전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

이 재현 가능하고 수행하기 쉬운 프로토콜은 전 생체 임파선 이미징 전략을 사용하여 생체 내 투여 형광 표시 항체를 국소 이차 림프성 장기로 배출하는 것을 추적합니다. 이 기술을 시연하면 프로시저의 특정 시각화를 허용하므로 프로토콜을 성공적으로 실행할 수 있습니다. 이것은 누구나 수행 할 수있는 매우 간단하고 간단한 기술입니다.

유일한 어려운 측면은 몇 가지 교육이 필요한 마우스 처리입니다. 이 기술은 기존의 형광 염색 방법에 비해 향상된 속도 조직 노력 보존 및 세포 생존력의 이점을 갖는다. 절차를 훈련하는 것은 브루나 다테마츠, 실험실에서 기술자가 될 것입니다.

응모 림프절 이미징을 위한 PBS의 100 마이크로리터 또는 포라이트 림프절 이미징을 위한 PBS의 50 마이크로리터에서 적절한 형광에 컨쥬게이징된 관심 있는 항체를 희석시. 잉구림프 이미징의 경우 항체 칵테일 100마이크로리터를 1밀리리터 인슐린 주사기에 적재하고, 반인치 바늘로 30게이지를 장착하고, 실험마우스의 내부 허벅지에 항체를 피하한다. 포라이트 림프절 이미징의 경우, 실험 동물의 한 발 패드에 항체 칵테일 의 50 마이크로 리터를 피하로 주입하십시오.

그런 다음 동물을 홈 박스로 돌려보습니다. 림프절 수확을 위해, 주입으로부터 적어도 3 시간을 기다린 후, 접착 테이프로 아크릴 단계에서 마우스를 고정하고 복부 피부에 미네랄 오일을 적용합니다. 표준 미세 수술 가위와 미세 수술 곡선 집게를 사용하여 pubis에서 xyphoid 과정에 복부 근육에 중간 라인 피부 절개를하고 피부에서 복부 근육을 분리합니다.

수직 절개 라인의 상단과 하단에 수평 피부 절개를 만들고, 주입 측면에 피부 플랩을 만들고, 림프절을 시각화하기 위해 피부를 철회합니다. 아크릴 플레이트에 피부 플랩을 고정하고, 반투명, 일반적으로 담즙 구형 구형 구형 배수 림프절을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 포플라이트 배수 림프절 수확의 경우, 주입 후 적어도 12 시간, 아크릴 단계에서 경향이 위치에서 마우스를 고정.

동물의 주입 측에 송아지와 무릎에 미네랄 오일을 바치게 한다. 다음으로, 발뒤꿈치에서 무릎까지 종아리에 중간 절개를 하고, 피부에서 종아리 근육을 분리한다. 포라이트 포사노출.

포라이트 림프절은 포사 내의 반투명 구로 나타납니다. 그런 다음, 미세 수술 곡선 집게와 림프절을 제거합니다. 이미징을 위해 림프절을 준비하려면 전체 장기를 유리 바닥으로 35 x 10mm 배양 접시에 넣고 집게를 사용하여 조직을 둘러싼 지방을 제거합니다.

접시 중간에 오르간을 중앙에 두고, 식염수에 흠뻑 젖은 섬세한 작업 와이퍼로 조직을 덮습니다. 전 생체 내 이미징의 경우, 반전된 공초점 현미경 슬롯에 접시를 배치하고 공초점 현미경및 4-10X 목표의 종래의 빛을 사용하여 올바른 초점을 얻습니다. 광 기능에서 레이저 모드로 변경하고 동위원소 염색, 비염색, 또는 비형광 샘플을 사용하여 레이저 전력, 오프셋 및 게인을 조정하여 자동 형광 및 불특정 염색을 제거합니다.

림프절 구조 및 셀룰러 분포에 초점을 맞추고 1024 x 1024 픽셀 정의를 사용하여 4, 10 및 20X 목표에 따라 이미지를 획득합니다. 그런 다음 적절한 이미징 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 채널을 분리하고, 관심 있는 규모와 색상을 추가하고, 3D 뷰를 재구성합니다. 항 CD4 및 항 CD19 항체 및 공초점 이미징 분석을 통해 림프절 세포의 면역 라벨링의 강력한 조합은 잉구림프절 내의 T 및 B 세포의 국소화를 가능하게 합니다.

포클레아 림프절에서, 잉구 조직에서와 같이, B 세포 여포는 T 세포 인구, 림프절 구조의 특징에 둘러싸여 있습니다. 이러한 심상에서 관찰된 바와 같이, phagocytes는 주입된 항체를 내면화하지 않으며, 이는 B 및 T 세포 염색이 특이하다는 것을 나타낸다. 더욱이, 라벨링의 재재구성은 T 및 B 세포 염색이 겹치지 않는다는 것을 나타내며, 염색의 특이성을 더욱 확인한다.

단일 세포 세포는 캡슐 부비동을 포함하여 잉구 림프절 전체에서 관찰됩니다. CX3XR1을 발현하는 단일핵 세포의 대다수와 함께 CCR2 및 CXCR31CCR2 이중 양성 세포가 그 뒤를 이었다. 동일한 세포 분포 및 세포 표현형의 패턴이 포플라이트 림프절에서 관찰된다.

두 림프절은 또한 림프구에 의해 점유되는 단핵 세포 수용체 발현없이 어두운 영역을 전시한다. 더욱이, 단일핵 세포는 림프절의 내부 영역 내에서 부족하며, 조직의 외부 영역에 집중되어 있으며, 이는 이들 세포가 주로 림프절 캡캡슐 부동을 차지하고 있음을 나타낸다. 항체 혼합물은 림프절에 항체를 적절히 배출하기 위해 림프계를 위한 피하 조직내로 정밀하게 주입되어야 한다.

이 방법은 형광 표지 약물의 생체 분포에 적용될 수 있고, 형광 표시 나노 입자의 세포 표적 연구에 적용될 수 있다.