Name: 낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 두 가지 검정법을 동시에 사용하여 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 선별하는 효율적인 방법을. 이 프로토콜은 저비용으로 최대 200개 화합물을 일주일에 신속하게 검사하여 세포독성 및 성장 조절 효과를 정확히 식별합니다.

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이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.

1. NSC 문화
참고: 인간 NSC 라인의 조작은 아래에 설명될 것이지만 모든 세포주가 이 프로토콜에 사용될 수 있다. 모든 세포 배양 작업은 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
<ol><li>지하 막 / 세포 외 매트릭스 (ECM)로 96 웰 플레이트를 코팅하십시오.<ol>
<li>얼음에 NSC의 부착을 용이하게하는 ECM(재료의 테이블)의aliquot를 해동합니다. ECM을 10 mL 염기배지(표)에서적절한 농도(일반적으로 1:100)로 희석하고, 96웰 플레이트의 60개의 내부 웰각각에 웰당 50 μL을 첨가한다(그림1). 가장자리 효과16에서발생할 수 있는 아티팩트를 피하기 위해 내부 60웰만 사용하십시오.</li>
		<li>플레이트를 실온 또는 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에적어도 30분 동안 앉게 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해리 및 플레이트 신경 줄기 세포. 참고: 이 방법에서 사용하기 위한 세포는 T75 플라스크에서 적어도 80% 합류로 성장되어야 한다.<ol>
<li>37°C에서 세포 배양 인큐베이터에서 T75 플라스크에서 배양 세포는 기본 배지, B27, 비필수 아미노산, 2 mM 글루타민, 및 10 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(FGFb 또는 FGF2)로 구성된 NSC배지에서 5% CO2를 한다.</li>
		<li>인큐베이터에서 세포를 제거하고 80 % 합류에 도달하면 NSC 배지를 흡인하십시오. 적당량의 세포 해리 시약(T75 플라스크의 경우 3 mL) 첨가; 재료 표) 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양 후, 모든 세포가 분리될 수 있도록 T75 플라스크와 피펫에 NSC 배지 7mL를 적극적으로 첨가합니다. 해리된 세포 용액을 15 mL 튜브 및 원심분리기를 200 x g에서 5분 동안 이송합니다.</li>
		<li>원심 분리 후, 관에서 상온을 제거하고 NSC 배지 및 카운트 세포의 10 mL에서 세포를 다시 중단.</li>
		<li>NSC 배지로 세포의 농도를 200,000 세포/mL로 재조정합니다. 웰에 균일 한 도금세포를 완전히 재중단되었는지 확인하십시오.</li>
		<li>플레이트 100 μL은 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 코팅된 3개의 96웰 플레이트의 60개의 내부 웰에서 세포 혼합물(20,000 셀)을 한다. 8채널 멀티채널 파이펫터의 8개 슬롯 중 6개 슬롯을 열별로 플레이트 셀에 사용합니다.</li>
		<li>셀이 없는 모든 웰에 100 μL의 염기 배지 또는 NSC 배지를 추가하여 가장 바깥쪽 우물에서 발생할 수 있는 증발을 최소화합니다.</li>
		<li>세포 배양 현미경하에서, 세포가 예상 된 밀도에서 시드되는지 확인하기 위해 3 개의 96 웰 플레이트 각각에 적어도 10 개의 우물을 육안으로 검사합니다. 세포가 너무 희소하거나 조밀 한 밀도로 도금된 경우 분석으로 진행하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 화합물로 세포 치료
참고 : 이 데모에서 테스트 된 홈 메이드 라이브러리에는 날개없는 / 통합 (Wnt), 레티노산, 성장 인자 베타 (TGF-β) 및 소닉 고슴도치 신호 경로뿐만 아니라 다양한 티로신 키나아제를 조절하는 화합물이 포함되어 있습니다.
<ol><li>
독성/세포 수에 대한 예비 1차 화면
	<ol>
<li>Aliquot 50-100 mL 의 50-100 mL 의 57 테스트 화합물(보충 표 1)100% 디메틸 설폭화물 (DMSO)에 10mMM의 농도로 내부 60 웰의 U 바닥, V 바닥 또는 둥근 바닥 96 웰 플레이트와 3 개의 DMSO 우물을 제어 (참조) 플레이트 맵에 대한 그림 1). 이것은 여러 번 동결 및 해동될 수 있는 화합물의 25 μL을 가진 마스터 화합물 플레이트로서 작용할 것이다. 참고 : 평평한 바닥 판은 벤치 상단 파이프터로 소량의 화합물을 흡인하는 것이 더 어려울 것이기 때문에 사용해서는 안됩니다.</li>
		<li>섹션 1에 기재된 바와 같이 분할후 인큐베이터 16-24시간에서 세포 배양 플레이트를 제거하고 8채널 멀티웰 플롯 중 6개만을 사용하여 8채널 멀티웰 피펫기로 NSC 배지 컬럼바이컬을 흡인한다. 3개의 복제 플레이트 각각에 95 μL의 신선한 NSC 배지를 첨가하고 아래 2.1.4단계가 완료될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다.</li>
		<li>8채널 멀티웰 피펫터가 있는 빈 U-bottom, V-바닥 또는 둥근 바닥 96웰 플레이트의 내부 60개 웰각각에 49 μL의 NSC 배지를 추가합니다. 마스터 컴파운드 플레이트를 풀고 벤치 상부 피펫터 또는 동등한 계측기를 사용하여 마스터 플레이트로부터 화합물의 1 μL을 각각의 내부 60웰에서 NSC 배지의 49 μL로 파이펫에 넣습니다.</li>
		<li>희석된 화합물을 벤치 상단 피펫터와 3x 혼합합니다.</li>
		<li>인큐베이터에서 3개의 96웰 플레이트를 제거하고, 벤치 탑 피펫으로 각 희석 화합물의 피펫 15 μL을 제거하고 3개의 플레이트 각각에 5 μL의 화합물을 분배한다. 참고: 이 1:20 단계 2.1.3단계에서 초기 1:50 희석과 함께 세포 내로 화합물의 희석은 1:1000 희석을 산출하여 NSC에 화합물의 최종 농도가 0.1%의 DMSO 농도와 최종 10 μM이 되도록 합니다. DMSO 제어에 대한 농도는 0.1%가 됩니다.</li>
		<li>72 시간 동안 화합물로 세포를 배양하고 세포 독성 세포 독성 세포 로 진행합니다. 더 짧은 간격을 사용할 수 있습니다 하지만 72 시간 잠복기 테스트 화합물의 잠재적인 세포 독성 효과 극대화 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
투여량 반응 분석 참고: 투여량 응답에 사용되는 96웰에 대한 설정은 그림 2에 표시되어 있습니다.
	<ol>
<li>6개의 DMSO 대조군을 위해 컬럼 2를 사용하여 10 μM의 고용량으로 시작하여 6회 투여량에서 2배 직렬 희석에서 최대 3개의 상이한 화합물을 복제하고 시험합니다.</li>
		<li>DMSO 또는 시험 화합물 의 4 μL을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 NSC 배지의 196 μL로 희석한다. B2-G2의 우물 열에 25 μL의 DMSO를 추가하고 B3-B11에서 테스트 화합물의 50 μL을 행에 추가하고 10 mM의 세 가지 테스트 화합물을 B3-B5, B6-B8 및 B9-B11행으로 삼중배액으로 추가합니다.</li>
		<li>96웰 플레이트의 내부 부에 남아 있는 빈 컬럼에 NSC 배지의 피펫 25 μL. 다중 채널 파이펫터로 웰 B3-B11에서 25 μL의 화합물을 제거하고, 웰 C3-C11에 추가하고, 적어도 5번 혼합합니다. 나머지 행에 대 한 프로세스를 반복 2 배 희석에서 삼각계를 생성 하는 각 화합물에 대 한 총 6 개의 복용량에 대 한.</li>
		<li>섹션 2.1에서 기본 화면에 대해 설명된 대로 투여량 응답에 대한 NSC를 생성한다. 투여량 반응에 대한 화합물은 단계 2.1.5 및 2.1.6에 기재된 바와 같이 세포상에 정확하게 첨가및 배양된다. 참고: 투여량 반응 분석의 3개의 생물학적 복제는 별도의 날에 상이한 구절에서 NSC에 대한 분석검사를 반복함으로써 수행된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 플레이트 리더의 이미징 셀
<ol><li>세포가 할당된 시간 동안 화합물로 배양된 후, 플레이트 리더상에서 이미지 셀은 웰당 전처리 세포 수를 결정한다. 참고 : 이미징 세포에 대한 지침은 독자에 특정하지만 일반적으로 유사한 전략을 따릅니다. 아래 지침은 이데모(재질 표)에사용된 판독기에 적용됩니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트 리더 내부에 놓습니다. 이미저 소프트웨어를 열어 스터디용 프로토콜 및 실험 파일을 설정합니다. 작업 관리자에서 이미저 수동 모드로 이동하여 지금 캡처를 클릭합니다....</li>
	<li>용기 유형으로 96웰 플레이트를 선택하고 배율을 위해 10x를 선택하고, 이미징 tdTomato의 경우 적색 형광 단백질(RFP) 531 및 593을 선택합니다. 웰을 선택한 다음 자동 초점을 클릭하여 이미지에 초점을 맞추고 적절한 노출 시간을 위해 자동 노출을 클릭합니다. 필요한 경우 초점과 노출을 수동으로 조정합니다.</li>
	<li>적절한 초점과 노출이 완료되면 카메라 아이콘을 클릭하여 사진을 캡처합니다. 그런 다음 이미지 위의 프로세스/ANALZYE를 클릭하여 프로토콜을 계속 빌드하고 분석 탭을 선택합니다.</li>
	<li>이미지 오른쪽에 있는 분석 추가 단계에서 셀룰러 분석을 클릭하고 시작을 클릭합니다. 각 개별 셀을 나타내기 위해 강조 표시된 셀이 이미지에 표시됩니다. 옵션 선택을 클릭하여 형광 임계값 또는 셀 크기에 따라 더 나은 셀을 선택하도록 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 이미저에서 셀을 올바르게 계산하는 경우 화면 하단의 단계 추가를 클릭합니다.</li>
	<li>화면 상단의 아이콘을 클릭하여 이미지 세트에서 실험 만들기를클릭하여 실험창을 엽니다. 일단 열리면 프로토콜 탭 아래에서 프로시저를 클릭하고 열리는 새 창에서 읽기를선택한 다음 새 창에서 전체 플레이트를 클릭하여 셀을 포함하는 60개의 웰만 선택합니다(B2... G11). 확인을 클릭하여 변경 내용을 저장한 다음 절차 창에서 확인을 클릭합니다.</li>
	<li>이제 이 프로토콜로 플레이트를 이미지화할 수 있으며 실험 파일을 저장할 수 있습니다. 플레이트를 실행하려면 재생 아이콘을 클릭합니다. 첫 번째 플레이트가 이미지화되면 다른 두 플레이트를 이미지화합니다. 이미징이 완료되면 분석을 위해 셀 카운트 데이터를 스프레드시트에 다운로드합니다. 모든 이미지를 10배 배율로 찍습니다.</li>
</ol>4. 말단 MTT 세포 독성 분석
참고 : tdTomato 이미징을 완료 한 후 2 시간 이내에 MTT 분석시험을 시작합니다.
<ol><li>25 mg의 MTT를 계량하고 NSC 매체의 5 mL에서 다시 중단하여 5 mg / mL MTT 재고 솔루션을 만드십시오. MTT의 눈에 보이는 침전이 없을 때까지 용액을 소용돌이치며, 이는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>인큐베이터로부터 세포 배양 판을 제거하고 세포 배양 배지를 흡인한다. MTT 1:10을 세포 배양 배지에서 희석시키고 각 유정에 MTT 100 μL을 첨가한다.</li>
	<li>2 시간 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다. 보라색 침전제는 우물에있는 세포의 수에 비례하여 대략 적으로 볼 수 있어야합니다. MTT 용액을 플레이트에서 흡인하거나 플레이트를 신속하게 반전하여 플레이트에서 용액을 플릭합니다.</li>
	<li>각 우물에 50 μL의 100% DMSO를 추가하고 400 rpm에서 10 분 동안 실온에서 접시를 흔들어줍니다. 플레이트 리더에서 595 nm에서 각 웰의 흡광도를 읽고 분석을 위해 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>적절한 소프트웨어 (상용 스프레드 시트, R)와 tdTomato 세포 수와 흡광도의 분석을 수행합니다. 정상화를 위해 각 플레이트에 복제된 3개의 DMSO 의 흡광도 또는 셀 수에 대한 평균을 계산한 다음 플레이트의 각 웰에 대한 셀 수 또는 흡광도값을 이 평균으로 나누고 백분율로 변환합니다. 이것은 각 플레이트에 대한 DMSO 제어에 비해 정규화된 세포 수 또는 흡광도를 산출한다.</li>
	<li>세 플레이트의 복제 웰에 대한 평균 정규화 개수 또는 흡광도 및 표준 편차를 계산합니다. 참고: 이 시점에서 정규화된 값의 네 가지 세트가 있어야 합니다: 각 플레이트에 대해 하나, 세 개의 복제 플레이트에 대해 평균 하나.</li>
	<li>세 복제 플레이트에 걸쳐 평균에 대해 25% 이하의 정규화된 값을 사용하여 화합물을 독성으로 분류합니다. 또한, 화합물당 단일 처리만이 각 플레이트에서 수행되므로, 3개의 복제 플레이트 모두에 이 임계값 이하로 떨어지는 화합물만 독성으로 분류됩니다. 이 분석이 독성으로 필터링하여 독성을 시각적으로 확인하는 모든 화합물의 형광 이미지를 검사합니다. 참고: 성장 억제 또는 성장 강화 효과를 가진 화합물의 식별은 각 플레이트에 복제물이 부족하기 때문에 이러한 유형의 예비 분석에서 평가하기가 더 어렵다. 그러나, 다음은 감속 하거나 세포 성장을 향상 시킬 수 있는 화합물을 식별 하는 빠른 방법.</li>
	<li>각 플레이트에서 3개의 복제 된 DMSO 컨트롤에 대한 표준 편차를 계산한 다음 DMSO 컨트롤 위 또는 아래에 평균 값이 두 개 이상 있는 화합물을 필터링합니다. 세 판의 각각에이 필터에서 떨어지는 화합물은 추가 조사를 보증 할 수있다.</li>
	<li>1차 독성 스크린으로서 투여량 반응에 대해 동일한 분석 전략을 사용한다. 각 생물학적 복제에 대한 DMSO 컨트롤의 평균을 계산하고 이러한 값을 사용하여 각 화합물/투여량 조합에 대한 백분율 라이브 셀 또는 퍼센트 흡광도를 정규화합니다. 세 가지 생물학적 복제에 대한 모든 화합물/투여량 조합에 대한 평균 및 표준 오차를 계산합니다.</li>
	<li>농도를 로그 값으로 변환하고, 농도 로그 대 정규화된 생존 가능성에 대한 투여량 응답 곡선을 생성하고, 비선형 회귀 분석으로 곡선에 맞춥습니다(분석은 R 또는 다양한 상업적 통계에서 수행될 수 있습니다) 패키지)를 참조하십시오. 치명적인 복용량을 계산 50 (또는 기술적으로이 경우 실행 가능한 복용량 50) 또는 이 곡선의 방정식에서 50% 독성을 초래 하는 화합물의 농도. 많은 소프트웨어 패키지가 자동으로 이 수치를 계산합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

이 문서의 주요 목표는 낮은-중간 처리량 스크리닝에서 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 효율적이고 저렴하게 식별할 수 있는 전략을 설명하는 것이었습니다. 2개의 직교 기술은 결론에 있는 신뢰를 증가하고 단 하나 분석분석만 사용된 경우에 유효하지 않을 추가 통찰력을 제안하기 위하여 세포 수를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 상기 한 가지 는 형광 세포 이미저를 사용하여 tdTomato 양성 세포를 직접 카운트하고 두 번째는 MTT를 포르마잔으로 갈라서 세포 번호10의프록시역할을 하는 미토콘드리아의 잘 특성화된 능력에 의존하였다. 분석의 MTT 날개가 2,000 화합물14만큼라이브러리를 테스트하는 데 사용되었지만 총 57 개의 시험 화합물이 이 데모에서 평가되었습니다. 스크린의 결과는 두 개의 계산서가 더 자신있게 특정 결론에 도달하기에서 서로를 강화할 수 있는 방법을 지적하고, 두 개의 계산제가 일반적으로 추가 정보를 제공하는 상호 보완적인 시...

치료 잠재력을 가지고 있는 화학 화합물에 대 한 결정 해야 하는 가장 중요 한 특성 중 하나는 동물 세포에 그것의 독성. 이 특성은 약물이 더 광범위한 연구를위한 좋은 후보인지 여부를 결정합니다. 대부분의 경우, 최소한의 독성을 가진 화합물이 모색되지만 특정 세포 유형을 죽일 수 있는 능력을 가진 화합물이 관심있는 상황이 있습니다, 예를 들어, 항 종양성 약물. 전체 동물이 전신 독성을 결정하는 가장 좋은 모델 시스템이지만, 몇 가지 화합물을 테스트해야 할 때 관련된 비용과 노동력은 엄다합니다. 이와 같은 포유류 세포 배양은 일반적으로 가장 효율적인대안1,2로사용된다. 중소형 처리량 약물 스크린은 세포 배양에서 독성을 평가할 수 있는 중요한 양상입니다. 이러한 화면은 개별 신호 경로를 대상으로 하는 추가라이브러리를 심문하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 스크린의 일반적인 형식은 처음에 예비 1차 독성 화면에서 단일 용량(일반적으로 10 μM)으로 라이브러리의 모든 화합물을 테스트한 다음, 독성을 완전히 특성화하기 위해 심층적인 이차 용량 응답 스크린을 수행하는 것입니다. 기본 화면에서 조회수의 프로필을 볼 수 있습니다. 이 전략을 구현하는 방법은 여기에 설명되어 독성 화합물을 식별하고 특성화하는 빠르고 효율적이며 저렴한 방법을 제공합니다.
포유류 세포에서 작은 화합물 및 나노 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다3,4. 특정 물질이 잘못된 결과를 제공하는 분석과 상호 작용할 수 있으며, 독성 화면에서 안타를 특성화 할 때 이러한 상호 작용을 테스트해야합니다4. 세포독성 분석법은 트라이판 블루 배제5,락테이트 탈수소효소(LDH) 방출분석분석6,알라마르블루분석7,칼시엔 아세톡시메틸에스테르(AM)8,ATP 분석기9를포함한다. 이 모든 측정은 세포 번호에 대한 프록시 역할을 할 수있는 세포 대사의 다양한 측면을 측정합니다. 모든 혜택을 제공하는 동안, 테트라 졸륨 염계 측정기 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테테라졸리움 브로마이드(MTT), 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페니)-2H-테트라즈리움-1-카르데 및 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-니트로페닐]-2H-5-테트라졸리오)-1,3-벤젠 이설포네이트 (WST-1)10,11은 저렴한 비용으로 좋은 정확성과 사용 편의성을 제공합니다. 이 데모에서 사용되는 MTT는 미토콘드리아 환원효소에 의해 불용성 포르마잔으로 감소되고 이 변환의 속도는 세포 수와 강하게 상관관계가 있다. 이 분석은 작은 규모와 최대 2,000 개의 화합물12를가진 선별 라이브러리에 일상적으로 활용되었습니다. 표지된 마커에 의한 세포의 직접 계수는 세포 수를 평가하는 또 다른 방법을 제공하며, MTT 분석과는 달리 세포 성장의 역학에 대한 추가 정보를 제공할 수 있다. 공개적으로 사용할 수 있는 여러 알고리즘은 자동화된 셀 수 분석을 수행할 수 있으며 이미징 판독기13,14를위한 소프트웨어 패키지의 일부인 독점 알고리즘도 있습니다. 이 방법 설명에서, tdTomato15를 구성적으로 발현하기 위해 유전자 편집된 인간 신경 줄기 세포(NSC) 라인은 MTT 분석과 자동화된 세포 계수 사이의 세포 생존 결과를 비교하는 테스트 라인역할을 할 것이다. 57 개의 시험 화합물의 독성을 평가하는 화면에서 분석. 이 전략의 주요 목표는 독성 화합물을 식별하고 특성화하는 것이었지만, 잠재적으로 성장 억제 및 성장 강화 화합물을 식별하는 추가적인 이점을 가지고 있으므로 약물을 식별하는 효과적인 방법을 제공합니다. 즉, 세포 성장을 조절 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>B-27 (50X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>신경 줄기 세포 배지 구성 요소&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>벤치탑 피펫터</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>73990</td>은 <td>한 번의 샷으로 화합물 라이브러리를 96웰 플레이트에 피펫팅할 수 있는 기능을 제공합니다.</td></tr><tr><td>BioLite 96웰 멀티디쉬</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td>모든 96웰 세포 배양 플레이트가 작동합니다.&nbsp; 우리는 이것을 우리의 작업에 사용합니다.</td></tr><tr><td>세포 배양 현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>적절한 밀도를 보장하기 위한 세포의 육안 검사.</td></tr><tr><td>Cytation 5/ 이미징 리더</td><td>BioTek</td><td>CYT3MFV</td><td>세포 이미징 및 흡광도 판독에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>610420010</td><td>스크린에 사용되는 화합물용 용매. 흡광도 측정을 용이하게 하기 위해 MTT 침전물을 용해시킵니다.</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>신경 줄기 세포 배지 구성 요소.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>GelTrex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>신경 줄기 세포 기저막 매트릭스.&nbsp; 세포를 세포 배양 플레이트에 부착할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Gen5 3.04</td><td>BioTek</td><td></td><td>분석 소프트웨어는 tdTomato 발현 세포의 세포 수를 측정합니다.</td></tr><tr><td>글루타민</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td>신경 줄기 세포 배지 구성 요소.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Microtest U-Bottom</td><td>Becton Dickinson</td><td>3077</td><td>화합물 라이브러리 저장.</td></tr><tr><td>MTT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M6494</td><td>세포 생존율을 측정하기 위한 활성 분석 시약.</td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Rainin</td><td>E8-1200</td><td>세포 배양 배지, MTT 또는 DMSO의 컬럼별 첨가.</td></tr><tr><td>Neurobasal 배지</td><td>ThermoFisher Scientific 21103049</td><td></td><td>신경 줄기 세포 기본 배지.</td></tr><tr><td>RFP 필터 큐브</td><td>BioTek</td><td>1225103</td><td>필터는 tdTomato 발현 세포를 이미지화하는 데 사용되는 Cytation 5의 필터입니다.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605036</td><td>세포 해리 시약.</td></tr></tbody></table>

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

세포 독성은 치료 혜택을 가질 수 있는 약물을 공부할 때 정량화 될 필요가 중요 한 매개 변수. 이 때문에, 많은 약물 스크리닝 검사는 개별 화합물에 대해 프로파일화되는 중요한 특성 중 하나로 세포 독성을 이용한다. 배양되는 세포는 더 비싸고 노동 집약적인 동물 모형에 있는 유망한 지도 화합물에 후속을 진행하기 전에 세포 독성을 평가하는 유용한 모형입니다. 우리는 인간 신경 줄기 세포 (NSC) 선을 표현하는 tdTomato에 있는 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 확인하는 전략을 기술합니다. 이 전략은 세포 수를 평가하기 위해 2개의 상보적인 assays를 이용합니다. 1개의 분석제는 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 브로마이드(MTT)의 감소를 통해 세포 수에 대한 프록시로서 포르마잔을 하고 다른 하나는 직접 TdTomato 발현 NSC를 계산한다. 2개의 실험은 단 하나 실험에서 동시에 수행될 수 있고 노동 집약적이고, 급속하고, 저렴하지 않습니다. 이 데모에 설명된 전략은 96웰 플레이트 형식의 독성에 대한 예비 1차 화면에서 57개의 화합물을 테스트했습니다. 3개의 안타는 1차 화면과 동일한 분석 설정을 사용하여 6점 투여 반응에서 더 특징을 보였다. 독성에 대한 우수한 부식을 제공하는 것 외에도, 두 가지 측정법의 결과의 비교는 세포 성장의 다른 양상에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 데 효과적일 수 있다.

자동화된 셀 카운트 데이터는 DMSO 제어로 정규화될 때 25% 미만의 생존율로 11개의 화합물을 확인했으며 MTT 데이터는 이러한 동일한 화합물과 2개의 추가 화합물을 확인하였다(표1 및 표 2,적색). MTT 분석(wells F3 및 G10)에서만 독성이 있는 것으로 밝혀진 두 화합물은 각각 31%와 39%를 가졌고, 대조군및 계급 순서에 의한 tdTomato 양성 세포의 수는 독성으로 간주된 후 이 라이브러리에서 다음으로 가장 독성이 강한 화합물 2개였다. 이 두 웰의 표준 편차 값은 평균을 왜곡한 세 개의 플레이트 사이에 이상치가 있음을 시사하지 않았으며, 세 개의 복제 플레이트 각각에 대한 숫자를 조사할 때 어느 쪽도 25% 임계값 아래로 떨어졌습니다. (데이터가 표시되지 않음) tdTomato 형광의 대표적인 이미지는 그림 3의여러 우물에서 표시됩니다. MTT와 세포 수 분석 사이의 독성에 대한 불협화음의...

배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

이 프로토콜은 동시에 세포 성장에 미치는 영향에 대한 수백 개의 화합물을 선별하기 위해 두 개의 분석서를 사용하는 빠르고 효율적인 전략을 제공합니다. 이 약제는 특정 화합물이 세포 독성인지, 세포 성장을 억제하거나, 세포 성장을 향상시키는지에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 두 가지 아세서를 함께 활용함으로써 정확도를 높이고 세포 독성 화합물을 식별할 수 있습니다.두 개의 아세의 결과가 분기하는 경우,이 전략은 우리가 다른 방법으로 더 검사 할 수있는 세포 기능에 고유 한 효과화합물을 식별 할 수 있습니다. 이 전략의 주요 장점은 빠르고 저렴하며 비노동 집약적이라는 것입니다. 일단 마스터, 그것은 연구원 쉽게 최대의 기본 화면을 수행 할 수 있습니다 200 일주일에 화합물, 다음에 철저한 용량 응답 곡선을 수행 10 받는 사람 15 다른 주에 화합물.절차를 시연하는 것은 나 자신과 로히니 Manickam, 실험실에서 직원 과학자 및 포스트 baccalaureate 동료가 될 것입니다. 첫째, 생물학적 안전 캐비닛에서, 배양 세포는 분석을 시작할 때 적어도 80%의 컨실수가 될 수 있도록 NSC 매체를 가진 T75 플라스크에 있는. 그리고 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.세포가 80%에 도달하면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 NSC 배지에서 흡인합니다. 세포 해리 시약 3 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에서 5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 플라스크에 NSC 배지 7밀리리터를 넣고 파이펫을 적극적으로 추가하여 모든 세포가 분리되도록 합니다.해리된 세포 용액을 15밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 200배 G로 전달합니다. 튜브에서 상체를 제거하고 NSC 배지의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 자동 세포 카운터 또는 혈혈계를 사용하여 세포를 계산하고, 튜브에 NSC 배지를 추가하여 밀리리터당 200, 000 세포로 세포의 농도를 재조정합니다.이어서, 세포외 매트릭스에 의해 코팅된 3개의 96웰 플레이트의 60개의 내부 우물에서 열로 셀 혼합물 컬럼의 100 마이크로리터를 플레이트에 8채널 멀티채널 파이펫터의 8개의 슬롯 중 6개를 이용하여. 세포가 없는 모든 웰에 100마이크로리터의 베이스 배지 또는 NSC 배지를 추가하여 세포를 포함하는 가장 바깥쪽 우물에서 잠재적인 증발을 최소화합니다. 세포 배양 현미경하에서, 세포가 예상된 밀도에 앉는다는 것을 확인하기 위하여 3개의 96의 우물 각각에 적어도 10개의 우물을 육안으로 검사합니다.섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 분리 후 16내지 24시간 인큐베이터에서 세포 배양판을 제거하고 8개의 멀티웰 피펫을 사용하여 8개의 채널 멀티웰 피펫기로 열별로 NSC 중간 열을 흡인하고, 8개의 다중 웰 슬롯 중 6개만 사용한다. 복제 플레이트 3개 의 각 웰에 95마이크로리터의 신선한 NSC 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.8개의 채널 멀티웰 피펫을 사용하면 49마이크로리터의 NSC 배지를 빈 U-바닥, V-바닥 또는 라운드 바닥 96 웰 플레이트의 내부 60웰에 추가합니다. 준비된 마스터 컴파운드 플레이트의 봉인을 해제합니다. 피펫 1 마이크로리터는 마스터 플레이트로부터 NSC 배지를 포함하는 내부 60개의 우물으로 각각 의 화합물을 삽입하고, 희석된 화합물을 벤치 탑 피펫터와 세 번 혼합한다.다음으로, 인큐베이터로부터 NSC의 96개의 웰 플레이트 3개를 제거하고, 세포를 포함하는 3개의 플레이트의 각각 에 5개의 마이크로리터를 분배하여 10 마이크로몰라의 최종 화합물 농도에 대해 1 내지 1000 희석을 산출하고, 72시간 동안 화합물을 함유한 0.1%의 배양세포를 0.1%의 배양세포로 진행한다. 용량 반응 분석을 수행하려면 96을 잘 설정하십시오. 6개의 DMSO 대조군 복제를 위한 2개의 열을 사용하고, 6회 복용량에서, 10 마이크로몰러의 고용량으로 시작하여, 두 배의 연속 희석에서 최대 3개의 다른 화합물의 트리클리타를 시험합니다.DMSO에서 100%DMSO 또는 테스트 화합물 의 4개의 마이크로리터를 0.5 또는 1.5 밀리리터 미세센트심분리기 튜브에서 NSC 배지의 196마이크로리터로 희석한다. 희석된 DMSO의 마이크로리터 25개와 희석된 시험 화합물 50개소를 해당 우물에 첨가합니다. 96 웰 플레이트의 내부 부분에 남아있는 빈 우물에 NSC 매체의 파이펫 25 마이크로 리터.멀티채널 피펫터를 사용하여, 10 마이크로몰라 우물에서 5개의 마이크로몰러 우물로 화합물의 25 마이크로리터를 전송하고, 적어도 5회 혼합한다. 파이펫 팁을 교체하고, 나머지 행을 혼합하여 각 화합물에 대해 총 6회 동안 두 배의 희석제에서 삼중액을 생성하여 프로세스를 반복한다. 각 희석제의 5마이크로리터를 테스트 중인 배양 세포가 있는 새로운 플레이트로 옮겨넣습니다.플레이트를 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 놓습니다. 세포가 72시간 동안 배양된 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트 판독기 내부에 배치합니다. 이미지 기 소프트웨어를 열어 스터디에 대한 프로토콜 및 실험 파일을 설정합니다.작업 관리자에서 이미저 수동 모드로 이동하여 지금 캡처를 클릭합니다. 용기 유형으로 96 웰 플레이트를 선택합니다. 배율에 대해 10회, 적색 형광 단백질 531 및 593을 선택하여 이미징 tdTomato을 선택합니다.우물을 클릭합니다. 그런 다음 자동 초점을 클릭하여 이미지에 초점을 맞추고 적절한 노출 시간을 위해 자동 노출을 자동으로 노출합니다. 필요한 경우 초점과 노출을 수동으로 조정합니다.카메라를 클릭하여 사진을 캡처합니다. 그런 다음 위의 이미지 분석 프로세스를 클릭하여 프로토콜을 계속 빌드합니다. 그리고 분석 탭을 선택합니다.이미지 오른쪽에 분석 추가 단계에서 셀룰러 분석을 클릭하고 시작을 클릭합니다. 이미지는 각 개별 셀을 나타내기 위해 강조 표시된 셀을 보여줍니다. 옵션 선택을 클릭하여 형광 임계값 또는 세포 크기에 따라 세포를 더 잘 선택하도록 매개 변수를 변경합니다.이미저가 셀을 제대로 계산하는 경우 화면 하단의 단계 추가를 클릭합니다. 화면 상단의 아이콘을 클릭하여 이미지 집합에서 실험을 만듭니다. 열린 창에서 프로토콜 탭 아래에서 절차를 클릭합니다.그런 다음 열리는 새 창에서 읽기를 선택합니다. 전체 플레이트를 클릭하여 셀을 포함하는 60개의 우물만 선택합니다. 확인을 클릭하여 변경 내용을 저장합니다.그런 다음 프로시저 창에서 확인을 클릭합니다. 플레이트를 실행하려면 재생 아이콘을 클릭합니다. 프롬프트에서 파일을 저장한 다음 로드 플레이트 프롬프트에서 확인을 클릭합니다. 이미징이 완료되면 이미저 소프트웨어 프로그램에서 셀 카운트 데이터를 스프레드시트에 다운로드하여 분석을 합니다.tdTomato 이미징을 완료한 지 2시간 이내에 MTT 분석서를 시작합니다. 25 밀리그램의 MTT를 계량하고 NSC 매체의 5밀리리터로 다시 일시 중단하여 밀리리터 MTT 스톡 솔루션당 5밀리그램을 만듭니다. MTT의 눈에 보이는 침전이 없을 때까지 몇 분 동안 솔루션을 소용돌이.인큐베이터에서 세포 배양 판을 제거하고 세포 배양 배지를 흡인시합니다. MTT를 신선한 NSC 배지에 1-10을 희석하고 희석된 MTT의 마이크로리터 100개를 각 셀웰에 추가합니다. 2 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오.순수한 침전은 우물의 세포 수에 비례하여 대략 적으로 보입니다. MTT 용액을 플레이트에서 분리하고 각 웰에 100% DMSO의 50마이크로리터를 추가합니다. 400 RPM에서 10 분 동안 실온에서 셰이커에 접시를 놓습니다.그 후 플레이트를 플레이트 판독기로 옮기합니다. 595 나노미터의 사전 설정된 파장에서 각 우물의 흡광도를 읽고, 데이터를 스프레드시트로 내보내 분석용 데이터를 셀 카운트 데이터와 정확하게 분석한다. tdTomato 형광 이미지의 검사는 MTT와 세포 수 분석 사이의 독성에 대한 두 개의 우물 불화를 밝혀.하나 잘, 세포 수 데이터는 독성을 제안하지. 그러나 MTT 데이터는 그랬습니다. 또 다른 잘 tdTomato 수에 비해 MTT에 의해 세포 수를 과대 평가했다, 더 큰 세포를 가지고 있는 것으로 나타났다, 반면 MTTt tdTomato에 비해 셀 수를 과소 평가 우물에서, 세포는 더 작은 것으로 나타났다.요약하자면, tdTomato 분석은 11개의 화합물을 독성으로 분류하고, 11개의 성장 억제제로서, 성장 촉진으로, 34는 세포 성장에 명백한 영향을 미치지 않는다. MTT 분석 분류 13 독성으로 화합물, 성장 억제로 두, 성장 향상으로 하나, 와 41 세포 성장에 명백한 영향을 미치지. 화합물 WP1066에 대한 실행 가능한 세포의 그래프는 4개의 가장 낮은 농도에 대한 독성이 없는 비교적 평평한 곡선을 나타낸다.곡선은 5 개의 마이크로 몰라 용량에서 급속히 떨어지고, 10 마이크로 몰러에서 거의 완전한 독성으로 떨어지며, 이는 tdTomato 분석 및 MTT 분석에 대한 치명적인 용량 50을 4.4 및 6.0 마이크로 몰러로 이끕다. 올바른 용량 반응 곡선이 생성되도록 화합물이 용량 반응 화면에서 제대로 희석되는 것이 중요합니다. 세포 성장에 영향을 미치는이 절차에 의해 확인 된 화합물은 세포 성장을 제어 하는 잠재적으로 새로운 신호 경로를 식별 하기 위해 기능적인 에세이에 의해 더 특징지을 수 있습니다.신경 줄기 세포에 독성 화합물은 뇌암에 대 한 잠재적인 치료 약으로 테스트 되었습니다., 교 모 세포 종 및 신경 모세포종 등. 포유류 세포, DMSO 및 MTT를 취급할 때 항상 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오. 기관의 화학 폐기물 지침에 따라 DMSO 및 MTT를 폐기하십시오.

a-strategy-to-identify-compounds-that-affect-cell-growth-survival

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

여기에서는 펩티딜아르기닌 데이미나제(PADI) 효소 억제제인 BB-Cl-아미딘이 체외 유방암 종양원성에 미치는 영향을 테스트하기 위해 연질 한천 집락 형성 분석법을 사용하는 방법을 문서화합니다.

소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

이 문서에서는 성공적으로 항균 약물 발견 및 화합물 테스트를위한 새로운 강력한 도구를 제공, 녹농균에 순환 디 GMP의 세포 수준을 조작 할 수있는 잠재적 능력을 작은 분자의 큰 라이브러리를 스크리닝하기 위해 설립 된 높은 처리량 분석에 대해 설명합니다.

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

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마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

이온 채널의 약리학적 표적화는 고형 종양을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 암세포에서 이온 채널 기능을 특성화하고 암 생존력에 대한 이온 채널 조절제의 효과를 분석하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

암세포의 이온 채널 스크리닝

여기에서는 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 루시페라아제 기반 리포터 분석을 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

자가포식 관련 4B 시스테인 펩티다아제 억제제에 대한 세포 기반 약물 스크리닝

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

배우세요 포유류 세포에서 두 가지 검정법을 동시에 사용하여 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 선별하는 효율적인 방법을. 이 프로토콜은 저비용으로 최대 200개 화합물을 일주일에 신속하게 검사하여 세포독성 및 성장 조절 효과를 정확히 식별합니다.

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

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