Name: Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: 학습하세요 티아졸 오렌지를 사용한 DNA 전기영동법으로 에티듐 브로마이드를 대체하는 안전하고 경제적인 방법을 배우세요. 청색광 검출로 DNA 손상을 최소화하여 후속 실험의 성공률을 높입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 크리스토퍼 뉴포트 대학에서 TDG에 시작 기금에 의해 지원 되었다.

1. 젤을 준비
: 일반 젤 전기 이동 법 프로토콜에 대 한 참고 또한 P.Y.이, 외 알. 14.
<ol><li>Agarose를 혼합 (~ 1 %w / v, 비율 특정 크기 분판 변화 될 수 있다) 버퍼 (미니 젤 (8 x 7 cm) 약 70 mL). 버퍼는 일반적으로 태 (40 mM Tris, 20mm 아세테이트, 트리 스-아세테이트-EDTA, 1 m m EDTA, pH 약 8.6) 또는 TBE (90mm 트리 스, 90mm borate, 트리 스-borate-EDTA, 2 m m EDTA, pH 약 8.3))입니다.</li>
	<li>1.3 μ g/mL의 최종 농도에 thiazole 오렌지를 추가 합니다.<ol>
<li>Thiazole 10000 x 재고 솔루션 (13 mg/mL) DMSO에 오렌지를 분해. 특히 빛에 민감한, 동안에 사용 중인 어두운 때에 저장 합니다. 이 솔루션에 대 한 실내 온도에 안정 되어 ~ 개월; 장기 저장 aliquots (DMSO 표준 냉장고에서 얼어) 동결에 의해 달성 될 수 있습니다. 완전히 녹기 하 고 사용 하기 전에 냉동된 솔루션 resuspend 해야 합니다. 참고: 젤 또한 얼룩이 질 수 있다를 가진 전기 이동 법 후 (단계 2.6 참조). 향상 된 안전성 프로필 ethidium 평범한 사람, 표준 분자 생물학 실험실 안전 조치를 유지 한다 있다 하는 동안.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전자 레인지 agarose, 버퍼, 그리고 해산 오렌지 thiazole agarose의 혼합물 (약 60 s). 이 단계는 일반적으로 "녹는"로 참조. 소용돌이 (5 s) 필요한 경우 해산을 원조 하기 위하여. : 참고 선호 하는 경우 microwaving 후 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>짧게 젤 캐스팅 장치 포함 하는 적절 한 빗으로 하 고 있는걸 전에 냉각 agarose 솔루션을 수 있습니다.</li>
	<li>젤으로 공고히 agarose 솔루션을 수 있습니다.</li>
</ol>2. 로드 및 실행 하는 젤
<ol><li>젤 전기 이동 법 기구에 배치 하지 않는 경우 이미 존재.</li>
	<li>젤의 표면을 커버를 실행 버퍼 (태 또는 이상으로 TBE)를 추가 합니다.</li>
	<li>DNA 샘플 (일반적으로 10 μ) 로드 염료를 사용 하 여 로드 합니다. 참조에 대 한 DNA 크기 사다리를 포함 합니다.</li>
	<li>커버와 전극 (젤 빨간 양극 (긍정적인)으로 실행 해야 합니다) 첨부 합니다.</li>
	<li>전압을 적용 (일반적으로 ~ 100V 미니 젤 젤의 크기는 비록 젤 손상을 방지 하기 위해 수정 된 전압 필요할 수 있습니다) 적절 한 거리를 여행 했다 염료 로드 될 때까지 (미니 젤에 대 한 대략 4-7 cm 거리에 따라 다를 수 있지만 정확한 응용 프로그램)입니다. 참고: ethidium 평범한 사람 그리고 많은 다른 DNA 바인딩 염료, 같은 thiazole 오렌지 긍정적으로 위탁 된다. 따라서, 이러한 염료 electrophoresing DNA의 반대 방향으로 마이그레이션됩니다. 향상 된 분리 젤 아래까지 실행 되는 샘플에 대 한 결국 염료 약한 얼룩이 발생 하는 작은 DNA 조각에서 분리 됩니다. 이러한 경우에는 젤 단계 2.6에서 얼룩이 질 한다. 이 상황 하에 고유 하지 않습니다, 그리고 어떤 긍정적으로 위탁 역 DNA와 상호 작용 하는 염료 (ethidium 평범한 사람를 포함 하 여, 등)이이 동작을 전시할 예정 이다.</li>
	<li>만약에 이전 주조 (1.2 단계) 젤, 젤 thiazole 오렌지를 포함 하는 버퍼에 immersing 하 여 얼룩에 추가 되지 않았습니다.<ol>
<li>충분 한 버퍼 (TAE 또는 TBE) 준비 (약 20 분)를 감지 1.3 μ g/mL thiazole 젤 커버 하 고 밴드는 완전히 때까지 부드러운 동요와 젤을 담가 완전히 오렌지를 포함 하.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. thiazole 오렌지 agarose 젤 (UV transilluminator)의 시각화
<ol><li>젤 전기 이동 법 기구 및 UV transilluminator에 제거 합니다. 주의: 자외선은 피부와 눈에 손상 이다. 얼굴 (얼굴 방패) 보호 및 적절 한 눈 (고글)을 착용 해야 합니다. 손 장갑 하 고 긴 소매를 착용 한다.</li>
	<li>원하는 경우, 잘라 원하는 (대 한 더 소화 또는 결 찰, 예를 들면) 젤에서 DNA 밴드. 절단 동안 UV 빛에 대 한 짧은에 젤 가능한 시간의 길이 표시 합니다. UV 빛 (DNA 염료)에 DNA를 손상 한다.</li>
	<li>쉽게 사용할 수 있는 키트 또는 프로토콜15를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 합니다.</li>
</ol>4. thiazole 오렌지 agarose 젤 (블루 빛 transilluminator 또는 손전등)의 시각화
<ol><li>젤 전기 이동 법 기구 및 블루 빛 transilluminator (~ 470 nm 최대 방출 파장)에 장소에서 제거 합니다. 또는, 파란색 LED (~ 470 nm) 손전등 젤 (중에서 위 또는 아래)에서 지시 될 수 있다. 참고: 감도 블루 빛 transilluminator ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 낮은, ethidium 평범한 사람으로 물 DNA 감지할 수 있습니다이 블루 빛 프로토콜을 사용 하 여.</li>
	<li>푸른 빛, 형광의 시각화를 사용 하면 필터링 황색 방출 필터 (~ 560 nm longpass, 사각형 또는 고글)를 사용 하 여 DNA: thiazole 오렌지 복합물에서. 참고: 주황색 방출 필터 없이 그것 매우 어렵습니다 블루 빛 여기 소스의 강도 때문에 DNA 밴드를 검출 하기 위하여. 주의: 푸른 빛 심하게 손상 조직 (UV 대조), 장기 능력 부족 하지만 강렬한 푸른 빛에 노출 눈 손상 될 수 있습니다 그리고 주황색 방출 고글 또는 필터를 사용 해야 합니다.</li>
	<li>원하는 경우 추가 응용 프로그램에 대 한 젤에서 원하는 DNA 밴드를 잘라. 참고: 이후 블루 라이트 팬 들은 DNA의 정보를 손상 하지 않습니다, 그것은 급속 하 게 밴드를 잘라 하는 데 필요한 (때와 같은 단계 3.2에서에서 UV 여기를 사용 하 여).</li>
	<li>쉽게 사용할 수 있는 키트 또는 프로토콜15를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 합니다.</li>
</ol>5. 이미지 캡처
<ol><li>젤-이미징 장치에 적절 한 여기 및 방출 설정을 선택 합니다. 여기 및 thiazole 오렌지의 방출 (λ전, 최대 510 = nm (488 nm와 470 nm 자외선 파장에서 강한 여기 뿐만 아니라 강한 여기 표시); λem = 527 nm) 일반적인 블루 빛-감지 상업 사용 하는 염료 변경, 그래서 악기 필터 설정을 사용할 수 있는 미리 있습니다. 참고: 블루-빛-감지 상업 염료에 대 한 일부 필터 설정을 실제로 유해한 UV 빛을 사용 하 여 여기, 그래서 밴드 절단 전에 이미징 하는 경우 주의 사용. DNA 밴드 영상 후 excised 됩니다 때 블루 빛 여기 소스를 가능 하면 사용 합니다.</li>
	<li>적절 한 필터와 이미징 시스템의 부재에서 카메라와 젤/블루 라이트 여기 소스 사이 황색 필터를 놓습니다.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li>
<li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella%2Fmicrosome+test%3A+assay+of+300+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li>
<li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li>
<li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaudet%2C+M+%22Molecular+Probes%2C+Inc%22">Molecular Probes, Inc</a>. , USA. WO/2005/0333342 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157(1988).</li>
<li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li>
<li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li>
<li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li>
<li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Up+Probes%3A+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li>
<li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bisquinolinium%2FThiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li>
<li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+%E2%86%92+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li>
<li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Ethidium 평범한 사람은 오랫동안 알려진된 독성에도 불구 하 고 분자 생물학 실험실에서 표준 도구. 그것은 또한 요구로 감지 되 고 DNA를 손상 자외선에서 겪고 있다. Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람 뿐만 아니라 유용 하지만 비싼 상업용 염료는 저렴 한 대안을 제공합니다.
Thiazole 오렌지의 혜택은 따라서 두 배. 첫째, thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 교체로 간단 하 게 사용할 수 있습니다. 젤에 얼룩 (1.2 단계)으로 대체 된 EtBr을 동일 하 게 준비 될 수 있습니다. 검출 한계는 유사한 (1 ~ 2 ng/레인)1. 추가 장비는 thiazole 오렌지 EtBr 처럼 UV 빛 (3 단계)으로 검출 될 수 있다 때문에 염료를 전환 해야 합니다. 그러나 자외선에 노출 빠르게 손상 DNA,, 그리고 결 찰 및 변환1등 다운스트림 실험의 실패...

이 방법의 목적은 agarose 젤 형광 탐지 thiazole 오렌지 (을)를 사용 하 여 DNA를 식별 하는 것입니다. 그것의 저가 및 유리한 안전 프로필로 인해 thiazole 오렌지 학부 교육 연구소 및 분자 생물학, 특히 ligations 및 복제를 수행 하는 연구 실험실에서 특정 혜택을 볼 수 있습니다.
Ethidium 평범한 사람 agarose 젤에서 DNA의 검출에 대 한 가장 일반적인 염료 남아 있습니다. 이 매우 저렴 하 게 얻을 수 있습니다 때문에 주로 하며만 자외선과 여기 검색. 두 ethidium 평범한 사람 및 thiazole 오렌지 낮은 검출 한계 (1-2 ng/레인)1비싼 되지 않습니다. 그러나 Thiazole 오렌지 시 향상 ethidium 평범한 사람,,에 두 가지 주요 단점이 있다.
첫째, ethidium 평범한 사람은 특수 처리, 운송, 및 처리 요구 사항, 돌연2 thiazole 오렌지는 덜 돌연변이 (3-4 x 덜 Ames 시험에서 변이 원 성)3,4 와 일반적으로 삭제 될 수 있습니다 일반적인 화학 폐기물입니다.
둘째, ethidium 평범한 사람 검색 UV를 빛을 필요합니다. Thiazole 오렌지 바란다면, UV 빛 마찬가지로 사용할 수 있습니다 하지만 또한 푸른 빛으로 검출 될 수 있습니다. UV 빛, 일반적으로 사용 되는 몇 가지 두드러진 단점이 있습니다. 첫째, 그것은 인간의 피부와 눈에 손상 이다. UV 빛은 숙련 된 전문가 의해 안전 하 게 사용할 수 있습니다, 하는 동안 사고 피부 또는 눈 손상 (기능적으로 비슷합니다 sunburns) 실험실 UV 빛에서 미숙한 과학자와 특히 흔히 되지 않습니다. 둘째, 자외선은 DNA 샘플5, (결 찰 및 변환) 등 다운스트림 실험1,,67의 성공을 감소 시키는 매우 파괴적 이다. TO 있습니다 푸른 빛으로 감지 (λ전, 최대 510 = nm (488 nm 및 470 nm도 강한 흥분을 표시))는 피부 손상의 원인이 되지 않습니다, 또는 DNA 손상 (하지만 어떤 강렬한 빛은 여전히 눈에 해로울 수 있습니다), 두 과학자를 위험을 크게 감소 그리고 샘플입니다.
아니다 ethidium 평범한 사람;에 형광 염료 대안 그것의 이점은 비용입니다. Reticulocyte 얼룩8, 1980 년대에서 발견 되었다 및 다양 한 형광 DNA 기반 실험9,10,11,,1213에 유틸리티를 발견 했다. 그것은 현재 여러 공급 업체에 의해 판매 됩니다. 추가 하 고, 더 비싼의 부모 화합물, 파랑-빛-감지 상업 염료 이며 탐지1UV 또는 푸른 빛을 사용 하 여 전기 이동 법 동안 유사 하 게 동작. 또한, 다른 염료 보다 더 민감한 DNA 농도 매우 낮은 EtBr 또는, 일반 전기 실험에 대 한 동안, 같은 염료는 많은 상황에서 엄청나게 비싸다.

<table><tbody><tr><td>2-log DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (유전자 분석 등급)</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>블루라이트 손전등</td><td>WAYLLSHINE (아마존)</td><td>WAYLLSHINE 확장 가능한 파란색 LED</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Biorad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>비교를 위해</td></tr><tr><td>프로토콜 젤 장치(Owl Easy Cast)</td>에 필요하지 않음<td>Thermo Scientific</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Qiaquick 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager Viewing Glasses</td><td>Invitrogen</td><td>S37103</td><td>블루라이트 사용에 필요합니다.*</td></tr><tr><td>SafeImager 2.0(블루라이트 투과광기)</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>블루라이트 플래시라이트는 대체품으로 사용될 수 있습니다</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>비교를 위해,</td></tr><tr><td>프로토콜 TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td><td>Corning</td><td>46-010-CM</td><td></td></tr><tr><td>Thiazole orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Invitrogen G6600에는 안경도 포함되어 있습니다</td></tr></tbody></table>.

ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 thiazole 오렌지를 사용 하 여 dna 전기 이동 법

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA 젤 전기 이동 법은 agarose를 사용 하 여 크기에 의해 DNA 파편의 분리를 수 분자 생물학 실험실에서 일반적인 도구입니다. 분리 후 DNA 얼룩에 의해 시각 이다. 이 문서에서는 thiazole 주황색 얼룩을 DNA를 사용 하는 방법을 보여 줍니다. Thiazole 오렌지 비교 호의 일반적인 착 방법, 그것은, 저렴 한, UV 또는 파란 빛 (손상을 방지 하기 위해 샘플), 고르기 민감하고 ethidium 평범한 사람 보다 안전 합니다. 이미 DNA 전기 영동 실험 ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 실행을 갖추고 실험실 일반적으로 자외선을 사용 하 여 검색에 대 한 기존 프로토콜을 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다. 블루 빛 감지 샘플의 손상을 방지 하려면 블루 빛 소스와 배출 필터 또한 얻을 수 있습니다. 이미 블루 빛 감지 장비 실험실 단순히 기존 프로토콜 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다.

Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 사용 하지 않고 고 DNA 손상 자외선을 사용 하지 않고 DNA의 검색을 수 있습니다. Ethidium 평범한 사람은 변이 원 성, 되 고 그래서 실험실에서 그것을 제거 하는 유리한 수 있습니다. UV 빛 DNA를 손상 하 고 파란 빛은 DNA를 손상 하지 않습니다 반면 크게, 변환 효율을 낮춘 다. 검출 한계는 ethidium 평범한 사람, thiazole 오렌지, 일반적인, 파랑-빛-감지 상업 DNA 염색 유사 (그림 1, 테이블의 자료를 참조), ~ 1-2 되 고 모든 3 개의 염료에 대 한 검색 제한 ng/레인 미니 젤 1.
금지 효소 소화 밴드 절단 등 일반적인 응용 프로그램, thiazole 오렌지는 특히 잘 적합 합니다. 블루 빛 여기 DNA의 검출은 강력 하 고 간단 합니다, 그리고 과학...

여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

이 프로토콜은 전기 전구 중 DNA 검출을 위해 에디듐 브로마이드를 사용하는 쉽고 저렴한 대안입니다. 에티듐 브로마이드를 제거함으로써 UV 라이트 또는 청색광을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 청색광은 DNA에 손상을 입히고 다운스트림 실험의 성공 가능성을 향상시킵니다.이 것을 시도하는 것은 정말 쉽습니다. 젤의 에티듐 브로마이드를 티아졸 오렌지로 교체하기만 하면 됩니다. 시작하려면 약 0.7 그램의 아가로즈를 tris-acetate-EDTA 또는 트라이스 보레이트 버퍼70 밀리리터에 혼합하여 1%mini-gels를 준비하십시오.다음으로, DMSO에 티아졸 오렌지를 녹여 10, 000X 스톡 솔루션을 만듭니다. 특히 가벼운 민감하지는 않지만 사용하지 않을 때는 티아졸 오렌지를 어둠 속에서 보관하십시오. 장기 보관을 위해 티아졸 오렌지-DMSO 혼합물의 알리쿼트(aliquots)를 만들어 동결하십시오.그런 다음, 티아졸 오렌지를 밀리리터당 1.3 마이크로그램의 최종 농도에 넣고 아가로즈 버퍼와 티아졸 오렌지의 혼합물을 전자레인지에 넣고 약 60초 동안 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈 혼합물을 적절한 빗을 함유한 젤 주조 장치에 붓고, 아가로즈 용액이 젤로 고화되도록 한다. 젤을 적재하기 위해, 먼저 겔을 전기전도 장치에 배치하고, 아직 존재하지 않는 경우.그런 다음 TAE 또는 TBE 실행 버퍼를 추가하여 젤 표면을 덮습니다. 다음으로, 로딩 염료를 사용하여 DNA 샘플의 10 마이크로리터를 적재합니다. 참조를 위해 DNA 크기 조정 사다리를 포함한다.커버와 전극을 부착하고, 로딩 염료가 미니 젤을 위해 약 4~7cm까지 주행할 때까지 100볼트에서 미니 젤을 실행합니다. 티아졸 오렌지가 젤 주조 전에 적용되지 않은 경우, 약 20분 동안 또는 밴드가 완전히 검출될 때까지 티아졸 오렌지를 함유한 완충제에 침지하여 젤을 얼룩지게 한다. UV 트랜틸루미나이터를 사용하여 젤을 시각화하려면 전기 전광 장치에서 젤을 제거하고 UV 트랜틸루미노이터에 배치하십시오.청색광 트랜실루미나이터 또는 손전등을 사용하여 젤을 시각화하려면, 젤을 블루라이트 트랜실루미노이터에 놓거나 위 또는 아래에서 젤에 파란색 LED 손전등을 직접 배치한다. 호박색 방출 필터를 사용하여 청색광을 걸레로 하여 DNA 티아졸 오렌지 복합체에서 형광을 시각화하고 염료를 보호합니다. 추가 소화 또는 결찰을 위해, 젤에서 원하는 DNA 밴드를 잘라 쉽게 사용할 수있는 키트 또는 프로토콜을 사용하여 DNA를 추출진행합니다.젤 이미징 장치에서 적절한 여기 및 방출 설정을 선택합니다. 적절한 필터가 있는 이미징 시스템이 없는 경우 카메라와 젤 블루라이트 여기 소스 사이에 호박색 필터를 놓습니다. 검출 한계는 에티듐 브로마이드, 티아졸 오렌지 및 일반적인 청색 광 검출 가능한 상업용 DNA 염료 와 유사하며, 세 개의 염료에 대한 검출 제한은 미니 젤의 차선당 1~2나노그램입니다.제한 다이제스트의 티아졸 오렌지 스테인드 아가로즈 젤은 UV 또는 블루 라이트 트랜실루미나이터 또는 청색 조명 손전등으로 흥분할 때 감지할 수 있습니다. 티아졸 오렌지는 에티듐 브로마이드보다 덜 위험해 보이지만 장갑과 고글과 같은 표준 개인 보호 장비는 여전히 착용해야 합니다.

dna-electrophoresis-using-thiazole-orange-instead-ethidium-bromide-or

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

아가로 오스 겔 전기 영동을 이용한 DNA 조각의 분리를위한 기본적인 프로토콜이 설명되어 있습니다.

의 DNA 조각의 분리를위한 아가로 오스 젤 전기 영동

Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

이 비디오에서는 적외선 형광 표지 DNA 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 감지하는 전기영동 이동성 이동 분석을 시연합니다. 단백질이 DNA 프로브에 결합할 때, 천천히 이동하며 겔에 이동된 밴드로 나타나는 큰 복합체를 형성합니다.

transcription factor-DNA 복합체 검출을 위한 전기영동 이동성 전환 분석

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

RNA 절단 DNAzyme, urease 및 마그네틱 비드를 활용하는 변형 리트머스 테스트를 사용하여 E. coli의 비색 검출 프로토콜을 설명합니다.

리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

형광 현미경 검사 법에 대 한 DNA 분자를 얼룩이 지는 과학자를 실험 기간 동안 그들을 볼 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법에서 DNA 분자는 미리 형광 염료와 스테인드 하 고 메 틸 화 및 비 메 틸 화 과민 한 금지 효소로 소화.

DNA는 Cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정

여기서 우리는 RNA 망고 aptamers I, II, III, 또는 IV로 태그된 RNA를 이미지화하기 위해 민감하고, 신속하며, 차별적인 포스트 겔 염색 방법을 제시하고, 네이티브 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔을 사용한다. 표준 PAGE 젤을 실행한 후 망고 태그RNA는 TO1-Biotin으로 쉽게 염색한 다음 일반적으로 사용할 수 있는 형광 리더를 사용하여 분석할 수 있습니다.

포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화

학습하세요 티아졸 오렌지를 사용한 DNA 전기영동법으로 에티듐 브로마이드를 대체하는 안전하고 경제적인 방법을 배우세요. 청색광 검출로 DNA 손상을 최소화하여 후속 실험의 성공률을 높입니다.

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

더 많은 동영상 탐색