Name: 생체 내 전파 및 배양 VX2 세포에서 만든 후각 성 림프절증을 가진 정형 외 자궁 내막 암 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 학습하세요 VX2 세포 배양 및 정형 이식을 통한 토끼 자궁내막암 모델 제작 방법을. 후복막 림프절 전이를 재현하여 영상 유도 수술 기술 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 전임상 모델입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 테리 폭스 연구소에 의해 투자되었다 (PPG # 1075), 건강 연구의 캐나다 연구소 (재단 보조금 #154326), 캐나다 암 학회 연구소 (704718), 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회, 혁신과 공주 마가렛 암 재단에 대한 Сanada 재단.
초기 VX2 모델과 냉동 VX2 종양 블록의 설립을 위한 초기 VX2 세포를 제공한 마거리트 아켄스 박사에게 감사드립니다. 초기 VX2 세포 배양 실험을 수행하고 VX2 세포 배양을 돕는 Lili Ding을 도와준 마르코 디그라파에게 감사드립니다.

깊은 복벽 폐쇄: 복막 절개의 정점을 확인하고 조직 집게로 복막, 직장 근육 및 근막을 파악합니다. 모든 동물 연구는 대학 보건 네트워크의 동물 자원 센터 (ARC) 승인 된 시설에서 및 승인 된 동물 사용 및 관리 프로토콜 (AUP #3994 / #4299)에 따라 수행되었습니다. VX2 세포주 대학 건강 네트워크에 박사 Aken의 실험실에서 얻은.
1. 체외 VX2 세포주 생성
<ol><li>토끼 사두근 근육과 마우스 측면의 성장에서 VX2 종양을 수확.<ol>
<li>냉동 VX2 종양 블록(1 cm x 1 cm)을 해동하고, 메스 블레이드를 사용하여 배양 플레이트상에서 다진 70 μm 필터를 통해 소량의 행크스 균형 염액(HBSS)을 순차적으로 첨가하여 모든 세포가 최종 부피에 대해 1 mL의 변형되도록 한다.</li>
		<li>세포를 카운트하고 0.9% 인산완충 식염수로 희석하여 1 x10 7/mL의 농도로 희석하고 멸균 튜브에 얼음위에 놓습니다. 참고: 종양 블록은 토끼 사두근 근육에서 VX2 종양의 이전 전파로부터 실험실 협력자로부터 수득되었다.</li>
		<li>2-5% 흡입 된 이소플루란으로 여성 흰색 뉴질랜드 토끼 (무게 2.5-3.5 kg)를 마취시키고 주사 부위 위에있는 모피를 제거하고 포비도 요오드 용액으로 주사 부위를 정화합니다. 토끼의 사두근 근육에 제조된 VX2 세포 현탁액(5 x 106 세포/mL)의 500 μL을 주입한다. 10일째부터 종양 성장을 위해 토끼를 임상적으로 모니터링한다.</li>
		<li>종양이 수의사 승인 방법을 사용하여 직경 1-1.5 cm (캘리퍼스로 외부로 측정)에 도달 한 후 토끼를 안락사시하십시오. 심박수와 호흡률을 포함한 활력 징후를 확인하여 안락사를 확인합니다. 베타딘 용액으로 부위를 청소 한 후 멸균 기구를 사용하여 종양을 절제하십시오.</li>
		<li>멸균 기구를 사용하는 생물학적 안전 캐비닛에서 메스 블레이드를 사용하여 10cm 조직 배양 접시에 작은 조각 (0.2 cm)으로 종양을 다듬습니다. 1.1.1단계에서 기재된 바와 같이 1 mL의 HBSS를 사용하여 70 μm 세포 스트레이너를 통해 종양 단편을 전달한다. 세포를 카운트하고 0.9% 식염수 용액을 사용하여 희석하여 200 μL에서 7.5 x 105 세포를 얻었다.</li>
		<li>1 L/min에서 4% 이소플루란을 사용하여 남성 NOD scid 감마 마우스(체중 25 g)를 마취시키고 2% 이소플루란을 사용하여 마취를 유지합니다. 일단 마우스가 마취되면, 27 게이지 바늘을 사용하여 마우스 측면의 피하 조직에 1.1.5 단계에서 용액의 200 μL을 주입합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시험관내 VX2 세포의 수확 및 통과<ol>
<li>종양이 캘리퍼스를 사용하여 직경 1cm에 도달 할 때까지 임상적으로 두 번 이종이식 성장을 모니터링하십시오.</li>
		<li>CO2 챔버에 놓거나 4% 이소플루란 가스로 마취한 후 자궁 경부 탈구를 수행하여 마우스를 안락사시한다. 생물학적 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 종양을 절제합니다.</li>
		<li>메스를 1-2 mm 조각으로 1-2 mm 조각으로 다진 6 cm 조직 배양 접시에 포함 된 3 mL의 덜베코 의 변형 된 독수리 매체 (DMEM)/Ham의 F12+ 10% 태아 소 혈 청 (FBS) 매체.</li>
		<li>세포가 종양 조각에서 자라기 시작할 때까지 2 일 동안 5 %CO2로 37 °C 인큐베이터에서 종양 조각을 방해받지 않고 둡니다. 그 후, 세포 합류를 위한 가벼운 현미경 검사법에 의해 매일 배양된 플레이트를 확인하십시오. 70% 합원에 도달하면, 플라스크에 0.05% 트립신의 1 mL을 추가하고 5분 동안 37°C 인큐베이터에 다시 놓음으로써 세포를 트립시니화한다.</li>
		<li>DMEM/Ham의 F12 + 10% FBS 배지로 트립신을 중화하고, 300 x g에서5분 동안 4°C에서 세포와 원심분리기를 수집합니다. 새로운 DMEM/Ham의 F12 + 10% FBS 용지의 3.5 mL에서 상류층 및 재서스펜션 펠릿을 제거합니다. 씨앗 신선한 6 cm 콜라겐 I 는 약 50 % 세포 파종 밀도를 달성하기 위해 플레이트 당 1.6 x 106 세포로 플레이트를 코팅했다. 참고: 50% 세포 밀도는 부착시 플레이트 표면적의 50%를 차지하는 세포를 말합니다.
</li>
		<li>
조기 통과: 상기 과정을 반복(트립시니화, 시딩)을 반복하여 세포가 5회 통과될 때까지 반복한 다음 정량적 PCR 분석을 사용하여 PCR로 세포주 순도를 평가하여 토끼 게놈 DNA와 마우스 게놈 DNA를 구별한다(단계 1.3.1-1.3.4 참조). 참고 : 8 대후, 세포는 비 콜라겐 코팅 일반 부착 조직 배양 플레이트에 전파 될 수있다.</li>
		<li>통로, trypsinize 및 DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO에서 유리병 당 2 x 106의 농도에서 세포의 aliquots를 동결. 실험에 필요할 때까지 세포를 액체 질소에 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>생존 세포의 VX2 기원의 확인:<ol>
<li>정제 된 게놈 마우스와 토끼 DNA (단계 1.3.2 및 단계 1.3.3)에서 표준 치료법을 만듭니다. LINE-1 레트로트랜스포슨 요소의 두 번째 개방 판독 프레임 내에서 종별 시퀀스를 타겟팅하는 프라이머를 사용합니다. 참고 : CRPV E6에 대한 프라이머 시퀀스는 다음과 같습니다 5'- GATCCTGGACCACCAGTGAnd 5'-CCTGCCGGTCTGATTTAT. LINE-1 레트로트랜스포슨 요소가 사용되었습니다. 토끼 LINE-1에 대한 프라이머 시퀀스는 다음과 같습니다 : 5'-TCAGAACCCCAAAAGATATGC 및 마우스 라인-1에 대한 5'-TTTGATTCTTGAATTGGT 프라이머 시퀀스는 다음과 같습니다 : 5'-AATAGAAAAAAAAAATTCACGTG 및 5'-CCTTCCTTAGAGAGTATTTTTTTTTTTTTTG</li>
		<li>CRPV E6에 대한 표준 곡선을 생성하려면 제조업체의 프로토콜에 따른 상용 키트를 사용하여 VX2 종양 세포 용해물(Step 1.1)을 정제합니다. 상업적인 분석법으로 이 DNA를 정량화합니다. 낮은 EDTA-TE 버퍼에서 225 pg/μL에서 0.925 pg/μL까지 6개의 직렬 희석을 수행합니다. 마우스 게놈 DNA에 대한 표준 곡선을 만들려면 125 pg/μL에서 0.0125 pg/μL까지 5개의 희석으로 낮은 EDTA-TE 버퍼에서 상업용 마우스 게놈 DNA 100 μg을 희석합니다.</li>
		<li>1.3.2단계의 시료에서 각 희석된 용액에서 4 μL을 우물에 놓고 PCR 열전자전거에서 샘플을 실행합니다. 각 실행의 Cq 값을 웰당 DNA 양과 함께 사용하여 써모사이클러 소프트웨어 자동 임계값 설정을 사용하여 표준 곡선을 계산합니다.</li>
		<li>표준 qPCR 절차를 사용하여 온도 사이클러에서 40사이클의 2단계 사이클링(98°C 및 60°C)으로 PCR을 수행합니다. 임계값을 설정하고 델타 Ct 값을 >35로 설정하여 토끼 VX2 세포주에서 마우스 오염을 최소화합니다. 각 반응의 총 부피는 10 μL, 2x Mastermix의 5 μL, 250 nM에서의 반응에서 최종 프라이머 농도를 가진 전방 + 역방향 프라이머 1 μL, 및 DNA 샘플의 4 μL로 구성되었다. 참고: PCR 수행에 대한 자세한 내용은 참조54,55를 참조하십시오. 임계값이 설정되고 델타 Ct 값이 >35로 설정되어 토끼 VX2 세포주에서 마우스 오염을 최소화합니다. qPCR에 의한 신뢰할 수 있는 검출을 위한 VX2 DNA의 권장 수준은 1-10 pg입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. VX2 세포 배양 및 세포 현탁액 생성
<ol><li>VX2 세포를 함유하는 바이알(1.2.7단계에서 냉동)을 37°C에서 수조에서 1분간 동결하고 10 mL의 배양 배지(1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)를 가진 원심분리관으로 세포를 옮니다. 107 x g에서8 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 9 mL의 매체에서 세포 펠릿을 다시 중단시금.</li>
	<li>다시 부유 한 세포를 큰 배양 플라스크로 옮김. 37 °C에서 흔들리지 않고 세포를 배양합니다. 광 현미경 검사법을 사용하여 합류에 대한 매일 세포를 확인하고 3 일마다 배양 배지를 변경하십시오.</li>
	<li>주입을 위한 배양된 VX2 세포 현탁액의 생성<ol>
<li>세포를 추가 하 여 트립시니화 3 mL의 0.25% 플랩신 일단 세포에 도달 한 후 트립신 80% 합류. 플라스크를 인큐베이터(37°C)에 5분 간 놓고 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기를 107 x g에서 8분 간 옮긴 다음 상류를 제거합니다.</li>
		<li>세포 펠릿을 9 mL의 인산완충 식염수, 원심분리기로 3회 세척하고 위와 같이 상층부를 제거합니다. 세포를 계산하고 0.9 % 인산 완충 식염수로 희석하여 4 x 107 세포 / mL의 농도로 얼음에 멸균 원소 원심 분리튜브에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주입을 위한 생체 내 전파 VX2 세포 현탁액 생성<ol>
<li>해동 냉동 VX2 종양 블록(1 cm x 1 cm), 메스 블레이드를 사용하여 배양 플레이트상에서 다진 및 1.1.1단계에서와 같이 70 μm 필터를 통해 변형한다. 소량의 HBSS를 순차적으로 추가하여 모든 셀이 최종 부피 1mL에 대해 변형되도록 합니다. 세포를 카운트하고 0.9% 인산완충식염수로 1 x10 7/mL의 농도로 희석하고 멸균 튜브에 얼음 위에 놓습니다. 참고: 종양 블록은 토끼 사두근 근육에서 VX2 종양의 이전 전파로부터 실험실 협력자로부터 수득되었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 외과 모델 설립
<ol><li>외과 마취 및 수술 전 준비의 확립<ol>
<li>사전 치료 여성 흰색 뉴질랜드 토끼 (2.5-3.5 kg) 1 시간 전에 아세프로마진의 주사를 사용하여 계획된 수술 (1 mg / kg IM) 및 멜 록시캄 (0.2 mg / kg SQ). 2-5% 흡입 된 이소플루란으로 여성 흰색 뉴질랜드 토끼 (무게 2.5-3.5 kg)를 마취시키고 주사 부위 위에있는 모피를 제거하고 포비도 요오드 용액으로 주사 부위를 정화합니다.</li>
		<li>후두 마스크 기도 (LMA)를 사용하여 마취 토끼를 삽관하고 테이프로 제자리에 고정, 2-5 % 사이의 흡입 이소플루란 용량을 적정하여 깊은 마취를 유지. 활력 징후 (호흡 속도, 모세관 리필, 산소 포화도)를 확인하고 통증을 암시하는 징후 (운동, 자극, 소음에서 철수) 또는 빛을 모니터링하여 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 외과 마취를 모니터링하십시오. 마취 (운동, LMA 튜브에 체팅). 참고 : 이것은 외과 마취를 모니터링 경험이있는 사람에 의해 수행되어야합니다.</li>
		<li>22게이지 귀 정맥 카테터를 한계 등쪽 정맥에 놓습니다. 세파졸린을 투여 (20 mg /kg) 정맥 10 수술 피부 절개 전에 분.</li>
		<li>수술대에 토끼를 놓기 전에 골반과 복부에 머리카락을 끼친 다음 수술대에 등도 위치에 토끼를 놓습니다. 3단계 수술용 피부 준비(베타딘 비누, 클로르헨시딘 용액, 베타딘 용액)를 사용하여 수술 분야를 청소합니다. 음부 뼈의 상단을 표시 한 후 개복술 커튼으로 수술 부위를 드레이프하고 하복부의 5cm x 5cm 영역을 노출시소하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>개복술 절개 및 자궁 경적의 식별의 생성<ol>
<li>수술용 모자와 얼굴 마스크를 착용하십시오. 클로르헨시딘 또는 베타딘 수술 용액을 사용하여 손을 문질러 보시고. 멸균 기술을 사용하여 멸균 가운과 멸균 수술 장갑을 착용하십시오.</li>
		<li># 11 블레이드 메스를 사용하여, 토끼 복부의 피부와 피하 조직을 통해 심형 치피에 2.5 cm 긴 절개 1cm 두개골을 합니다. 직장 근막 절개 및 근본적인 복막을 노출하는 측면으로 직장 근육을 해부. 지하가 창자 또는 다른 복부 장기의 명확한 지 확인 후 급격하게 복막을 입력합니다.</li>
		<li>오줌 방광을 확인하고 장갑을 낀 손가락을 우수하게, 후방 및 방광의 정점에 걸쳐 측면으로 쓸어 자궁 뿔을 찾습니다. 참고: 필요한 경우 디지털 압력을 사용하여 전체 방광을 비워야 합니다. 일단 위치, 복 부 절개를 통해 자 경 적을 가지고 복 벽에 휴식.</li>
		<li>3-0 편조 흡수성 봉합사를 사용하여, 자궁 경적을 약 1.5-2.0 cm 의 자궁 경적의 단일 봉합을 수행하여 자궁 경부에 원하. 봉합사를 각 뿔의 측면 측면을 따라 달리는 자궁 동맥에 내측을 놓습니다. 봉합사를 단단히 묶어 말단 자궁 뿔을 가리키다(그림 1).</li>
	</ol></li>
	<li>근심시험 VX2 접종<ol>
<li>27 게이지 바늘을 사용하여, 이전에 준비된 VX2 세포 현탁액의 0.5 mL을 2.3.2 단계 (배양 된 VX2 모델용) 또는 2.4 (생체 내 전파 VX2 모델용)를 봉합 부위 (봉합 부위 간)의 근막에 주입하십시오. 자궁 경부). 1 분 이상 주입하고 세포가 기본 자궁 구멍에 주입되지 않도록하십시오. 흡입된 이소플루란을 사용하여 동물을 마취 (2-5%) 베인 회로가 있는 마취기계.</li>
		<li>세포 누출을 최소화하기 위해 주사 후 30 s에 대한 근심 주사 부위에 압력을 가하십시오. 지혈에 대한 주사 및 봉합 부위를 검사하고 복부에 다시 자궁 경적을 배치합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>외과 절개 닫기<ol>
<li>깊은 복벽 폐쇄: 복막 절개의 정점을 확인하고 조직 집게로 복막, 직장 근육 및 근막을 파악합니다.<ol>
<li>이렇게하려면 절개의 한쪽 에 피상적 인 봉합사를 봉제의 한 쪽에서 절개한 한 쪽의 깊은 부분과 다른 쪽의 피상적 인 부분까지 봉합합니다. 매듭을 묶는다. 부착 된 봉합사를 사용하여, 좌우절개를 따라 단계적으로 작업 복벽의 층을 통해 절개에 수직으로 실행 바늘을합니다. 봉합사를 묶고 잘라냅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>표면 복벽 폐쇄: 피부 절개의 정점을 식별하고 매장 된 실행 피실 3-0 흡수 성 폴리 필라멘트 봉합사를 사용하여 복부 피부를 봉합합니다. 피부 가장자리를 반대로 닫힌 절개에 외과 접착제를 적용합니다.<ol>
<li>이렇게하려면 절개의 한 정점에 봉합사를 고정하고 절개 한 쪽의 한 쪽에서 피상적으로 깊이 봉합하고 다른 쪽은 피상적으로 봉합하십시오. 매듭을 묶는다. 부착 된 봉합사를 사용하여, 절개 작업 좌우절개에 평행 한 진피 층에서 실행 바늘을 합니다. 봉합사를 묶고 잘라냅니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>수술 후 치료<ol>
<li>마취에서 각성: 절개가 닫히면 이소플루란을 끄고 각성의 징후를 모니터링하는 동안 토끼가 마스크로 산소를 호흡하게하십시오 (예 : 후두 마스크 기도에서 자발적인 움직임, 눈 개폐 및 체질 운동). 이 징후가 나타나면 토끼를 추방하고 토끼가 경고하고 독립적으로 앉을 수있을 때까지 마스크와 따뜻한 담요로 산소를 제공합니다.</li>
		<li>수술 후 모니터링: 토끼를 하루에 두 번 4일 동안 모니터링하고 매일 10일 동안 추가로 수술 후 모니터링합니다. 모니터링, 그들의 일반적인 상태를 평가, 그들의 음식과 물 섭취, 소변과 배설물 출력, 통증 평가, 무게, 활력 징후 (심장 박동, 호흡 속도) 붓기를 찾고 그들의 수술 사이트, 홍 반, 출력 또는 dehiscence.</li>
		<li>수술 후 통증 조절: 매일 멜록시캄(0.2 mg/kg SQ)을 수술 후 48시간 동안 관리한 다음 통증 평가에 따라 필요에 따라 관리하십시오. buprenorphine즉시 수술 후 관리하고 모든 12 시간 (0.01-0.05 mg/kg SQ) 에 대한 24 시간 다음 통증 평가에 따라 필요에 따라</li>
		<li>항생제 (enrofloxacin 5mg/kg IM) 수 의사에 의해 권장 되는 상처 감염을 방지 하기 위해 수술 후 7 일 동안 매일 관리 될 수 있습니다. 피하 유체를 관리 (15 SQ의 mL) 탈수에 필요한 하루에 두 번 및 부드러운 음식 또는 다른 식이 보조 제 체중 감량을 위해 필요에 따라 매일 제공 됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 종양 성장 모니터링
<ol><li>임상 모니터링: 수술 후 14일부터 종양 성장의 임상 징후가 나타나기 위해 2일마다 토끼를 모니터링합니다. 종양 성장의 임상 징후는 감소 경구 섭취를 포함 할 수있다, 혼수, 복부 부드러움, 만져 볼 수있는 복부 질량과 cecotrophy의 손실.</li>
	<li>이미징 및 침습적 모니터링<ol>
<li>CT 화상 진찰: 수술 후 날 21-28에, 3.1.1-3.1.2에서 기술한 것과 같이, 사전 약, 마취 및 삽관 토끼. 토끼를 전임상 CT 스캐너에서 등지 위치에 놓고 정맥 내 요오헥솔 조영제의 10 mL를 투여한 후 골반 및 복부의 이미지를 얻었다.</li>
		<li>외과 모니터링: 일반 마취 하에 있는 동안 이미징 후 수술실로 토끼를 옮김을 옮김을 옮김을 더합니다. 3.1.4단계에서 설명한 바와 같이 토끼의 위치, 준비 및 드레이프를 이전 절개를 통해 길이 약 1.5 cm의 반복 개복절을 수행한다. 자궁 뿔과 자궁 경적을 확인하고 종양을 주의 깊게 검사하십시오. 절개를 닫고 3.5.2-3.5.4 단계에서 설명한 대로 수술 후 치료를 제공합니다.</li>
		<li>토끼 모형 사용: 토끼가 외과 감시의 때에 종양이 있는 것을 발견되는 경우에, 계획된 실험을 위한 토끼 자궁내막암 모형을 이용하십시오. 생체 내 전파 세포에서 생성된 토끼를 4주 접종 후 추가 실험을 위해 사용하고 접종 후 약 5-6주 동안 배양된 VX2 세포에서 생성된 토끼 모델을 사용하여 종양 성장 둔화를 고려합니다. 종양이 수의사 승인 방법을 사용하여 직경 1-1.5 cm (캘리퍼스로 외부로 측정)에 도달 한 후 토끼를 안락사시하십시오. 심박수와 호흡률을 포함한 활력 징후를 확인하여 안락사를 확인합니다. 베타딘 용액으로 부위를 청소 한 후 멸균 기구를 사용하여 종양을 절제하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

본 명세서에서, 우리는 VX2 자궁내막암 모델의 확립을 위한 표준화된 수술 방법을 보고하고 이 모델을 생성하기 위해 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용에 대해 보고하였다. 75%의 종양 복용율은 문헌35,37,53,56에이전에 보고된 100% 비율보다 낮다; 그러나 병리학적으로 확인 된 림프절 전이의 thw 90 % 비율은이 모델35,53의이전 연구와 일치합니다.
자궁 봉제의 포함은 모형 성공률을 57%에서 81%로 현저하게 증가시켰고 우리는 이 단계를 외과 프로토콜의 필수적인 부분으로 간주합니다. 자궁 봉합은 양측 자궁 동맥 결찰에서 자궁 뿔 탈동...

자궁내막암, 즉 자궁내막암은 전 세계적으로 두 번째로 흔한 부인과 악성종양이며 선진국에서 가장 흔한악성종양입니다 1. 자궁내막암발생률은 2005년부터 2013년까지 매년 2.3% 증가하여 사망률1,2,3의사망률이 2.2% 증가하는 등 꾸준히 증가하고 있다. 림프절 전이의 진단은 양성 림프절의 존재가 생존4,5,6,7의 강한 부정적인 예측변수이기 때문에 가장 중요하며, 보조 요법8,9,10,11,12,13. 림프절 전이는 현재 골반과 복부에 있는 주요 혈관을 덮는 림프 조직을 외과적으로 제거해서 진단됩니다. 림프절 절제술로 알려진이 절차는 두 개의 큰 시험 에서 생존 데이터 충돌로 인해 논란이14,15,16,17, 18 및 알려진 수술 중15,19,20 및 수술 후 이환율21,22,23의위험. 현재 비침습적 영상형형은림프절해부(24)를대체하는 데 필요한 민감도 및 특이성을 갖지 않기 때문에, 새로운 진단 영상 기술을 개발하기 위한 추진이 있었다. 전 임상 환경에서 이러한 새로운 기술을 테스트하려면 복막 림프절 전이를 가진 자궁 내막암의 신뢰할 수있는 모델이 필요합니다.
토끼 VX2 종양 모델은 폐26,두경부27,간29,신장30,등 다중 인간 고형 기관종양(25)을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 온 잘 확립된 모델이다. 뼈31,32,뇌33,췌장34, 자궁35,36,37. VX2 모델은 1940년 키드와 루스38이 1933년39년Shope가 발견한 코튼테일 토끼 유두종 바이러스를 성공적으로 이식하여 개발되었습니다. 그 이후로, VX2 모델은 화이트 뉴질랜드 토끼40의사두근 근육에 직렬 통로를 필요로, 생체 내에서 유지되고있다. 그러나 최근에는, 여러 그룹이 시험관 내 VX2 세포를 성공적으로 성장시켰으며,41,42 및 배양된세포주(31)의유지종양성을입증하였다. 42,43. VX2 종양은 조직학적으로 anaplastic 편평 상피 세포 암종(44)으로 정의되고 선암(26)과유사한 선 특징을 포함합니다. 종양은 이식의 용이성, 급속한 성장 및 하이퍼 혈관(44,45) 및 안정적으로 전이되며, 가장 일반적으로 국부 및 먼 림프절45를특징으로한다. 자궁 혈관 및 림프 해부학46뿐만 아니라 정형 외 성장 부위의 유사성은 토끼 VX2 암종의 전이성 패턴이 인간 자궁 내막암을 모방하여 VX2 모델을 인간 연구에 대한 신뢰할 수있는 모델로 만듭니다. 전이성 질환. 더욱이, 비정상적인 미세혈관증식(47)과 같은 조직학적 특징은 면역학적48 및 유전적 유사성49,인간과 토끼 사이의50이 종양을 시사한다고 제안한다. 미세 환경은 인간의 자궁 내막암을 반영 할 수있다.
여러 그룹은 VX2의 사용에 대한 보고가 성공률이 높은 후복막 전이를 가진 자궁내막암 의 모델을 생성하여36,51,52; 그러나 모델 생성 방법과 관련하여 현재 문헌 내에 상당한 차이가 있습니다. 세포 현탁액 투여량은 4 x 10 5 세포/자궁경적(51)과 5 x 10 9 세포/자궁호른(37) 만큼높으며,53회는 필요한 VX2 세포 투여량에 대한 표준 합의없이 보고되었다. 또한, 자궁 근막내로 종양의 미세 외과이식(36)및 VX2 세포 현탁액37,44,52의 주사를 포함한 다양한 접종 방법이 보고되었다. , 도 53 및 경우에 따라, 접종 전 자궁경적 봉기(52)를 첨가한다. 마지막으로 배양된 VX2 셀을 사용하여 이 모델을 만드는 그룹은 보고되지 않았습니다. 따라서, 본 연구의 목적은 VX2 모델 생성의 성공적인 표준화 방법을 입증하고 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용을 보고하여 토끼에서 복막전이를 이용한 자궁내막암 모델을 생성하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>11날 메스, 멸균, 일회용</td><td>Aspen Surgigial(VWR)</td><td>80094-086</td><td></td></tr><tr><td>22-gague 귀 정맥 카테터</td><td>CDMV</td><td>14332</td><td></td></tr><tr><td>3-0 흡수성 폴리 필라멘트 봉합사(Polysorb)</td><td>Covidien</td><td>356718</td><td></td></tr><tr><td>3-0 꼰 흡수성 봉합사(Polysorb)</td><td>Covidien</td><td>356718</td><td></td></tr><tr><td>70uM 세포 여과기, 개별 포장, 나일론</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine (Atravet)</td><td>CDMV</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>Betadine 비누 (Poviodone 요오드 7.5%)</td><td>CDMV</td><td>4363</td><td></td></tr><tr><td>Betadine 용액 (Poviodone 요오드 10%)</td><td>UHN Stores</td><td>457955</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>McGill University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>UHN 입원 환자 약국</td><td>고양이 # 필요 없음</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 용액</td><td>CDMV</td><td>119872</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dish</td><td>Corning</td><td>354450</td><td>브랜드 미중요</td></tr><tr><td>Corning BioCoatCellware, 콜라겐 Type I, 24웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>354408</td><td>브랜드 Not</td></tr><tr><td>Important Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td><td>Corning</td><td>354400</td><td>브랜드 미인증 중요</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/HAM F12 1:1</td><td>Life Technologies</td><td>11320</td><td>브랜드 중요하지 않음</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Caledon Lab Chem</td><td>1/10/4100</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td><td>CDMV</td><td>11242</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube</td><td>Corning Centri-Star</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청, 자격, 캐나다 원산지, 500ml</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td>브랜드/출처는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>UHN 입원 환자 약국</td><td>No Cat # 필요</td><td></td></tr><tr><td>이소헥솔 조영제</td><td>GE 헬스케어</td><td>407141210</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td><td>CDMV</td><td>104674</td><td></td></tr><tr><td>Normal Saline</td><td>House Brand (UofT Medstore)</td><td>1011</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>멀티셀 또는 시그마</td><td>331-010-CL 또는 D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(100mL; 10000U 페니실린, 10000ug 스트렙토마이신)</td><td>Corning-Cellgro</td><td>CA45000-652</td><td></td></tr><tr><td>멸균 행크 균형 염 용액(-Ca++, -Mg++, -페놀 레드)</td><td>T.C.M.F(Dr Bristow)</td><td>28-Jan-11</td><td></td></tr><tr><td>수술용 접착제(조직 접착제)</td><td>3M Vetbond</td><td>14695B</td><td></td></tr><tr><td>트립신(0.25%), 단백질체학 등급</td><td>시그마</td><td>T-6567-5X20UG</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA, 0.05%, 100ml</td><td>Wisent Inc</td><td>325-542-EL</td><td>브랜드는 중요하지 않습니다</td></tr></tbody></table>.

생체 내 전파 및 배양 vx2 세포에서 만든 후각 성 림프절증을 가진 정형 외 자궁 내막 암 모델

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

자궁내막암은 북미에서 가장 흔한 부인과 악성 종양이며 발병률은 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 치료는 림프절 절제술에 의해 결정된 림프절 침범에 따라 보조 요법의 유무에 관계없이 수술로 구성됩니다. 림프절 절제술은 많은 환자에서 치료 적 이점을 가지고 있는 것으로 나타나지 않은 병적 절차이므로 림프절 전이를 진단하는 새로운 방법이 필요합니다. 새로운 화상 진찰 에이전트를 시험하기 위하여는, retroperitoneal 림프절 전이를 가진 자궁내막암의 믿을 수 있는 모형이 필요합니다. VX2 자궁내막암 모델은 문헌에 자주 기술되어 왔다; 그러나 모델 수립 방법에 대해서는 상당한 차이가 있습니다. 더욱이, 생체 내에서 전파된 세포만이 이전에 사용되었기 때문에 배양된 VX2 세포의 사용에 대한 연구는 보고되지 않았다. 본 명세서에서, VX2 자궁내막암 모델의 확립을 위한 표준화된 수술 방법 및 수술 후 모니터링 방법을 제시하고 이 모델을 생성하기 위해 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용에 대해 보고한다.

28 마리의 토끼가 자궁내막암 모델의 생성에 사용되었다. 토끼는 실험 당시 평균 체중이 2.83 kg (2.71-3.58 kg)이었다. 자궁 종양은 75%의 전반적인 모형 성공률을 위해 21개의 토끼에서 성공적으로 성장했습니다. 프로토콜에 자궁 봉합을 포함하기 전에, 성공률은 자궁 봉합 후 81 %에 비해 57 %였다. 자궁 봉합은 초기 낮은 모델 성공률에 응하여7th 토끼 후 프로토콜에 첨가되었다. 배양된 VX2 세포(8마리토끼, 63%의 성공률)와 16개의 토끼 모델에서 5개의 모델이 생성되었으며, 16개의 토끼 모델은 생체 내 전파 세포로부터 생성되었다(22, 73% 성공률). 생체 내 VX2 세포로부터 생성된 모델에서, 자궁경적 1회당 5 x 106의 세포 투여량을 모든 동물에서 사용하였고, 접종으로부터 실험까지의 평균 일수는 29일(범위 24-31)이었다. 배양된 VX2 세포로부터 생성된 모델에서, 에스컬레이션 용량 프로토...

이 프로토콜은 배양에서 VX2 세포를 성장시키고 토끼에서 후복막 림프절 전이를 가진 자궁내막암의 정형외 VX2 모델을 생성하는 표준화된 방법을 제시한다. 정형외 자궁내막암 모델은 림프절 전이의 진단을 위한 새로운 이미징 양식의 전임상 연구에 중요하다.

생체 내 전파 및 배양 VX2 세포에서 만든 후각 성 림프절증을 가진 정형 외 자궁 내막 암 모델

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

레트로 페리톤 림프절 전이와 이 VX2 자궁내막암 모델은 이미지 유도 수술을 위한 기술을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 자궁 내막암의 패턴을 모방 일관된 전이성 확산을 생성한다는 것입니다. 전반적으로 이것은 간단한 기술입니다.그러나 모델을 만들기 전에 봉합을 연습하면 프로세스를 더 쉽게 만드는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 시각적 데모는 모델 설립에 관련된 수술 단계를 입증하는 데 도움이되기 때문에 중요합니다. 할리 찬과 나는 릴리 딩, 우리의 실험실에서 기술자가 될 것입니다 와 절차를 시연.주입을 위해 시험관외 전파 VX2 세포에서 준비하려면 VX2 세포의 냉동 바이알을 섭씨 37도 또는 수조로 1분 동안 따뜻하게 데우는 것으로 시작합니다. 세포가 해동되면 배양 배지의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브에서 세포 현탁액을 당깁니다. 원심분리에 의한 세포 침전.중간 크기의 9 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 큰 배양소로 옮기면 37°C에서 잠양을 위해 몸을 흔들어 서 매일 세포를 확인하여 가벼운 현미경 검사법에 의한 합류를 확인합니다. 세포가 80%의 합류에 도달하면 플라스크에 0.2%의 트립신 3밀리리터를 추가하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 5분 동안 되돌려 보세요.세포가 분리되면, 원심분리에 의해 세포를 수집하기 위해 원적 튜브로 세포 현탁액을 전달한다. 세척당 9밀리리터의 신선한 PBS로 셀 펠릿을 세 번 씻으십시오. 마지막 세척 후, 얼음에 새로운 원문 튜브에서 PBS 농도의 밀리리터 당 7 개의 VX2 세포에 4 회 10으로 희석하기 전에 계산에 대한 신선한 PBS에서 세포를 다시 중단합니다.생체 전파 VX2 세포주입을 위해 준비하기 위해 1센티미터 VX2 종양 블록으로 냉동된 해동을 하고 메스를 사용하여 배양판에서 조직 샘플을 다진다. 조직 조각을 70 마이크로미터 필터로 옮기고 행크의 균형 잡힌 염용액(HBSS)의 최대 1밀리리터의 작은 알리쿼트를 추가하여 모든 세포가 여과기를 통과하도록 합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 얼음에 멸균 튜브에 있는 HBSS 농도의 밀리리터 당 7개의 VX2 세포로 10번 으로 희석하기 전에 세포를 계산한다.자극에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 수술대에 등색 위치에 마취 여성 흰색 뉴질랜드 토끼를 배치합니다. 골반과 복부에 머리를 잘라, 노출 된 피부를 청소하는 세 단계 수술 피부 준비를 사용합니다. 수술용 모자와 얼굴 마스크를 착용하고 소독제로 손을 문지르며 멸균 가운과 멸균 수술 용 장갑을 착용하십시오.음모 뼈의 상단을 랜드 마크와 하복부 커튼으로 수술 필드를 드레이프, 노출 하 복부의 5 5 센티미터 영역을 떠나. 다음으로, 11번 메스 블레이드를 사용하여 피부와 피하 조직을 통해 심근증 에 대한 2.5센티미터 절개 1센티미터 두개골을 만듭니다. 정류 근막을 절개하고 정류 근육을 측면으로 해부하여 기본 복막이 노출됩니다.밑면이 창자 또는 다른 복부 장기가 명확하지 않다는 것을 확인하십시오. 음낭을 확인하기 위해 회리동맥에 급격히 들어가 장갑을 낀 손가락을 우월하게, 후방, 그리고 측면으로 방광의 정점을 쓸어 자궁 뿔을 찾습니다. 복부 절개를 통해 자궁 뿔을 추출하여 복벽에 놓습니다.3-0 편조 흡수 봉합사를 사용하여 각 자궁 뿔의 단일 봉합사 결합을 수행하고, 약 1.5 ~ 2 센티미터의 자궁 부신을 수행하고 자궁 동맥에 내다식하십시오. 그런 다음 봉합사를 아늑하게 묶어 서 경적을 포함합니다. 이전에 준비된 VX2 세포 현탁액으로 심근을 접종하기 위해 1 밀리리터 의 셀이 장착된 1밀리리터 주사기를 적재합니다.봉합사와 자궁 경부 사이의 봉합사 부위에 각 자궁 경전 근면에 1분 이상 세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 천천히 주입한다. 그런 다음 세포 누출을 최소화하기 위해 심근 주사 부위에 30초 동안 압력을 가합니다. 자궁 뿔을 복부에 다시 넣기 전에 주사제 및 봉합사 부위를 검사합니다.깊은 복벽 폐쇄의 경우 복막 절개 의 정점을 식별하고 외과 용 클램프를 사용하여 복막 직사각형 근육과 근막을 잡습니다. 3-0 흡수성 폴리필라멘트 봉합사를 배치하여 봉합사를 고정하고, 절개 한 정점에 피상적이며, 다른 쪽은 피상적 깊숙한 위치에 놓습니다. 부착된 봉합사를 사용하여, 복벽의 층을 통해 절개에 수직으로 달리는 바늘을 만들고, 봉합사를 묶고 느슨한 끝을 자르기 전에 좌우로 절개를 따라 단계적으로 작동합니다.피상적 복부 벽 폐쇄의 경우, 묻혀 있는 3-0 흡수성 폴리필라멘트 봉합사를 사용하여 절개 한쪽에 깊은 피상화와 피상적 인 봉합사를 다른 쪽 깊숙이 대접하십시오. 봉합사를 매듭낸 후, 고정된 봉합사를 사용하여 진피 층에서 실행 바늘을 절개에 평행하게 만들고, 좌우절을 따라 단계적으로 작업한다. 봉합사를 묶고 느슨한 끝을 제거합니다.닫힌 절개에 수술 접착제를 적용하여 피부 가장자리를 제거합니다. 그런 다음 동물이 경계하고 독립적으로 앉을 수 있을 때까지 산소와 모니터링이 있는 따뜻한 담요에 동물을 놓습니다. 이 모델을 확립할 때, 자궁 경전당 7개의 세포에 2회 10의 투여량은 4마리토끼에서 성공했고, 평균 45일 동안 접종부터 실험까지, 따라서 배양된 VX2 모델에 대한 최적의 주사 용량으로 결정되었다.생체 내 전파 VX2 모델의 경우, 접종부터 29일의 실험까지평균 시간으로 16마리토끼에서 성공적으로 만들어졌으며, 5회 10~6개의 세포가 최적의 주사 용량으로 결정되었다. 모든 모델은 레트로 페리톤 림프절의 성공적인 전이성 변환을 초래했습니다. 또한, 배양된 VX2 세포로부터의 종양 및 전이성 림프절은 조직분석에 의한 생체 전파 VX2 세포로부터종양과 유사한 것으로 나타났으며, 뎅시향토생린 염색 세포는 침입된 근육에서 관찰되고 많은 병리학적 신비학적 수치를 가진 구조와 같은 선 형성을 가졌다.혈관 천자에서 출혈을 피하기 위해 자궁 동맥에 봉합봉을 놓고 자궁 내막 구멍이 아닌 근막 구멍에 세포를 침투하는 데 주의를 기울이십시오. 수술 후 감염을 방지하고 수술 중 바륨 재료로 자신을 보호하기 위해 모델 생성 중에 적절한 멸균 기술을 사용하십시오.

an-orthotopic-endometrial-cancer-model-with-retroperitoneal

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이게 맹장에 피하 종양의 조각의 cecal 벽이나 이식으로 암 세포 현탁액의 주입 : 두 기술이 모델을 확립하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델은 대장암의 자연 진행을 공부하고 대장암에 대한 새로운 치료 요원을 테스트하는 데 유용합니다.

대장암의 Orthotopic 마우스 모델

에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델 생체내에</em종양 면역 응답> 종양 이미징 및 모니터링

이 비디오는 토끼의 봉합된 자궁 뿔에 고도로 전이된 VX2 세포 현탁액을 주입하여 자궁내막암의 토끼 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이는 후복막 림프절 전이를 동반한 원발성 자궁내막암의 발생으로 이어집니다.

전이성 자궁내막암 모델 모델링: 토끼 모델에서 림프절 전이를 동반한 자궁내막암을 생성하는 기법

차 침략 동 소성 방광 암 이종 이식을 접종하는 설치 방법은 개복 수술과 방광의 동원을 필요로한다. 이 절차는, 마우스에 상당한 이환율을 입히고 기술적으로 어렵고 시간 소모적이다. 따라서 우리는 경피적 접근 방식은 초음파 안내를 이용하는, 높은 정밀도를 개발했다.

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

우리는 난소암의 성장과 재발을 감지, 정량화 및 모니터링할 수 있는 비침습적 동물 이미징 플랫폼을 설명합니다. 이 복막내 이종이식 모델은 난소암 환자의 임상 프로필을 모방합니다.

비 침습적 영상에 대한 생쥐 모델 검색 및 모니터 난소 암 재발

난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.

원래 종양 개발의 쥐 실험 모델 및 복막 전이<em&gt;를 통해</em난소 암 세포에&gt; 동소 이식 접종

Murine orthotopic 유 방 암 모델 및 과격 한 유 방 절제술 모델 인간의 유방암 암 진행을 모방 하기 위해 종양 부담 척도를 생물 발광 기술을 소개 합니다.

Murine Orthotopic 전이성 유방암 암 모델을 생성 하 고 수행 Murine 과격 한 유 방 절제술

이 문서의 목표는 개발 및 간 암에 대 한 VX2 암 토끼 모델의 사용에 대 한 입문서를 제공 하는입니다.

개발 및 간 암에 대 한 토끼 VX2 모델의 Angiographic 사용

이 프로토콜은 환자 유래 정형외 이종이식 모델의 생성을 중급 요뇨세포 암종 세포 또는 직장 내 대장암 세포를 비만 당뇨병/중증 복합으로 주입하여 생성하는 것을 설명합니다. 면역 결핍 (NOD /SCID) 림프절 기질 세포의 영향하에 1 차적인 종양 성장 및 자발적인 전이를 위한 마우스, 이는 인간 전이성 질병의 진행을 모방합니다.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

이 프로토콜은 면역 결핍 마우스의 맹장벽에 환자 유래 암세포의 orthotopic 이식을 설명합니다. 이 모델은 진행성 대장암 전이성 질환을 요약하고 폐 및 간 전이에 대한 임상적으로 관련된 시나리오에서 새로운 치료 약물을 평가할 수 있도록 합니다.

생쥐에서 환자 유래 암세포의 정형외피 이식은 진행성 대장암을 재현합니다.

학습하세요 VX2 세포 배양 및 정형 이식을 통한 토끼 자궁내막암 모델 제작 방법을. 후복막 림프절 전이를 재현하여 영상 유도 수술 기술 연구에 활용할 수 있는 신뢰할 수 있는 전임상 모델입니다.

생체 내 전파 및 배양 VX2 세포에서 만든 후각 성 림프절증을 가진 정형 외 자궁 내막 암 모델

더 많은 동영상 탐색