Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법
2019년 3월 31일
여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.
이 프로토콜은 전기 전구 중 DNA 검출을 위해 에디듐 브로마이드를 사용하는 쉽고 저렴한 대안입니다. 에티듐 브로마이드를 제거함으로써 UV 라이트 또는 청색광을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 청색광은 DNA에 손상을 입히고 다운스트림 실험의 성공 가능성을 향상시킵니다.
이 것을 시도하는 것은 정말 쉽습니다. 젤의 에티듐 브로마이드를 티아졸 오렌지로 교체하기만 하면 됩니다. 시작하려면 약 0.7 그램의 아가로즈를 tris-acetate-EDTA 또는 트라이스 보레이트 버퍼70 밀리리터에 혼합하여 1%mini-gels를 준비하십시오.
다음으로, DMSO에 티아졸 오렌지를 녹여 10, 000X 스톡 솔루션을 만듭니다. 특히 가벼운 민감하지는 않지만 사용하지 않을 때는 티아졸 오렌지를 어둠 속에서 보관하십시오. 장기 보관을 위해 티아졸 오렌지-DMSO 혼합물의 알리쿼트(aliquots)를 만들어 동결하십시오.
그런 다음, 티아졸 오렌지를 밀리리터당 1.3 마이크로그램의 최종 농도에 넣고 아가로즈 버퍼와 티아졸 오렌지의 혼합물을 전자레인지에 넣고 약 60초 동안 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈 혼합물을 적절한 빗을 함유한 젤 주조 장치에 붓고, 아가로즈 용액이 젤로 고화되도록 한다. 젤을 적재하기 위해, 먼저 겔을 전기전도 장치에 배치하고, 아직 존재하지 않는 경우.
그런 다음 TAE 또는 TBE 실행 버퍼를 추가하여 젤 표면을 덮습니다. 다음으로, 로딩 염료를 사용하여 DNA 샘플의 10 마이크로리터를 적재합니다. 참조를 위해 DNA 크기 조정 사다리를 포함한다.
커버와 전극을 부착하고, 로딩 염료가 미니 젤을 위해 약 4~7cm까지 주행할 때까지 100볼트에서 미니 젤을 실행합니다. 티아졸 오렌지가 젤 주조 전에 적용되지 않은 경우, 약 20분 동안 또는 밴드가 완전히 검출될 때까지 티아졸 오렌지를 함유한 완충제에 침지하여 젤을 얼룩지게 한다. UV 트랜틸루미나이터를 사용하여 젤을 시각화하려면 전기 전광 장치에서 젤을 제거하고 UV 트랜틸루미노이터에 배치하십시오.
청색광 트랜실루미나이터 또는 손전등을 사용하여 젤을 시각화하려면, 젤을 블루라이트 트랜실루미노이터에 놓거나 위 또는 아래에서 젤에 파란색 LED 손전등을 직접 배치한다. 호박색 방출 필터를 사용하여 청색광을 걸레로 하여 DNA 티아졸 오렌지 복합체에서 형광을 시각화하고 염료를 보호합니다. 추가 소화 또는 결찰을 위해, 젤에서 원하는 DNA 밴드를 잘라 쉽게 사용할 수있는 키트 또는 프로토콜을 사용하여 DNA를 추출진행합니다.
젤 이미징 장치에서 적절한 여기 및 방출 설정을 선택합니다. 적절한 필터가 있는 이미징 시스템이 없는 경우 카메라와 젤 블루라이트 여기 소스 사이에 호박색 필터를 놓습니다. 검출 한계는 에티듐 브로마이드, 티아졸 오렌지 및 일반적인 청색 광 검출 가능한 상업용 DNA 염료 와 유사하며, 세 개의 염료에 대한 검출 제한은 미니 젤의 차선당 1~2나노그램입니다.
제한 다이제스트의 티아졸 오렌지 스테인드 아가로즈 젤은 UV 또는 블루 라이트 트랜실루미나이터 또는 청색 조명 손전등으로 흥분할 때 감지할 수 있습니다. 티아졸 오렌지는 에티듐 브로마이드보다 덜 위험해 보이지만 장갑과 고글과 같은 표준 개인 보호 장비는 여전히 착용해야 합니다.
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개요
본 프로토콜은 겔 전기영동에서 DNA 검출을 위해 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 대체할 수 있는 쉽고 저렴한 방법을 제시합니다. 티아졸 오렌지(thiazole orange)를 사용함으로써 연구자는 형광 검출을 위해 UV 광선 또는 청색광을 모두 사용할 수 있으며, 이를 통해 실험 중 DNA의 안전성을 높일 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 생화학
- 분자생물학
- 전기영동 기술
배경
- Ethidium bromide는 일반적인 DNA 염색제이지만 DNA의 무결성에 위험을 초래할 수 있습니다.
- Thiazole orange는 DNA 시각화를 위한 더 안전한 대안을 제공합니다.
- 형광 검출은 손상을 주지 않는 청색광으로 수행할 수 있습니다.
- 이 방법은 비용 효율적이며 구현하기 쉽습니다.
연구 목적
- 에티듐 브로마이드를 사용하지 않는 DNA 검출 프로토콜을 제공합니다.
- 겔 전기영동에서 thiazole orange의 효과를 입증합니다.
- DNA 시각화를 위해 청색광을 사용하는 것의 이점을 강조합니다.
사용된 방법
- 아가로스와 적절한 완충액을 이용한 1% 미니 겔 준비.
- 겔 내 ethidium bromide를 thiazole orange로 대체.
- UV 또는 청색광을 이용한 형광 검출.
- 전기영동 후 DNA 무결성 평가.
주요 결과
- Thiazole orange는 겔 전기영동에서 DNA를 효과적으로 염색합니다.
- 청색광을 이용하여 안전하게 검출할 수 있습니다.
- 프로토콜이 간단하며 재현성이 높습니다.
- DNA 손상이 감소하여 후속 실험의 성공률이 향상됩니다.
결론
- Thiazole orange는 ethidium bromide의 유효한 대안입니다.
- 청색광을 사용하면 검출 과정 중의 DNA 손상을 최소화할 수 있습니다.
- 이 방법은 후속 분자 생물학 실험의 신뢰성을 높여줍니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
DNA 겔 전기영동은 타겟 검증 및 분석법 개발의 기초적인 워크플로우로 남아 있으며, 여기서 시료의 무결성은 후속 분석의 신뢰성에 직접적인 영향을 미칩니다. 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 티아졸 오렌지(thiazole orange)로 대체하면 검출 감도는 유지하면서 유전독성 위험을 줄일 수 있어, 더욱 안전한 화합물 스크리닝 및 리드 물질 발굴 파이프라인을 지원합니다. 이를 통해 바이오 제약 R&D 팀은 처리량이나 비용 효율성을 저해하지 않고 클로닝, 시퀀싱 또는 기능 분석을 위한 DNA 품질을 보존할 수 있습니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 표적 확인을 방해할 수 있는 염색 유도 아티팩트를 생성하지 않고 DNA 단편 분석을 통한 가설 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 기존의 UV 또는 청색광 이미징 인프라와 호환되므로, 현재 에티듐 브로마이드를 사용하는 실험실에서 프로토콜을 재설계할 필요가 없습니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 레인당 1-2 ng의 검출 한계로 정량적인 DNA 크기 분석을 제공하여, 클로닝 효율 또는 PCR 생성물 검증 시 정밀한 단편 분석을 지원합니다.
- 운용적 가치: 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)와 관련된 유해 폐기물 처리 및 특수 폐기 요구 사항을 제거하여 실험실 안전 규정 준수 절차를 간소화합니다.
중계 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 라이게이션, 형질전환 또는 형질도입과 같은 후속 응용 단계에서 DNA 무결성을 보존하여, 전임상 모델을 위한 컨스트럭트 생성 성공률을 높입니다.
- 운용적 가치: 청색광 시각화를 가능하게 하여, UV로 인한 시료 손상을 줄이고 반복 실험 간의 재현성을 높입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 DNA 분석이 타겟 검증, 리드 물질 발굴 및 전임상 구조물 개발에 정보를 제공하는 발견 생물학 워크플로우에 적합하며, 특히 유전자 변형이나 스크리닝 결과를 평가할 때 유용합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 정확한 DNA 단편 분리 및 크기 측정을 지원하여, 표적 확인 과정 중 유전자 편집, 플라스미드 무결성 또는 PCR 증폭 산물을 신뢰성 있게 평가할 수 있게 합니다.
- 스크리닝(Screening): 핵산 기반 분석에서 라이브러리 다양성 평가나 히트(hit) 확인에 필수적인 재현 가능하고 정량적인 밴드 시각화를 제공합니다.
- 분석(Analytics): 샘플 간에 비교 가능한 형광 강도 데이터를 생성하여, 서로 다른 실험 조건 하에서 DNA 수율이나 순도를 일관되게 비교할 수 있도록 합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 포유류 세포 형질전환이나 바이러스 벡터 생산에 사용할 DNA의 기능성을 유지하며, 이는 후보 물질을 전임상 시험 단계로 발전시키는 데 매우 중요합니다.
- 기업 내 재사용(Enterprise Reuse): 전기영동 하드웨어 또는 소프트웨어의 재검증 없이도 여러 팀과 사이트에서 표준화하여 사용할 수 있는 즉각적인 시약 대체재 역할을 합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 염료로 인한 DNA 손상을 최소화하여 메커니즘적 모호함을 줄임으로써, 표적 평가에 사용되는 분자 생물학 데이터의 신뢰도를 향상시킵니다.
- 운영적 가치: 저렴하고 위험하지 않은 thiazole orange를 사용하며 보관 방식이 간단하여(분주 후 DMSO 스톡으로 냉동 보관), 시약 비용과 안전 관리 부담을 줄입니다.
- 전략적 가치: 후속 시퀀싱, 클로닝 또는 기능 분석을 위한 시료의 무결성을 보존하여 go/no-go 결정의 신뢰성을 높입니다.
- 포트폴리오 영향: DNA 기반 데이터 품질이 리드 최적화 및 전임상 후보 물질 선택 기준을 충족하도록 보장함으로써, 리스크가 조정된 개발 진행을 지원합니다.
실행 시 고려사항
- 아가로스 겔 제조 및 전기영동에 관한 분자생물학적 전문 지식.
- 검출을 위한 UV 또는 청색광 투과조명기와 황색 방출 필터가 구비된 표준 전기영동 장치.
- 균일한 염색을 위해 냉동된 thiazole orange-DMSO 분주액을 일관되게 해동 및 혼합하는 과정.
- 새로운 시료 유형에 적용할 때 모델 시스템(예: plasmid, genomic DNA) 전반에 걸친 염색 효율 검증.
- 제한 사항: 전기영동 후 염색법을 사용할 경우 염색 시간(20 min)의 최적화가 필요하며, 이는 pre-cast 겔 방법에 비해 단계가 추가됨.
