섭씨 4도에서 하룻밤. 세척 용액으로 샘플을 세 번 헹구고, 실온에서 1 시간 동안 형광 컨쥬게이징 이차 항체를 적용하여 어두운 곳에 보관하십시오. 세탁 용액에 세 번 더 헹도 라.
대어테아를 DAPI로 10분 동안 카운터스테인하여 어두운 곳에 보관합니다. 그런 다음 스테인드 대어를 세정용으로 세 번 헹구는 다. 대어타를 곡선 면이 아래쪽으로 덮개 슬립에 놓고, 이전에 커버 슬립에 떨어뜨린 안티페이드 장착 용액으로 천천히 이동합니다.
대마를 부드럽게 펴서 시편을 평평하게 유지합니다. 커버 슬립을 반전시키고 유리 슬라이드에 놓습니다. 시편과 유리 사이의 기포를 피하십시오.
레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 대어타를 검사합니다. 이미지-프로 플러스 소프트웨어를 통해 원한 영역에서 원하는 영역과 다른 채널의 색상 강도를 분석합니다. 마우스 대동맥으로부터 혈관 내피 세포의 종양 염색 이미지가 표시된다.
En face 면역형화 단백질 하나, 내피 마커로서 VE-Cadherin을 통한 발현은 마우스 대동맥의 상이한 영역에서 다양한 유동 패턴으로 도시된다. DAPI는 또한 더 나은 시각화를 위한 세포 핵을 보여주기 위하여 반성되었다. 현미경의 밑에 Z 스택을 통해 볼 때, 내피 및 매끄러운 근육 세포는 그들의 세포 핵 형태에 의해 쉽게 구별될 수 있습니다.
내피 세포 핵은 타원형모양이며, 스핀들 모양의 부드러운 근육 세포 핵보다 더 크다. VCAM-1의 발현은 대오르타 아치의 낮은 곡률, 꾸준한 흐름 아래, 대나타 아치의 더 큰 곡률, 그리고 흉부 대역에서 의 방해된 흐름 아래 영역에서 더 풍부했다. 여기서 마우스 대자의 곡률이 적고 곡률이 적고 곡률과 흉부가 커진다.
올바른 수정을 통해, 이 기술은 또한 내피 세포 내동성 에서 혈관 투과성, 및 거대 분자의 위치의 분석에 적용될 수 있다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
본 연구는 마우스 대동맥의 내피세포를 직접 관찰하기 위한 면역형광 염색 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 다양한 유체 전단 응력 조건, 특히 동맥경화증 발생과 관련하여 이러한 세포의 세포 및 분자 표현형을 분석하는 데 효과적입니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 혈관내피세포 생물학
- 죽상동맥경화증 연구
- 면역형광 기법
배경
- 혈관 생물학에서 혈관 내피세포의 중요성
- 혈관 내피 기능에서 전단 응력의 역할
- 혈류 패턴과 죽상동맥경화증 발생의 연관성
사용된 방법
- 면역형광 염색 프로토콜
- 마우스 모델 (C57BL/6)
- 이미징을 위한 공초점 현미경
주요 결과
- 형광 마커를 이용한 혈관 내피 세포의 직접적 평가
- 교란 흐름 구역에서의 VCAM-1 발현 증가
- 혈관 내피 세포와 평활근 세포 핵 형태의 명확한 구분
결론
- 본 연구는 혈역학적 힘에 대한 혈관 내피 세포의 반응을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 이러한 결과는 혈관 생물학 및 죽상경화증의 기저 기전을 이해하는 데 있어 매우 중요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 개요
생리학적 전단 응력 하에서 온전한 내피 세포 단층을 직접 시각화함으로써 죽상동맥경화증 연구 시 혈관 표적의 기전적 위험성을 낮출 수 있습니다. 이 접근법은 혈역학적 힘을 제자리(in situ)의 분자 표현형과 연결함으로써 표적 검증의 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이는 유전자 조작이나 약리학적 섭동 없이도 초기 단계의 병태생리학적 통찰력을 얻을 수 있는 질병 관련 시스템을 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 흐름 패턴의 교란과 초기 염증 마커인 VCAM-1의 상향 조절 간의 상관관계를 분석함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: VE-Cadherin과 같은 내인성 혈관 내피 마커를 사용하여 기능적 타겟 검증을 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 제공합니다.
- 예측적 가치: 전임상 동맥경화 모델에서 병변 형성에 앞서 나타나는 분자적 반응을 식별함으로써 포트폴리오 선별을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 혈관 내피 표현형의 고함량 분석에 적합한 표준화된 정량적 면역형광 출력물을 생성합니다.
- 확장성: 정의된 흐름 조건하에서 여러 대동맥 부위의 병렬 평가가 가능하여 비교 스크리닝을 수행할 수 있습니다.
- 분석 표준화: 일관된 관류, 블로킹 및 염색 프로토콜을 사용하여 실험 및 연구실 간의 변동성을 최소화합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련성: 플라그가 형성되기 쉬운 영역에서 내피 세포의 반응을 조사함으로써 초기 죽상동맥경화증 감수성을 직접적으로 모델링합니다.
- 중개 연구의 연속성: 혈역학적 기계생물학과 인간의 혈관 병리에 관련된 분자적 판독 값 사이를 연결합니다.
- 위험 조정된 발전: 생체 내(in vivo) 효능 시험 전에 병리생리학적 전단 응력 하에서의 조절 능력을 검증함으로써 표적의 기전적 위험 요소를 제거할 수 있게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 기술은 표적 가설 검증부터 표현형 스크리닝, 전임상 검증에 이르는 발견 연속체에 부합하며, 특히 혈관 중심 프로그램에 유용합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 제어된 전단 응력 하에서 내피 세포의 활성화 상태를 직접 관찰함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 화합물 또는 유전적 영향이 내피 표현형에 미치는 영향을 비교하기 위해 정량적이고 다중 분석 가능한 판독값(예: VCAM-1, VE-Cadherin, 핵 형태)을 제공합니다.
- 분석(Analytics): 공간적으로 분해된 강도 기반 측정을 제공하여 대동맥 영역 전반의 분자 발현에 대한 통계적 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 인 비트로(in vitro) 유동 모델을 인 비보(in vivo)와 유사한 내피 반응에 연결하여 전임상 연구의 예측 가치를 높입니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 다수의 죽상동맥경화증, 고혈압 또는 혈관 염증 프로젝트에 적용 가능한 재사용 가능한 혈관 표현형 분석 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 혈역학적 힘을 온전한 조직 내의 특정 내피 세포 분자 표현형과 연결함으로써 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 정의된 관류, 고정 및 염색 단계를 통해 표준화와 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 병태생리학적으로 유의미한 기계적 자극 하에서 표적 결합을 검증함으로써 의사결정(go/no-go) 효율을 높입니다.
- 포트폴리오 영향: 초기 죽상동맥경화증 내피 표현형에서의 조절 상태를 기반으로 표적에 대한 위험 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 마우스 혈관 박리, 관류 기법 및 공초점 현미경 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 관류 장비, 박리 현미경 및 스펙트럼 언믹싱(spectral unmixing) 기능이 포함된 레이저 스캐닝 공초점 시스템의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 사용자와 실험 장소에 관계없이 관류 압력, 고정액 온도 및 항체 희석 배수의 표준화가 필요합니다.
- 다른 혈관층(예: 경동맥, 관상동맥)에 적용할 경우, 박리 및 투과화 단계의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 종점 분석(endpoint analysis)으로 제한되며, 흐름 상태에서 혈관 내피 세포 반응의 실시간 동적 이미징은 지원하지 않습니다.
