Name: 규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 배우세요 Candida albicans 바이오필름 성장에 635nm 붉은 빛 광선요법을 적용하는 방법을. 48시간 동안의 치료 효과를 평가하여 항진균 치료의 새로운 가능성을 탐색합니다.

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우리가이 연구 개발에 대 한 박사 폴라 다 실베이라, 박사 Cecília Atem Gonçalves 드 Araújo 코스타, 숀 M. Maule, 쉐 인 M. Maule, 박사 Malvin N. Janal와 박사 Iriana Zanin 감사합니다. 우리는 또한이 연구에서 분석 하는 스트레인을 기부에 대 한 박사 알렉산더 D. 존슨 (UCSF)를 인정 합니다.

1입니다. 배양 기의 준비
<ol><li>Sabouraud 포도 당 한 천 (SDA)를 준비 합니다. SDA 페니 (50 mg/L) 1000 ml 증류수의 보충의 65 g을 일시 중단 합니다. 매체를 완전히 분해를 끓인 다. 30 분 쿨 45-50 ° c에 대 한 15 PSI (121 ° C)에 압력가 마로 소독 하 여 소독 잘 혼합 하 고 멸 균 페 트리 접시에 SDA의 20 mL를 붓고 (크기: 100 m m x 15 m m).</li>
	<li>준비 효 모 질소 기본 (YNB) 매체 100 mM 포도 당 6.7 g YNB 및 초순 물 1000 mL에 포도 당의 18 g을 혼합 하 여 보충 합니다. 교 반기를 사용 하 여 혼합 하 고 매체 0.22 μ m 진공 필터 시스템을 사용 하 여 소독.</li>
	<li>RPMI RPMI 1640 그리고 34.32 g 3-(N-morpholino) 10.4 g을 혼합 하 여 준비 propanesulfonic 산 (MOPS) 초순 물 1000 mL. 열 없이 교 반기에서 혼합 하 고 1 N NaOH (초순 물 50 mL에 NaOH의 추가 2 g)를 추가 하 여 7 pH를 조정. 0.22 μ m 진공 필터 시스템을 사용 하 여 매체를 소독.</li>
</ol>2. 사전 inoculum 및 inoculum
<ol><li>C. albicans SN425 미생물 −80 ° C 냉동 고에서 제거 하 고 주위 온도에 녹여 보자. SDA 페니 (50 mg/L) 보충을 포함 하는 배양 접시에 재고 문화 10 µ L 씨 48 h에 대 한 37 ° C에서 aerobically 페 트리 접시를 품 어.</li>
	<li>외피의 48 h 후 C. albicans 의 10 식민지 효 질소 기본 (YNB) 매체 100 mM 포도 당 보충 aerobically 사전 inoculum 16 h 37 ° C에서 품 어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>16 h, 준비는 inoculums 1시 10분에서 100 mM 포도 당으로 보충 하는 신선한 YNB 매체에 스타터 문화를 diluting 하 여 대 한 잠복기 후 비례 (1 mL YNB 9 mL에 희석 시 동기 문화). 540에서 측정 하는 초기 광학 밀도 (OD) nm.</li>
	<li>긴장과 중간 로그 성장 단계에 도달 540에서 최종 OD를 측정 될 때까지 aerobically 8 h 37 ° C에서 inoculums를 품 어 nm. 중간 로그 성장 단계 ( 그림 1의 성장 곡선에 따라 8 h)에 inoculums의 세 인지 확인 하는 초기 OD에서 최종 OD를 뺍니다.</li>
	<li>107 셀 mL-1와 inoculum 도달, 5500 x g에 5 분 동안 inoculum을 원심 하 고 삭제는 상쾌한 튜브의 볼륨의 절반을 inoculum을 집중.</li>
</ol>3. Biofilm 형성 및 광선 요법
<ol><li>24 잘 폴리스 티 렌 격판덮개의 우물에는 inoculum의 1 mL를 추가 합니다. Aerobically 우물의 바닥에 세포 접착 수 있도록 90 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>비 일관 된 레드를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 635 ± 10 nm의 파장 및 1,460 mW cm−2의 고정된 출력 광원으로 빛.</li>
	<li>전력 측정기를 사용 하 여 빛의 전력 밀도 측정. 눈부신 노출 적용은 87.6 J c m-2, 노출의 약 1 분에 해당입니다. 에너지 밀도 (J/c m2) 수식을 사용 하 여 = 조사 시간 (s) x 전력 밀도 (W/c m2). 광원 및 샘플 온난화 방지 하려면 biofilm 사이 5 밀리미터의 거리를 적용 합니다.</li>
	<li>치료 1 분 0.12% 액체와 긍정적인 제어 biofilms 부정적인 제어 biofilms 0.89% NaCl 1 분.</li>
	<li>치료 후 모든 biofilms 0.89 %NaCl 용액으로 두 번 씻는 다.</li>
	<li>3-(N-morpholino) 버퍼링 RPMI 1640의 1 mL을 추가 biofilms에 pH 7에서의 propanesulfonic 산 (MOPS) 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 고.</li>
	<li>3.2에서 3.6 단계 세척 0.89%로 두 번 biofilms 동일한 치료 적용 아침에, NaCl, 새로운 RPMI 우물 MOPS (1 mL, pH 7)와 버퍼를 추가 하 고 aerobically 37 ° c.에 품 어</li>
	<li>같은 날, 6 h 후에 레드 빛 biofilms 노출. 치료 1 분 0.12% 액체와 긍정적인 제어 biofilms 부정적인 제어 biofilms 0.89% NaCl 1 분. 치료 후 biofilms 0.89 %NaCl 용액으로 두 번 씻는 다.</li>
	<li>Biofilm 개발의 48 h 달성까지 3.2-3.8 단계를 반복 합니다. 참고: 기본적으로, 1 개의 치료는 아침에 일어날 것 이다와 다른 하나 (떨어져 6 h) 같은 날 오후에 일어날 것 이다.</li>
</ol>4입니다. 처리
<ol><li>추가 1 mL 균 0.89%의 NaCl 잘 하는 biofilm는 잘 사용 하 여 피 펫 팁에서 그것을 긁어서 제거 하. 살 균 튜브를 제거 biofilm를 추가 합니다.</li>
	<li>살 균 0.89%의 또 다른 1 mL을 추가 잘 NaCl. 다시 긁 고 2 mL의 전체 볼륨에 대 한 같은 튜브에 정지를 추가 합니다.</li>
	<li>콜로 니 형성 단위 (CFU)<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 1 분 biofilm 정지입니다. Biofilm 정지에서 0.1 mL의 약 수를 사용 하 여 직렬 희석에 대 한.</li>
		<li>0.89 %NaCl 용액에 10-4 10-1 에서 biofilm 정지 희석.</li>
		<li>SDA 번호판 각 희석의 50 μ 씨 하 고 48 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
		<li>식민지를 계산 하 고 적용 하는 수식 CFU/mL = 식민지 x 10n 의 수 / q (n = 희석; q = 시드 볼륨).</li>
	</ol>
</li>
	<li>건조 중량<ol>
<li>무게 및 레이블 microcentrifuge 튜브입니다.</li>
		<li>Biofilm 정지에서 0.1 mL를 사용 하 여 건조 중량 (바이오 매스) 결정에 대 한.</li>
		<li>절대 에타 놀의 1 mL는 biofilms의 0.1 mL의 약 수를 추가 하 고 18 h-20 ° C에서 그것을 저장. 후 18 h 10 분에 대 한 10000 x g 에서 원심.</li>
		<li>상쾌한, 튜브를 1 주일에 대 한 샘플을 건조 하 고 다시 microcentrifuge 튜브 무게 desiccator에 장소.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수용 성 다 당 류 (WSPs)와 알칼리 수용 성 다 당 류 (Asp)
	<ol>
<li>Biofilm 서 스 펜 션, 적극적으로 소용돌이 1 분 및 4 ° c.에서 10 분 동안 5500 × g 에서 원심 분리기 (1.8 mL) 볼륨의 나머지에서 새로운 튜브에는 상쾌한을 저장 하 고 두 번 불 임 초순 (5500 × g, 4 ° C에서 10 분)와 세포 외 매트릭스의 불용 성 성분 포함 하는 셀으로 침전을 세척.</li>
		<li>다시 살 균 초순의 1.8 mL에 불용 성 콘텐츠를 일시 중단 합니다.</li>
		<li>수용 성 다 당 류 (WSPs) 참고: 증기 두건에서이 실험을 수행 합니다.<ol>
<li>저장 된 상쾌한에서 수용 성 다 당 류 (WSPs)의 정량화에 대 한 1 mL를 보유 합니다.</li>
			<li>1 분 동안 저장된 상쾌한 균질 다음, 무 균 튜브에 전송 하 고 95% 에탄올의 2.5 볼륨을 추가 합니다. WSPs 강 수를 위해-20 ° C에 18 h에 대 한 튜브를 저장 합니다.</li>
			<li>18 h 후 4 ° c.에 20 분 9500 x g 에서 튜브 원심 원심, 후는 supernatants 삭제 합니다.</li>
			<li>세 번 75% 에탄올과 샘플을 세척 하 고 알 약을 건조. 다시 살 균 초순 물의 1 mL와 펠 릿을 일시 중단 하 고 페 놀 황산 산 메서드를 사용 하 여 WSP 계량.</li>
			<li>0.1% 포도 당 (포도 당 초순의 10 mL를의 0.01 g)을 사용 하 여 표준 곡선 (0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 및 25 µ L 튜브 당 포도 당의).</li>
			<li>구성 된 샘플의 200 µ L 유리 튜브에 5% 페 놀 (초순의 47.3 mL에 페 놀 90%의 2.7 mL)의 200 µ L를 추가 또는 표준 곡선 (샘플 당 3 중)에서 조심 스럽게 섞는다.</li>
			<li>관에 황산 1 mL를 추가 하 고 섞으십시오. 반응에 대 일 분 기를 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플을 측정 (490 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>알칼리 수용 성 다 당 류 (Asp) 참고: 증기 두건에서이 실험을 수행 합니다.<ol>
<li>불용 성 다시 일시 중단 된 금액에서 Asp의 결정에 대 한 1 mL을 구분 합니다. 각 biofilm 정지 (13000 x g, 4 ° C에서 10 분)의 aliquots 원심</li>
			<li>각 튜브의 상쾌한을 조심 스럽게 제거 합니다. 다음 건조 한 펠 릿을 진공 집중 장치에 샘플을 놓습니다.</li>
			<li>알 약을 무게 고 건조 중량의 1 밀리 그램 당 1 N NaOH 초순 물 50 mL에 NaOH (2 세대)의 300 µ L를 추가 합니다. 37 ° C에서 2 시간에 대 한 그들을 품 어 그리고 10 분 13000 × g 에서 원심.</li>
			<li>신중 하 게 microcentrifuge 튜브, 펠 릿을 유지 하는 피 펫 및 전송 supernatants를 수집 합니다.</li>
			<li>다시 한번, 펠 릿, 구성 된 튜브에 1 N NaOH의 동일한 볼륨을 추가 하 고 ASP의 추출에 대 한 동일한 단계를 위의 반복.</li>
			<li>2 h에 대 한 보육, 후 원심 샘플 (13000 x g 10 분 동안) 신중 하 게는 supernatants 수집 하 고 이전에 수집한 supernatants에 추가.</li>
			<li>세 번째 추출에 대 한 하지만이 시간, 위에 같은 단계를 반복, 원심 분리 하기 전에 2 시간에 대 한 샘플을 품 어 하지 마십시오.</li>
			<li>나중에, 각 샘플에 95% 에탄올의 3 개의 볼륨을 추가 합니다. 그런 다음 −20 ° C 18 h ASP의 강수량에 대 한 샘플 재고.</li>
			<li>Centrifuge 튜브 (9500 × g 4 ° C에서 20 분) 하 고는 supernatants 삭제.</li>
			<li>각 펠 릿 75% 에탄올으로 세 번 세척 하 고 건조 (동일한 절차는 WSP 위해 했다). 다시 1 N NaOH와 함께 첫 번째 추출의 동등한 총 볼륨에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
			<li>페 놀 황산을 사용 하 여 ASP의 정량화에 대 한 샘플을 읽고 (WSP 분석에 관해서는 같은).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

C. albicans biofilm의 성공적인 경작을 위해 가장 중요 한 단계는: 1) 사전 inoculum YNB 중 포도 당 100 mM;와 보완 inoculum을 할 2)를 접착 단계에 대 일 분을 기다려야 하 고 신중 하 게 씻어 두 번 0.89% 우물 NaCl 준수 비 세포;를 제거 하 그리고 3) RPMI 매체 RPMI 균 성장 자극 것 이후 biofilm 형성을 시작 하는 준수 셀에 추가 하려면. Aneuploidies C. albicans를 경작 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 7 일 이상 저장 판 4 ° C, 그리고 기존 판에서 다시 행진 셀을 하지 않기로 오래 된 식민지를 사용 하는 것이 중요 하다. 마찬가지로, 하룻밤 성장1318 시간 전에 종자를 사용 한다.
연구 한계가 이다 생체 외에서 수행 되었다. 생체 외에서 연구 있다 biofilm의 생물학의 이해를 크게 증가 하는 동...

Candida albicans 의 발생률을 증가 하는 당뇨병, 면역 억제 치료 응용 프로그램, HIV 감염, 에이즈, 침략 적 임상 절차 및 과거 년에 있는 넓 스펙트럼 항생제 소비의 발생률이 증가 관련 질병1,2. C. albicans 감염 biofilm 개발 관련 일반적으로 그리고 임상 발현, 칸디 다 증, 또는 candidemia1,2등 조직 발현 등을 일으킬 수 있습니다. Biofilm 성장의 가장 주목할 만한 독성 요인 중 하나는 세포 외 다 당 류 매트릭스 설립 이다. Biofilm 형성 기존 항진균 약물, 환경 스트레스, 그리고 호스트 면역 메커니즘3에 저항을 증가 협력.
C. albicans 의 biofilm 성장을 planktonic 셀의 초기 부착 기판, 기판 표면, 및 hyphal 성장을 통해 효 모 세포의 전파에 의해 뒤에 시작 됩니다. Biofilm 성장의 마지막 단계 성숙 단계, 어떤 점에서 효 모와 같은 개발 억제, hyphal 개발 확장 되 고 세포 외 매트릭스 포함 biofilm4입니다. C. albicans exopolysaccharides (EPS) 행렬에서 mannan-글 루 칸 복잡 한5,6를 상호 작용 합니다. Exopolysaccharides의 상호 작용은 약7에 biofilms의 방어에 대 한 중요 합니다. 따라서, C. albicans 기질에서 EPS의 감소는 구강 칸디 다 증 제어를 위한 새로운 antibiofilm 프로토콜의 개발을 지원할 수 있습니다.
빛 조절 성장, 개발, 및 여러 생물8 의 행동 그리고 photodynamic 항균 화학요법 (협정)에 항균으로 적용 되었습니다. 협정에는 특정 파장의 빛을 흡수 photosensitizer9가시 광선 적용 됩니다. 그러나,는 photosensitizers 낮은 효능10를 일으키는 biofilm, 침투에 어려움이 있다. 완전히 침투 biofilms 치료제의 실패는 biofilms 때때로 전통적인 항균 치료3,5저항 하는 이유입니다. 동봉 된 미생물 세포를 비활성화 하려면 제 기질; 통해 침투 필요 그럼에도 불구 하 고, EPS는 biofilm에 운송의 그들의 수준을 자극 하거나11자체 매트릭스와 항균의 응답에 영향을 미치는 이러한 분자에 대 한 diffusional 장애물을 특징.
협정의 단점을 고려 하면 자체적으로 빛의 사용 가치 개선으로 나온다. 예비 데이터는 하루에 두 번 블루 빛으로 치료 크게 구 mutans biofilm에 EPS-불 용해성의 생산을 저해 밝혔다. EPS-불 용해성의 감소, 블루 빛 biofilm 성장을 저하. 그럼에도 불구 하 고, C. albicans biofilms에 붉은 빛을 사용 하 여 광선 요법의 결과 부족 한. 따라서,이 조사 목표는 붉은 빛을 사용 하 여 어떤 방식으로 광선 요법 성장과 C. albicans biofilm의 영향에 평가 했다. 매일 두 번 치료를 위해 우리는 우리 실험실의 이전 프로토콜9,12 , 생존 능력에 대 한 답변을 제공 하는 간단 하 고 재현성 biofilm 모델을 제공 적응 드라이 무게와 세포 외 다 당 류 빨간 불 치료. 후 금액 다른 치료법을 테스트 하기 위해 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>클로르헥시딘 20%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>덱스트로오스 (D-글루코스) 무수</td><td>피셔 화학물질</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>DSP-MD.43</td><td></td></tr><tr><td>LumaCare LC-122 A&nbsp;</td><td>LumaCare Medical Group, 미국 캘리포니아주 뉴포트 비치&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나클&nbsp;</td><td>피셔 케미컬</td><td>S641-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>피셔 바이오 시약&nbsp;</td><td>BP 359-500</td><td></td></tr><tr><td>Phenol 5%</td><td>Milipore Sigma</td><td>843984</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 3-(N-morpholino)</td><td>Sigma</td><td>R7755</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud 덱스트로스 한천에 chloramphenicol</td><td>Acumedia</td><td>7306A</td><td></td>황산이 보충</tr>됨<tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>효모 질소 베이스&nbsp;</td><td>Difco</td><td>DF0392-15-9</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino)프로판설폰산 MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 24웰 폴리스티렌 플레이트&nbsp;</td><td>팔콘</td><td>353935</td><td></td></tr></tbody></table>

규제 candida albicans biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

여기, 선물이 Candida albicans biofilm의 성장에 일당 빨간 불 치료의 결과 평가 하는 프로토콜. C. albicans SN425의 planktonic 성장, 증가 하는 inoculums 효 모 질소 기지 미디어에 성장 했다. Biofilm 형성에 대 한 아미노산의 높은 농도가지고 RPMI 1640 미디어 biofilm 성장 수 있도록 적용 되었다. 48 h의 Biofilms 비 코히어런트 빛 장치로 1 분 동안 하루에 두 번을 치료 했다 (붉은 빛, 파장 = 635 nm; 에너지 밀도 = 87.6 J·cm-2). 긍정적인 통제 (PC), 0.12% 액체 (CHX) 적용, 그리고 부정적인 제어 (NC), 0.89 %NaCl biofilms에 적용 했다. 콜로 니 형성 단위 (CFU), 건조 중량, 가용성과 불용 성 exopolysaccharides 치료 후 계량 했다. 간단히, 여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 재현성 및 빨간 불 치료. 후 드라이 무게와 세포 외 다 당 류 금액, 생존 능력에 대 한 답변을 제공 합니다.

그림 2 1 분 빨간 불 로그10 CFU/mL는 NC에 비해 감소에 대 한 레드 빛 당 일당 치료 후 로그10 CFU/mL C. albicans 의 결과 표시 (p = 0.004). 그림 3 은 매일 처리 후 C. albicans biofilms의 바이오 매스 (mg)의 결과 제공합니다. 모든 처리 그룹은 NC에 비해 바이오 매스의 감소를 보였다 (p = 0.000) 붉은 빛 처리는 PC에서 관찰 하는 바이오 매스의 유사한 감소를 제시 그룹. 그림 4 및 그림 5 PC NC에 비해 열 등 한 양의 C. albicans EPS 가용성과 EPS 불용 성 표시 (p = 0.000...

여기, 선물이 Candida albicans biofilm의 성장에 레드 빛 응용 프로그램의 결과 평가 하는 프로토콜. 635 nm의 파장 및 87.6 J·cm-2 의 에너지 밀도와 비 코히어런트 레드 라이트 장치 48 h에 대 한 칸디 다 albicans biofilms의 성장에 걸쳐 적용 되었다.

규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

칸디다 면역 손상 호스트에 보급 된 곰팡이 감염의 가장 일반적인 원인입니다. 매트릭스 때문에 생물막에 완전히 침투하는 치료제의 실패는 생물막이 전통적인 치료법에 저항하는 이유 중 하나입니다. 우리의 프로토콜은 홍빛을 사용하여 광요법이 칸디다 알비칸스 생물막의 성장과 배열을 방해하는 방법을 평가합니다.이 연구에서 사용되는 균주는 세포 외 매트릭스를 특징으로하고 광 장치가 성공적으로 다른 판자 미생물 현탁액 및 생물막에 적용되었기 때문에 적용 된 방법은 잘 확립되어 있습니다. 이 장치의 가장 큰 장점은 치료 시간 단축으로 임상 응용 프로그램에 더 눈에 띄게됩니다. 칸디다 알비칸을 배양할 때 항체를 획득할 수 있다는 것을 유의하십시오.따라서, 7일 이상 된 식민지를 사용하지 말고, 섭씨 4도에서 플레이트를 시작하지 말고, 기존 플레이트로부터 세포를 다시 줄이지 않는 것이 중요하다. 마찬가지로, 긴장은 하룻밤 성장의 18 시간 전에 사용되어야한다. 분광계를 처음으로 사용하는 경우 먼저 단위 수로 콜로니 팜을 획득하여 광학 밀도 값과 상관관계를 맺는 것이 중요합니다.따라서, 실험은 밀리리터당 10~7개의 세포의 초기 세포 농도에서 중간 성장 단계를 사용하기 시작할 것이다. 이러한 세포 농도는 가장 의존적이고 안정적인 물질 생물막을 제공하는 것으로 나타났다. 시작하려면, 중단 65 SDA의 그램, 로람페니콜의 리터 당 50 밀리그램으로 보충, 에 1, 000 비커에 증류수의 밀리리터.비커를 히터에 놓고 중간을 완전히 녹입니다. 그런 다음 미디어를 유리 병으로 옮기습니다. 캡을 병에 놓지만 병을 배출할 수 있도록 완전히 나사를 놓지 마십시오.병을 오토클레이브에 배치하여 15 PSI, 섭씨 121도에서 30분 동안 살균합니다. 약 섭씨 45도에 솔루션을 냉각합니다. 일회용 멸균 파이펫을 사용하여 잘 섞고 SDA의 파이펫 20 밀리리터를 멸균 페트리 플레이트에 넣습니다.YNB 배지를 준비하려면 100 밀리몰라 포도당으로 보충하여 6.7 그램의 YNB와 18 그램의 덱스트로스를 비커에 1, 000 밀리리터의 초순수 수를 섞습니다. 비커에 스티어 바를 놓고 비커를 저어 접시에 넣고 섞습니다. 0.22 마이크로미터 진공 필터 시스템을 통해 배지를 걸이하여 멸균합니다.10.4 그램의 RPMI-1640 및 34 그램의 MOPS를 1, 000 밀리리터에 초순수 수의 혼합하여 RPMI 매체를 준비하십시오. 교반기에서 열 없이 섞고 일반 수산화나트륨 1개를 추가하여 PH를 7으로 조정합니다. 0.22 마이크로미터 진공 필터 시스템을 사용하여 매체를 살균합니다.먼저, 미생물 칸디다 알비칸스 SN 425를 주변 온도에서 해동한다. 클로람페니콜로 보충된 SDA가 함유된 이전에 준비된 페트리 요리에 대한 정지 문화의 10 마이크로리터. 페트리 요리를 섭씨 37도에서 48시간 동안 에어로비티로 배양합니다.사전 접종을 위해 살균 된 윤활유를 사용하여 페트리 접시에서 칸디다 알비칸 의 10 식민지를 선택하고 포도당으로 보충 된 YNB 배지의 10 밀리리터를 포함하는 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 16시간 동안 37도에서 튜브를 에어로비로 배양합니다. 그런 다음, 희석을 위해 1-10 비율로 포도당으로 보충된 신선한 YNB 배지에 이 스타터 문화를 추가하여 접종을 준비합니다.분광계를 사용하여 540 나노미터에서 초기 OD를 측정합니다. 8시간 동안 37도에서 접종을 에어로비컬하게 배양하고 최종 OD를 540 나노미터로 측정합니다. 초기 OD에서 최종 OD를 빼서 접종자의 OD가 중간 로그 성장 단계에 있는지 확인합니다.밀리리터당 7개의 세포당 10~7개의 세포로 접종을 얻으려면, 5, 500회 G.pour를 5, 500회 G.pour를 저혈당 나트륨을 함유한 비커에 슈퍼나탄을 붓고 신선한 YNB를 추가하여 이전 부피의 절반에 접종을 농축한다. 24웰 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 접종한 밀리리터 1밀리리터를 넣습니다. 우물 바닥에 세포 접착을 허용하기 위해 90 분 동안 섭씨 37도에서 에어로브로 배양하십시오.양성 제어 생물막에 대해 0.12%의 클로르헨시딘1밀리리터로 1분간 생물막을 치료한다. 음의 대조를 위해, 멸균의 1 밀리리터, 0.89 %의 염화 나트륨으로 1 분 동안 생물막을 치료하십시오. 그 후, 우물을 각각 2회, 1분 씩 씻고, 1밀리리터의 멸균 염화나트륨을 1밀리리터로 씻어 비부착 세포를 제거한다.그런 다음 일관되지 않은 적색 광을 켜고 전원 계수를 사용하여 빛의 전력 밀도를 측정합니다. 평방 센티미터당 87.6 줄의 에너지 밀도 요구 사항에 따라 노출 시간을 결정합니다. 접시를 빨간 불빛 아래에 놓습니다.샘플의 온난화를 피하기 위해 광원과 바이오필름 사이의 거리를 5밀리리터로 유지합니다. 1 분 동안 노출 한 후, 각 우물에 멸균 RPMI 매체의 1 밀리리터를 추가하고 밤에 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 아침에, RPMI 매체와 함께 6 시간 동안 동일한 세척, 가벼운 치료, 긍정적 이고 부정적인 제어 치료 및 인큐베이션을 반복합니다.다시, 두 번 생물 막을 세척, 적색빛에 노출, 긍정적 이고 부정적인 제어 치료를 수행. 우물에서 용액을 흡인하고 RPMI 매체를 추가합니다. 48시간의 생물막 개발을 달성할 때까지 인큐베이션, 세척, 가벼운 치료 및 양성 및 음수 제어 치료를 반복합니다.처리를 시작하려면, 매체를 버리고 멸균의 1 밀리리터, 0.89%의 염화나트륨을 우물에 추가하고 파이펫 팁을 사용하여 우물에서 생물막을 긁어버린다. 제거된 생물막을 멸균 튜브로 옮기. 멸균의 또 다른 1 밀리리터를 추가, 0.89%의 염화 나트륨을 우물에 넣습니다.다시 긁어 내고 2 밀리리터의 총 부피, 같은 튜브에 서스펜션을 추가합니다. 생체 필름 서스펜션을 1분 동안 활발하게 소용돌이시다. CFU 분석을 위해, 각 희석에 대해 0.89%의 염화나트륨 용액의 900 마이크로리터를 함유한 마이크로 원심분리기 튜브로 생물막 서스펜션에서 0.1 밀리리터의 알리쿼터를 전송한다.살막 용액을 10에서 음수 10에서 음4로 희석하여 식염수 용액으로 희석합니다. SDA 플레이트에 각 희석제 50 마이크로리터를 시드하고 48시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 식민지를 계산하고 수식을 적용합니다.건성 중량 분석을 위해, 첫째로 계량하고 마이크로 원심분리기 관을 레이블. 생물막 서스펜션의 0.1 밀리리터와 절대 에탄올 1 밀리리터를 튜브에 넣고 18시간 동안 음수 섭씨 20도에 보관하십시오. 그런 다음 원심 분리기가 10 분 동안 10, 000 배 G를 원심분리합니다.상체를 버리고 1 주일 동안 샘플을 건조기에 튜브를 놓습니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 무게를 다시 계량하고, 바이오매스 중량을 얻기 위해 뺄셈을 한다. 본 실험에서, 칸디다 알비칸스 생물막에 1분 동안 적색광을 가진 다이엠 치료 후, CFU는 염화나트륨으로 처리된 음의 대조군과 비교하여 감소되었다.매일 치료 후 칸디다 알비칸스 생물막의 바이오매스의 결과, 홍등 처리 그룹은 염화물로 치료 양성 대조군에서 관찰된 바이오매스의 유사한 감소를 제시한 것을 보여준다. 두 그룹은 또한 서로 통계적 유사성을 보였다. 둘 다 바이오매스의 감소를 보였지만, 염화나트륨으로 처리된 부정적인 대조군과 비교하였다.칸디다 알비칸의 열등한 양은 수용성 및 불용성 EPS로 관찰되었으며, 음의 대조군과 비교하여 양수 대조군에서 관찰되었다. 통계적으로 유의하지는 않지만 적색광의 디엠 적용시 EPS 용해성 및 EPS 불용성의 양을 수치적으로 감소시켰습니다. 음성 조절 및 적색광 처리단은 통계적 유사성을 보였다.정확한 적용 기간을 결정하기 위해 치료를 시작하기 전에 전력 계수를 사용하여 빛의 전력 밀도를 측정합니다. 단계는 에너지 밀도가 항상 섭리계의 87.6 줄이 될 것이라는 것을 보장합니다. 이전에 인용된 수식을 사용합니다.측정은 5밀리미터의 플레이트 병에 빛에서 동일한 것을 사용하여 이루어집니다. 광선 요법과 항진균 제 사이의 연관성은 적색광으로 전처리가 약물 적용에 이어 생물막내로의 약물 침투를 향상시키는지 확인하기 위해 연구될 수 있습니다. 매일 두 번 의 치료를 위해 우리는 실험실의 프로토콜을 조정하여 적색 광 처리 후 생존가능성, 건조 중량 및 세포 외 다당류 금액에 대한 해답을 제공하는 쉽고 재현 가능한 생물막 모델을 제공했습니다.프로토콜은 일반적이며 약물, 기타 조명 또는 빛과 약물의 조합을 포함한 적색 광 이외에 다른 치료법을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 미생물로 작업하려면 안전 안경, 버튼 랩 코트 및 니트로 장갑과 같은 특수 장비가 필요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을...

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

출처: 자오, K. 외 5-아미놀레불린산 매개 광역학 치료가 황색포도상구균 바이오필름에 미치는 영향을 연구하기 위한 시험관 내 모델. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 그람 양성 박테리아 바이오필름에 대한 항균 효과를 평가하는 광역학 치료 프로토콜을 시연합니다. 바이오필름은 네 그룹으로 나뉩니다: 두 그룹은 광감성 전구체를, 두 그룹은 완충제를 받습니다. 모든 종은 어두운 환경에서 배양되며, 이후 전구체 처리된 그룹과 완충 단독 그룹에 적색광 노출을 합니다. 반응성 산소 종은 전구체와 빛을 모두 받는 그룹에서만 생성되어 박테리아 세포 사멸을 초래합니다. 치료 효능을 평가하기 위해 모든 그룹에서 생존 가능성을 비교합니다.

광감감제 전구체를 이용한 박테리아 바이오필름의 광 활성화 처리

칸디다 알비칸스 생물막의 내부 특징을 보고 정량화하기 위해 굴절률 매칭을 통해 명확히 된 고정 된 손상되지 않은 표본을 준비합니다. 이어서, 광학 단면 현미경 검사법은 생물막의 전체 두께를 가하지만 3차원 이미지 데이터를 얻기 위하여 이용될 수 있다.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

약물 내성 칸디다 알비 칸스의 발생률이 증가하는 것은 전 세계적으로 심각한 건강 문제입니다. 항균 광역학 요법 (aPDT)은 약물 내성 곰팡이 감염에 맞서 싸울 수있는 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 시험관내에서 다약제 내성 C. 알비칸 균주에 대한 로즈벵골 매개 aPDT 효능을 기술한다.

로즈 벵골 매개 광역학 치료 칸 디다 알비칸을 억제하기 위해

C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하기 위해 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 환원 분석을 사용하는 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 프로토콜이 본원에 설명되어 있습니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석

이 프로토콜은 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 항균 광역학 요법(aPDT)의 적용을 설명합니다. aPDT는 커큐미노이드와 청색 LED 조명의 수용성 혼합물을 사용하여 수행되었습니다.

구강 칸디다증의 쥐 모델에 대한 커큐미노이드 매개 항균 광역학 요법

Candida spp. 약물 내성에서 몸집이 작은 군집의 중요성은 완전히 탐구되지 않았습니다. 항균 광역학 요법(aPDT)은 약물 내성 진균 감염에 대한 유망한 전략을 제공합니다. 이 연구는 로즈 벵골 매개 aPDT가 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 를 효과적으로 비활성화하고 몸집이 작은 콜로니를 유도하여 독특한 절차를 제시한다는 것을 보여줍니다.

로즈 벵골 매개 광역학 요법을 통한 칸디다 글라브레이트의 쁘띠 콜로니 유도

405nm 청색광 LED 장치는 콜라겐 기반 합성 피부 모델에서 다양한 상처 병원체에 대해 항균 효능을 입증합니다. 이 간소화된 시험관 내 접근법은 빛 기반 항균 치료의 초기 단계 평가에 있어 재현 가능하고 윤리적으로 실현 가능한 대안을 제공합니다.

콜라겐 기반 합성 피부 모델을 이용한 상처 병원체를 억제하는 청색광 LED 장치 연구

우리는 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한 방법을...

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

배우세요 Candida albicans 바이오필름 성장에 635nm 붉은 빛 광선요법을 적용하는 방법을. 48시간 동안의 치료 효과를 평가하여 항진균 치료의 새로운 가능성을 탐색합니다.

규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

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