Name: 혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 배우세요 마우스 대동맥 혈관 내피 세포를 직접 관찰하는 En Face 면역 형광 염색법을. C57BL/6 모델을 사용하여 전단응력 조건에 따른 세포 표현형과 VCAM-1 발현을 분석하는 이 기법은 죽상경화증 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 번호 81670451, 81770430), 상하이 라이징 스타 프로그램 (그랜트 번호 17QA140300), 상하이 시 정부의 과학 기술위원회 (그랜트 번호)에 의해 지원되었다. 14441903002, 15411963700).

모든 동물 실험은 상하이 자오퉁 대학의 동물 자원위원회가 승인한 실험 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 마우스 대류의 관류
<ol><li>간단히, 12 주 된 C57BL/6 쥐 나트륨 pentobarbital의 복 강 주사와 쥐를 마 사 (50 mg/kg 체중). 꼬리를 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 참고: 움직임이 관찰되지 않으면 동물은 충분히 마취되어 실험을 시작합니다.</li>
	<li>마우스의 발을 접착제 테이프로 종이 타월 더미에 테이프로 바힙니다.</li>
	<li>포셉으로 마우스의 피부를 잡고 복부에서 흉부 의 상단까지 가위로 피부를 잘라.</li>
	<li>날카로운 가위로 흉곽 아래복 구멍을 엽니다.</li>
	<li>포인원으로 흉골을 들어 올리고 횡격막을 잘라; 그런 다음 흉곽을 잘라 흉강을 노출시하십시오.</li>
	<li>가위로 간 바로 위의 베나 카바를 잘라냅니다.</li>
	<li>압력 응과 (100 mmHg) 폐와 간이 창백해질 때까지 좌심실을 통해 40 단위 / mL 헤파린을 포함하는 미리 냉각 된 정상 식염수로 5 분 동안 동맥 나무를. 이어서, 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에서 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드를 3분 동안 응비한다.</li>
	<li>대반이 노출될 때까지 모든 근육, 장기 및 지방을 제거합니다.</li>
	<li>해부 현미경 아래에 마우스를 놓습니다.</li>
</ol>2. 대동맥의 해부 및 세로 개방
<ol><li>해부 현미경으로 대불을 명확하게 노출하고 섬세한 집게와 섬세한 가위 한 쌍으로 대불을 가능한 한 깨끗하게 따라 결합 조직을 제거하십시오(그림1).</li>
	<li>심장에서 체강 트렁크로 흉부 대인을 섬세한 가위로 해부하고 대강을 PBS와 함께 6cm 세포 배양 접시에 넣습니다. 대공의 를 세로방향으로 열고, 더 낮은 곡선을 따라, 직선 세그먼트가 충족될 때까지 더 큰 곡선을 따라 잘라냅니다. 그림2와 같이 인노미, 좌측 공통 경동맥 및 좌측 쇄골 동맥을 포함한 대동맥 아치의 세 가지를 마이크로시저와 함께 열어.</li>
</ol>3. 대불의 전처리 및 면역 염색
<ol><li>대류를 PBS에서 0.1% 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르로 10분 동안 퍼메아빌화하고 12웰 셀 배양플레이트에서 실온에서 1시간 동안 2.5% 폴리소르베이트 20을 함유하는 트리스 완충식염수(TBS)에서 10% 정상 염소 혈청으로 차단한다.</li>
	<li>다음으로, 대류를 5 g/mL 토끼 안티 VCAM-1 및 5 g/mL 래트 안티-VE-카데린을 블로킹 버퍼에 밤새 4°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>샘플을 세척 용액 (2.5 % 폴리 소르베이트 20을 포함하는 TBS)으로 샘플을 헹구고 형광 접합 이차 항체 (1 : 1,000 희석, 알렉사 플루어 555 표지 된 항 토끼 IgG 및 알렉사 플루어 488 표지 된 항 쥐 IgG)를 1 시간 동안 적용하십시오. 온도. 세척 용액에서 3x 헹입니다.</li>
	<li>대왕을 4',6-디아미디노-2-페니린돌(DAPI)(1 μg/mL)으로 10분 동안 대류에 대류하고 세척용액에서 3배 헹구어 보겠습니다.</li>
</ol>4. 유리 슬라이드에 대류의 장착
<ol><li>대자리를 발광면이 아래쪽으로 커버슬립에 놓고 이전에 커버슬립에 떨어뜨린 안티페이드 장착 용액으로 천천히 이동합니다. 대공을 부드럽게 펴서 시편을 평평하게 유지합니다.</li>
	<li>커버 슬립을 반전하고 슬라이드 유리에 놓습니다. 시편과 유리 사이에 기포가 남아 있지 않도록 주의해야 합니다.</li>
</ol>5. 대반의 관찰
<ol><li>레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 대류를 검사합니다.</li>
	<li>Image-Pro Plus 소프트웨어를 통해 en face 이미지에서 원하는 영역의 다양한 채널의 색상 강도를 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li>
<li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li>
<li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li>
<li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+%26%2334%3Ben+face%26%2334%3B+preparations+one+cell+in+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A method for the production of &#34;en face&#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li>
<li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).</li>
<li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12%2F15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration%3A+a+new+role+for+15%28S%29-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li>
<li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q%2FTNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li>
<li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li>
<li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li>
<li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+CRP%2C+Atherogenic+LDL%2C+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li>
<li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

내피는 지질, 염증성 매개체 및 유체 전단 응력1,11,12를포함하는 수많은 프로테로겐성 인자에 노출된다. 이 소동에서 내피 세포를 직접 관찰하는 것은 부상 자극에 반응하여 세포 형태, 세포 간 접합부 및 분자 발현 패턴의 변화를 분석하는 특별한 이점을 제공한다.
이전 연구는 동맥 벽의 내피를 관찰하기 위해 두 개의 상이한 enface 면역성 화학 기술을 제공했다 4,5. 하나는 특별한 기술에 의해 혈관 벽으로부터 내피내피를 제거함으로써 내피 단층을 얻는 것이며, 이는 마스터하기 어렵고 동맥의 분지 부위에서 많은 내피의손실을 초래할 수 있다 4. 다른 하나는 우리가 설...

혈관 구조의 초기 변화는 주로 내피에서 시작되며, 이는 세포 간 단단한 접합 복합체와 함께 혈액과 혈관 벽 사이의선택적 장벽으로 기능합니다 1. 실질적인 증거는 내피 기능 조절에 혈류의 기계적 효과에 대한 중요한역할을 가리킵니다 2. 유체 전단 응력, 혈류에 의해 생성되는 마찰력, 상이한 혈관 부위의 특정 흐름 패러다임에 따라내피 세포 형태 및 기능을 차별화하여 형성한다 2,3. 죽상 경화성 병변은 동맥의 직선 세그먼트와 같은 꾸준한 흐름 (s-flow)의 영역과 비교하여 혈관 곡률, 흐름 분배기 및 분기 점과 같은 방해 된 혈류 (d-flow)의 부위에서 우선적으로 발생합니다. 따라서, 내피 형태와 분자 발현 패턴의 직접적인 관찰은 다양한 흐름 패러다임하에서 내피 세포의 구조적 및 기능적 표현형에 대한 중요한 통찰력을 제공해야합니다.
배양된 내피 세포는 유체 전단 스트레스, 주변 사이토카인, 세포 세포 또는 세포 외 매트릭스 상호작용의 충격의 손실로 인해 생체 내에서 부분적으로 수행되는 것처럼 실제 표현형을 발현하지 않을 수 있다. 이를 돕기 위해, 본래 내피 세포 단층은 고전적인 면역 조직 화학을 사용하여 횡절편에서 연구 될 수있다. 그러나, 내피 단층은 일반적으로 명확하게 관찰될 수 없을 정도로 얇고 깨지기 쉽습니다. En face 면역조직화학은 내피의 내벽을 관찰하는데 사용되어 왔지만, 내피가 쥐 나 토끼의 동맥 벽의 일부 또는 기본 조직에서 쉽게 벗겨지기 때문에 그 결과에 복잡하거나 불규칙합니다. 그 벽은 두꺼운,4,5를 장착됩니다 .
마우스 모델은 여러 면에서 다른 동물에 비해 상당한 장점을 갖는다. 여기에서, 우리는 C57BL/6 마우스에 있는 대동맥 아치 및 흉부 대동맥의 내피 세포를 분석하기 위하여 수정된 en face 면역 형광 기술을 채택합니다. 이러한 기술은 상이한 흐름 패턴의 내피 병리생리학을 연구하고 동맥경화증6,7,8,9,10의발달에 널리 사용되어 왔다. 이 방법을 통해 과학자들은 내피의 전체 표면을 명확하게 관찰하고 다른 유체 전단 응력 하에서 주어진 단백질의 발현 패턴을 비교할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Antifade mountant</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 집게</td><td>RWD 생명 과학</td><td>F11001-11</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 가위</td><td>RWD 생명 과학</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>해부 집게</td><td>RWD 생명 과학</td><td>F12005-10</td><td></td></tr><tr><td>Mciro 봄 가위</td><td>RWD 생명 과학</td><td>S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌, 옥틸 페닐 에테르(Triton X-100),</td> <td>Amresco</td><td>M143</td><td></td></tr>, <tr><td>폴리소르베이트 20(트윈 20)</td><td>Amresco</td><td>0777</td><td></td></tr>, <tr><td>VCAM-1 항체</td><td>, Abcam</td><td>ab134047</td><td></td></tr>, <tr><td>VE-Cadherin 항체</td>, <td>BD Biosciences</td><td>555289</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 표지, 토끼 방지 IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-31572</td><td></td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 488 표지 항쥐 IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-21208</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 현미경&nbsp;</td><td>칼 자이스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 en face 면역 형광 염색사용

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

내피형및 형태학에 있는 비정상적인 변경은 동맥 경화증의 병인에 있는 초기 사건으로 여겨져. 본래 내피의 직접적인 관찰은 기능 장애 내피 세포에서 세포 및 분자 사건을 이해하는 귀중한 정보를 제공 할 것이다. 여기에서, 우리는 과학자들이 손상되지 않은 내피 표면의 명확한 심상을 얻고 그 자리에서 분자 발현 패턴을 분석하는 것을 가능하게 하는 변형된 en face 면역형광 염색 기술을 기술합니다. 이 방법은 대공의 다른 부위에서 전체 내피 단층을 관찰하기위한 간단하고 신뢰할 수 있습니다. 이 기술은 특히 초기 단계에서 동맥 경화증의 병리생리학을 이해하는 유망한 도구가 될 수 있습니다.

12주 된 C57BL/6 마우스를 안락사시키고 40 단위/mL 헤파린을 함유한 일반 식염수로 주입한 다음, 4% 파라포름알데히드를 미리 냉각시켰습니다. 마우스 대공은 해부 현미경(도 1)에노출되었고, 해부하고, 세로로 절단하였다(도2). 혈관 내피 세포의 En 얼굴 면역형광 염색은 도 3 및 표1에 예시된 바와 같이 수행되었다. 혈관세포 접착 단백질-1(VCAM-1)의 면역형형 면역형단백질-내피 마커로서 VE-카데린을 발현하여 마우스 대동맥의 상이한 영역에서 다양한 흐름 패턴하에 나타내졌다. DAPI는 또한 더 나은 시각화를 위해 세포 핵을 보여주기 위해 역태화되었다. 내피 세포 핵은 타원형이고 스핀들 모양보다 더 크기 때문에 내피 및 평활근 세포는 현미경의 밑에 z...

여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.

혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

이 프로토콜은 사람들이 다른 유체 전단 응력 하에서 내피 세포 형태와 영역에서 분자의 발현을 분석하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 상이한 유체 전단 응력 하에서 혈관 내피 세포의 직접적인 평가를 제공한다는 것입니다. 이 절차를 수행 할 때, 주요 단계는 갓 준비 파라 포름 알데히드를 사용하고 좋은 관류를 수행하는 것입니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 12주 된 C57BL/6 마우스의 마취로 이 절차를 시작합니다. 꼬리를 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 마우스의 발을 접착제 테이프로 종이 타월 더미에 테이프로 테이프로 놓습니다.마우스의 피부를 집게로 잡고 복부에서 흉부 꼭대기까지 가위로 피부를 자른다. 날카로운 가위로 흉곽 아래복을 엽니다. 흉골을 집게로 들어 올리고 다이어프램을 자른다.그런 다음 흉곽을 잘라 흉부 구멍을 노출합니다. 가위로 간 바로 위에 있는 베나 카바를 잘라냅니다. 압력은 5 분 동안 동맥 나무를 pererle, 폐와 간 창백해질 때까지, 왼쪽 심실을 통해, 밀리리터 헤파린 당 40 단위를 포함하는 미리 차가운 정상 식염수와.그런 다음 PBS에서 4 분 동안 미리 냉각 된 4 % 파라 포름 알데히드와 함께 퍼퓨즈하십시오. 대자가 노출 될 때까지 모든 근육, 장기 및 지방을 제거하십시오. 해부 현미경 아래에 마우스를 놓습니다.섬세한 집게와 섬세한 가위를 사용하여 해부 현미경으로 대어타를 명확하게 노출시키고 대어타를 따라 결합 조직을 가능한 한 깨끗하게 제거하십시오. 심혼에서 체강 트렁크에 섬세한 가위를 매치하여 흉부 대어를 해부합니다. 대마를 PBS와 함께 6센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다.대동맥을 세로로 길게 잘라서 먼저 작은 곡선을 따라 잘라낸 다음 마이크로시저를 사용하여 오리지움, 왼쪽 공통 경동맥 및 왼쪽 서브클라비아 동맥을 포함하여 대동맥 아치의 세 가지를 잘라내어 직선 세그먼트가 충족될 때까지 더 큰 곡선을 따라 절단합니다. 10 분 동안 PBS에서 1 % 폴리옥시에틸렌 옥실 페닐 에테르로 대어를 페메아빌화하십시오. 그런 다음 12웰 세포 배양 판에서 실온에서 1시간 동안 2.5%의 폴리소르바테 20을 함유한 트리스 버퍼링 식염수로 10%의 일반 염소 세럼으로 대어타를 차단한다.다음으로 밀리리터 토끼 안티 VCAM1 당 5 그램을 포함하는 차단 버퍼에서 대어타를 배양하고, 밀리리터 쥐 안티 VE-Cadherin 당 5 그램, 섭씨 4도에서 하룻밤. 세척 용액으로 샘플을 세 번 헹구고, 실온에서 1 시간 동안 형광 컨쥬게이징 이차 항체를 적용하여 어두운 곳에 보관하십시오. 세탁 용액에 세 번 더 헹도 라.대어테아를 DAPI로 10분 동안 카운터스테인하여 어두운 곳에 보관합니다. 그런 다음 스테인드 대어를 세정용으로 세 번 헹구는 다. 대어타를 곡선 면이 아래쪽으로 덮개 슬립에 놓고, 이전에 커버 슬립에 떨어뜨린 안티페이드 장착 용액으로 천천히 이동합니다.대마를 부드럽게 펴서 시편을 평평하게 유지합니다. 커버 슬립을 반전시키고 유리 슬라이드에 놓습니다. 시편과 유리 사이의 기포를 피하십시오.레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 대어타를 검사합니다. 이미지-프로 플러스 소프트웨어를 통해 원한 영역에서 원하는 영역과 다른 채널의 색상 강도를 분석합니다. 마우스 대동맥으로부터 혈관 내피 세포의 종양 염색 이미지가 표시된다.En face 면역형화 단백질 하나, 내피 마커로서 VE-Cadherin을 통한 발현은 마우스 대동맥의 상이한 영역에서 다양한 유동 패턴으로 도시된다. DAPI는 또한 더 나은 시각화를 위한 세포 핵을 보여주기 위하여 반성되었다. 현미경의 밑에 Z 스택을 통해 볼 때, 내피 및 매끄러운 근육 세포는 그들의 세포 핵 형태에 의해 쉽게 구별될 수 있습니다.내피 세포 핵은 타원형모양이며, 스핀들 모양의 부드러운 근육 세포 핵보다 더 크다. VCAM-1의 발현은 대오르타 아치의 낮은 곡률, 꾸준한 흐름 아래, 대나타 아치의 더 큰 곡률, 그리고 흉부 대역에서 의 방해된 흐름 아래 영역에서 더 풍부했다. 여기서 마우스 대자의 곡률이 적고 곡률이 적고 곡률과 흉부가 커진다.올바른 수정을 통해, 이 기술은 또한 내피 세포 내동성 에서 혈관 투과성, 및 거대 분자의 위치의 분석에 적용될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포의 미세 영상은 cytoskeletal 구조에서 동적 변화 특성화 수 있습니다. 고정 표본을 사용하는 기술과는 달리,이 방법은 전에 동일한 세포에있는 굴지의 cytoskeleton의 시간적 변화에 대한 자세한 평가, 동안 다양한 물리적, 약리, 또는 염증성 자극 후를 제공합니다.

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

출처: Gucciardo, E., et. al., 증식성 당뇨병성 망막병증의 섬유혈관 합병증에 대한 생체 외 조직 배양 모델. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 피브린 겔에 내장된 섬유혈관 조직의 생체 외 배양에 대한 면역염색 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이를 통해 증식성 당뇨병성 망막병증과 관련된 혈관 변화를 자세히 시각화할 수 있습니다.

젤 내장 환자 유래 질환 섬유혈관 조직의 면역형광 염색

출처: Alluri, H., et al. 혈액-뇌 장벽 기능 장애 연구를 위한 체외 허혈-재관류 손상 모델로서의 산소-포도당 결핍 및 재산소화. J. Vis. Exp. (2015). 이 비디오는 쥐의 뇌 미세혈관 내피 세포(RBMEC)에서 밀접 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화를 보여줍니다. 스트레스 단층에서는 형광 표지된 항체를 사용하여 밀착 접합 단백질을 표지하고, 형광단 표지된 팔로이딘은 응력 섬유를 표지합니다. 그런 다음 표지된 분자는 컨포칼 현미경을 통해 시각화됩니다.

내피 세포에서 밀접한 접합 단백질과 스트레스 섬유의 형광 국소화(Fluorescence Localization of tight junction proteins and stress fibers in endothelial cells)

우리의 보고서는 생리 학적 유동 조건 하에서 전립선 암의 CTC / EC의 상호 작용을 시각화하고 분석 할 수있는 독특한 방법을 설명합니다.

환자와 인간의 내피 세포에서 파생 된 전립선 순환 종양 세포 사이에 E-셀렉틴 매개 상호 작용을 관찰하는 시험 관내 방법에

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

마우스 혈관의 얼굴 준비

배우세요 마우스 대동맥 혈관 내피 세포를 직접 관찰하는 En Face 면역 형광 염색법을. C57BL/6 모델을 사용하여 전단응력 조건에 따른 세포 표현형과 VCAM-1 발현을 분석하는 이 기법은 죽상경화증 연구에 필수적인 도구입니다.

혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용

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