Name: CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 사카로미세세세레비시아와 이스트 픽셀 아트의 창조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 학습하세요 CRISPR/Cas12a를 이용한 Saccharomyces cerevisiae 멀티플렉스 게놈 편집 방법으로, 단일 crRNA 어레이로 여러 유전자좌를 동시에 편집하여 카로티노이드 생산 효모를 만드는 기술입니다.

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이 프로젝트는 보조금 협정에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(DD-DeCaf) 및 764591(SynCrop)에서 자금을 지원받았으며, 프로젝트 번호 737.016.005를 가진 연구 프로그램 빌딩 블록오브라이프에서 지원받았습니다. 과학 연구를위한 네덜란드 기구 (NWO). T.E.G.는 왕립 학회 (UF160357 부여)와 브리신 바이오, BBSRC / EPSRC 합성 생물학 연구 센터 (부여 BB / L01386X / 1)에 의해 지원되었다. 우리는 효모 픽셀 아트를 만들기위한 효모 발견 실험에 기여한 Zi Di와 Jeffrey van Wijk에게 감사드립니다.

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<li>Li, Z. -H., Liu, M., Lyu, X. -M., Wang, F. -Q., Wei, D. -Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li>
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<li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+versus+Cas12a%2FCpf1%3A+Structure%E2%80%93function+comparisons+and+implications+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481(2018).</li>
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<li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li>
<li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li>
<li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018(2017).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li>
<li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li>
<li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+%28SBOL+Visual%29+Version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 있음을 선언합니다. 저자는 제시 된 방법과 관련된 IP를 제출했습니다.

제공된 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA와 조합하여 Lachnospiraceae 박테리아 ND2006으로부터의 Cas12a를 사용하여 S. 세레비시아의 멀티플렉스 게놈 편집을 기술한다. 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA의 설계는 자세히 설명된다. 잘 확립된 CRISPR/Cas9 시스템과는 달리, CRISPR/Cas12a는 단일 crRNA 어레이13,33에서발현되는 다중 crRNA를 처리하는 독특한 추가 능력을 가지고 있다. 이 기능으로 인해 여러 대상을 동시에 편집하는 것이 더 쉬우며 단일 변환으로 수행할 수 있습니다. 이 단일 crRNA 배열 접근법은 Zetsche 외.에의해 이전에 입증되었습니다. 34명의 동시 는 AsCas12a를 사용하여 포유류 세포에 있는 4개의 유전자까지 편집하고, Swiat 외에의해. FnCas12a를 사용하여 효모 게놈에 4개의 DNA 단편을 도입한 35명. 우리의 지식에, Cas12a 시스템을 사용하여 동시 게놈 수정의 더 높은 수는 보고되지 않았으며 Cas12a를 위한 단일 배열당 표적의 최대 한계는 아직 결정되지 않았습니다. Cas12a와 조합하여 단일 crRNA 어레이를 활용하는 추가 연구는 광범위한 유기체33,36,37에서다중 전사 조절을 포함한다.
제시된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 특히 새로운 DNA 서열이 도입되는 경우 Cas12a 게놈 편집 실험에 관여하는 모든 DNA 서열을 신중하게 설계합니다. Verwaal et al.에의해 기술된 바와 같이 단일 플렉스 게놈 편집 실험에 의해 예를 들어 crRNA의 새로운 스페이서 서열 부분의 기능을 결정한다. 19를 단일 crRNA 어레이로 결합하기 전에. 효모의 좋은 변환 효율을 달성하기 위해 Cas12a 편집 실험에 사용되는 변환 버퍼 솔루션의 준비에 대한 권장 사항을 따르십시오.
이 기술의 몇 가지 선택적 수정 사항이 있습니다. 각 공여자 DNA의 1 μg, 선형화된 pRN1120 또는 단일 crRNA 배열 발현 카세트를 변형에 사용하는 것이 권장되지만, 더 낮은 DNA 양을 사용하는 것은 또한 만족스러운 형질전환 효율을 초래할 것으로 예상된다. 더 낮은 DNA 양이 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 시험 변환을 능력을 발휘합니다. S. 세레비시아의 변형은 이 프로토콜에 기재된 것과는 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Gietz et al. (2007년) 38.가이드 RNA 수용자 플라스미드 pRN1120은 상이한 Cas12a 변이체(예를 들어, 산아미노코커스 종으로부터의 단일 crRNA 및 단일 crRNA 어레이의 발현에 적합하다. BV3L6 또는 프란체셀라 노비시다 U112) 뿐만 아니라 Cas919와조합하여 sgRNA의 발현. 공여자 DNA는 유전체 DNA에서 기재된 INT1, INT2 및 INT3 부위에 공여자 DNA를 표적으로 하는 카로티노이드 유전자 발현 카세트 및 측면 영역으로 제한될 필요가 없다. 관심 있는 임의의 DNA는, 멀티플렉스 방식으로, 본 프로토콜에 기재된 설계 원리에 의해 숙주들의 게놈 DNA내로, 또는 대안적으로 공여자 DNA가 숙주 게놈으로부터 DNA를 삭제하는데 사용될 수 있다. 단일 crRNA 어레이의 모듈식 구조는 스페이서 및 직접 반복 서열의 쉬운 조정을 용이하게 합니다. 스페이서 서열의 변형은 게놈 표적 부위의 식별을 위한 도구 중 하나인 GuideScan 소프트웨어 1.039에의해 설계될 수 있는 의도된 통합 궤적의 변화를 허용한다. 커넥터 서열을 포함하는 큰 측면 서열을 사용하는 대신, 50-bp 의 측면 영역은 PCR에 사용되는 프라이머에 이들 50-bp 플랭킹 영역 서열을 통합함으로써 공여자 DNA 서열에 포함될 수 있다. 이 경우, 성공적인 멀티플렉스 게놈 편집 실험을 위해 9개의 공여자 DNA 단편 대신에 총 3개만 이요구된다.
요약하면, 이 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 접근법과 조합하여 Cas12a를 사용하여 S. 세레비시아에서 멀티플렉스 게놈 편집을 수행하는 단계별 지침을 제공한다. 이 프로토콜은 3개의 gRNA를 위한 9개의 공여자 DNA 단편 및 단 하나 crRNA 배열 코딩을 사용하여 다중 게놈 편집에 의해 입증되었습니다. 여기에 보고된 세 가지 변형 설계에 대해 전체 편집 주파수가 50%에서 94% 사이로 표시됩니다. 결론적으로, Cas12a의 독특한 특징은 단일 crRNA 어레이를 세포의 개별 crRNA로 처리하는 기능으로, Cas12a는 멀티플렉스 게놈 편집을 가능하게 하고 다중을 대상으로 하는 전사 조절 모듈을 개발하는 훌륭한 도구입니다. 한 번의 방식으로 카세트를 표현할 수 있습니다. 결국, 세 가지 균주는 노란색과 주황색 사이의 음영에서 다른 수준과 색상에서 카로티노이드를 생산을 얻었다. 그 균주와 야생 형 변형으로, 우리는 음향 액체 핸들러가 효모 픽셀 아트를 만들기 위해 간단하게 사용할 수있는 방법을 보여 주었다 - 그녀의 유명한 사진에 의해 DNA 구조의 발견에 기여 로잘린드 프랭클린의 명예에 65 년 전 그녀의 유명한 사진 5123< /c1>.

CRISPR/Cas 효소는 의심할 여지없이 분자 생물학에 혁명을 일으켰으며 이전에는 실현 불가능한 속도로게놈공학 도구로 널리 채택되었습니다 1. CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템에 의한 사카로마이세스 세레비시아 게놈의 첫 번째 변형은 디카를로 외에 의해 보고되었다. 2,성공적인 유전자 녹아웃을 시연하고 외부적으로 도입 된 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 포인트 돌연변이를 만듭니다. 추가 효모 CRISPR 툴박스 개발 포함: 촉매 비활성 죽은 Cas9 (dCas9)와 전사 이펙터 도메인의 융합에 의한 전사조절 3, 둘 다에 대한 응용 프로그램 동시 활성화, 억압 및 결실에 의한 대사 경로 공학을 위한게놈 편집 및 규제 기능 4, S. cerevisiae 게놈5,다중 염색체 융합에서 큰 파편의 삭제6 .
CRISPR/Cas 게놈 편집 시스템은 박테리아와 고고학의 적응형 면역 계통에서 기원을 발견하며, 이러한 시스템은 게놈 편집을 위해 분자 생물학자에 의해 조정되었습니다. 그들의 기능은 외국 DNA 또는 RNA및 RNA 유도를 인코딩하는 CRISPR 관련 유전자 (Cas)의 인식에 책임 있는 RNA를 인코딩하는 군집된 정규 간격 짧은 Palindromic 반복 (CRISPR) DNA 지구에 근거를 두었습니다 endonucleases1,7,8,9. CRISPR/Cas 시스템의 최근 게놈 분석을 기반으로 CRISPR/Cas 시스템을 두 가지 클래스, 5가지 유형 및 16개의 아류형10으로나눌 것을 제안했습니다. 두 클래스는 대상 분열에 관련된 이펙터 복합체의 조직에 따라 구별된다. 전형적으로, 다중 소단위 조직을 가진 CRISPR/Cas 시스템은 클래스 1로 분류되는 반면, 단일 서브유닛 이펙터 컴플렉스는 클래스 210,11에속한다. 이 문서에서는 클래스 2 유형 II Cas9에 대한 대안인 Cpf110,12라고불리는 클래스 2 형식 V Cas12a를 살펴봅습니다. Cas9는 잘 특성화되어 널리 연구에 사용되지만 Cas12a는 추가 기능12를제공합니다. 첫째로, Cas12a는 추가적인 트랜스 활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 요구하지 않고 42~44개의 뉴클레오티드의 CRISPR RNA(crRNA)를 가진 복합체를 형성한다. 따라서, 더 짧은 가이드 RNA는 CRISPR/Cas9에 비해 CRISPR/Cas12a 시스템을 사용하여 게놈 편집에 사용될 수 있다. 둘째, Cas12a의 독특한 엔도뉴클리스 및 엔도리보뉴클리스 활성은 프리 crRNA13의성숙을 가능하게 한다. 이 RNase 활동은 단일 CRISPR crRNA 배열상에 다중 crRNA의 인코딩을 허용하는 반면, Cas9는 각각의 소위 단일 가이드 RNA(sgRNA) 또는 대안적으로 추가엔도뉴클러의 발현을 필요로 한다( 예를들어, Csy4)는 각 sgRNA14,15를둘러싸는 Csy4에 대한 인식 모티프와 함께 한다. 셋째, Cas12a 대상 사이트 인식은 대상에서 5' 끝에서 protospacer 인접 모티프 (PAM)를 필요로하고 고정 된 끝으로 절단 된 DNA를 초래하는 PAM에서 +18 /+23 위치 후 갈라진 반면 Cas9는 3 '끝에서 PAM을 필요로합니다. DNA12에서무딘 끝 절단을 만드는 -3 위치 후에 표적 및 절단. 넷째, PAM의 합의 뉴클레오티드 서열은 Cas12a(((T)TTV)와 Cas9(NGG) 사이에서 다르며, 이는 Cas12a를 T-풍부 프로모터 및 터미네이터 서열을 표적으로 하는 유망한 후보(16)를 만든다. 마지막으로, 최근 연구는 네이티브 Cas917에대 한 보다 Cas12a에 대 한 더 큰 대상 특이성을 보고.
우리는 독립적 인 게놈 로시에 여러 DNA 발현 카세트를 동시에 도입에 특히 초점을 맞춘 S. cerevisiae의 게놈 편집을위한 CRISPR / Cas12a 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제시합니다 (멀티 플렉스 게놈 편집)을 사용하여 단일 crRNA 배열. 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에설명되어 있습니다. 개념의 증명으로, CRISPR/Cas12a 시스템은 도2에 도시된 바와 같이 β-카로틴18의 생산을 가능하게 하는 S. cerevisiae의 게놈내로 3개의 발현 카세트를 도입하기 위해 적용되었다. β-카로틴의 생산은 S. 세레비시아의표현형에 영향을 미칩니다 : 즉, 카로티노이드 생합성에 필요한 세 가지 이종 유전자를 성공적으로 도입하면 백색 S. 세레비시아 세포가 노란색 또는 주황색으로 변합니다. 각 유전자의 발기인의 발현 강도에 따라 달라집니다. 이 통로의 간단한 시각적 판독으로 인해, 그것은 게놈 편집을위한 고급 CRISPR 기반 시스템 및 방법을 개발하기 위해 도입되었다19,20. 이 작품에서, 카로티노이드 유전자 crtE, crtYB 및 crtI를 코딩하는 발현 카세트는 이종 프로모터 및 상동성 종기를 이용한 골든 게이트 클로닝(GGC) 접근법21을 사용하여 제작되었습니다. 유전자의 발현을 유도하는 데 사용됩니다. 발현 카세트는 커넥터라고 불리는 고유한 50-base 쌍(bp) 서열로 둘러싸여 있으며, 동일한 50bp 서열과 동일한 50bp 서열과 통합 측면 DNA 서열(flanking regions)을 사용하여 생체 내 조립을 허용합니다. 측면 부위에 의해 결정된 위치에서 효모의 게놈 DNA로 들어갑니다. 상이한 프로모터 강도를 사용하여, 카로티노이드 생산의 상이한 수준을 가진 균주는 세포의 색깔에 있는 변이의 결과로 얻어졌다. "효모 예술 프로젝트"22에서 영감을 얻은 이 균주는 로잘린드 프랭클린의 4색 고해상도 "효모 사진"을 만들기 위해 음향 액체 핸들러와 함께 스포팅 셋업에 사용되었습니다. 프랭클린 (Franklin, 1920-1958)은 사진 5123,24,25에의해 DNA 구조의 발견에 그녀의 기여로 잘 알려진 영어 화학자 및 X 선 결정기.

<table><tbody><tr><td>Chemicals specific for the protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td>전기영동</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨</td>염 <td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td>E. coli 형질전환체</td></tr><tr><td>선택 BsaI-HF (20 U/&micro; l)</td><td>New England BioLabs</td><td>R353L</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>Cell Lysis Solution(키트: Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td>: <td>S. cerevisiae에서 게놈 DNA 분리</td></tr><tr><td>CutSmart Buffer,</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td>: 연어 고환에서 <td>pRN1120</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid sodium salt salt Sigma</td><td>Aldrich</td><td>D1626</td><td> S. cerevisiae(운반체 DNA)</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>PCRs</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td> 분석을 위한 <td>pRN1120</td></tr><tr><td>에탄올 절대적인</td> 선형화 <td>Merck</td><td>100983</td><td>S. cerevisiae</td></tr><tr><td>에틸렌디아민-테트라아세트산</td>에서 게놈 DNA 분리 <td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>형질전환 S. cerevisiae</td></tr><tr><td>G418 이황산염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td>S. cerevisiae 형질전환체 선택</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158&nbsp;</td><td>이스트 픽셀 아트</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>머크(Merck</td><td>100993</td><td>S. cerevisiae</td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물</td><td>시그마 알드리치(Sigma Aldrich</td>) <td>L688</td><td>><3 S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Nancy-520 DNA Gel Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1494</td><td>전기영동</td></tr><tr><td>NEB10 유능한 대장균 세포</td><td>New England BioLabs C3019H</td><td></td><td>대장균의 형질전환: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB102</td><td>S. cerevisiae 형질전환체의 선택</td></tr><tr><td>Phusion buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 4000</td><td>Merck</td><td>7490</td><td>Transformation of S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Purple loading dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td>Electrophoresis</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Purification of plasmids</td></tr><tr><td>RNase coctail enzyme mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>S. cerevisiae</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 완충액</td>에서 게놈 DNA의 분리 <td>Invitrogen</td><td>46300-018</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (1 U/&micro; l)</td><td>Invitrogen</td><td>1705218</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Electrophoresis</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>PCR 산물 및 선형화된 pRN1120</td></tr><tr><td>Xhol</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td>pRN1120</td></tr><tr><td>Zymolyase의 선형화 50 mg/ml (5 units/&micro; L)</td><td>Zymo Research</td><td>E1006</td><td>S. cerevisiae(효모 용해 효소)에서 게놈 DNA 분리</td></tr><tr><td>Zymolyase 저장 버퍼</td><td>Zymo Research</td><td>E1004-B</td><td>S. cerevisiae에서 게놈 DNA 분리(효모 용해 효소 준비에 필요)</td></tr><tr><td>Chemicals of general use</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2*Peptone-Yeast extract (PY) 한천</td><td></td><td></td><td>플레이트 대장균의 성장</td></tr><tr><td>2*PY 배지</td><td></td><td></td><td>대장균</td></tr><tr><td>탈염수</td><td></td><td></td> 배양 <td> S. cerevisiae</td></tr><tr><td>ELFO 완충액</td><td></td><td></td>의 변형 <td>전기영동</td></tr><tr><td>MQ</td><td></td><td></td><td>다중 단계</td></tr><tr><td>생리적 염 용액</td><td></td><td></td><td> S. cerevisiae TE의 변환</td></tr><tr><td> 완충액</td><td></td><td></td><td>DNA 저장, S. cerevisiae 형질전환</td></tr><tr><td>효모 추출물-펩톤-덱스트로오스(YEPD; 2% 포도당) 배지</td><td></td><td></td><td>S. cerevisiae</td></tr><tr><td>YEPD(2% 포도당) 한천</td><td></td><td></td><td>배양 플레이트 S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr>의 플레이트 성장<tr><td>팔콘 튜브 (50 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>마이크로 플레이트 96 웰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 0.5 - 10 &micro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 10 - 200 &마이크로; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파이펫 팁 100 - 1000 &마이크로; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>쉐이크 플라스크 (500 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력한>장비</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 (팔콘 튜브)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo 525 acoustic liquid handler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> 전기영동 분광광도계용 NanoDrop <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> 세트: Table centrifuge (Eppendorfs tubes)ThermocyclerPlasmidspCSN067 Addgene ID 101748 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>https://www.addgene.org/</td></tr> <tr><td>pRN1120</td><td>Addgene</td><td>ID 101750</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain CEN. PK113-7D</td><td>EUROSCARF 컬렉션</td><td></td><td>http://www.euroscarf.de</td></tr></tbody></table>

crispr/cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 사카로미세세세레비시아와 이스트 픽셀 아트의 창조

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

고효율, 사용 편의성 및 클러스터된 정기적인 간격짧은 palindromic 반복/CRISPR 관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9) 시스템은 사카로마이스 세레비시아의고급 유전자 변형을 촉진시켰습니다. 산업 생명 공학의 유기체 및 주력. CRISPR 관련 단백질 12a (Cas12a), Cas9와 구별되는 특징을 가진 RNA 유도 엔도뉴클러가 이 작업에 적용되어 게놈 편집을 위한 분자 도구 상자를 더욱 확장합니다. CRISPR/Cas12a 시스템의 장점은 단일 전사 유닛(단일 CRISPR RNA(crRNA) 어레이로부터 발현되는 다중 가이드 RNA를 이용한 멀티플렉스 게놈 편집에 사용될 수 있다는 것이다. 우리는 단일 crRNA 어레이 구조에서 발현된 다중 crRNA를 가진 CRISPR/Cas12a 시스템을 사용하여 S. 세레비시아 게놈의 독립적인 궤체로 다중 이종 유전자의 다중 통합을 위한 프로토콜을 제시합니다. 제안된 방법은 S. cerevisiae가 DNA 단편의 생체 내 재조합을 수행하여 단일 crRNA 어레이를 변형제 선택뿐만 아니라 기증자 DNA의 조립에 사용할 수 있는 플라스미드로 조립하는 능력을 이용합니다. 의도된 위치에서 게놈에 통합되는 서열. Cas12a는 단일 crRNA 어레이의 발현 시 의도된 위치에서 S. 세레비시아 게놈의 절단을 용이하게 구성적으로 미리 발현된다. 이 프로토콜은 단일 crRNA 어레이 및 공여자 DNA 발현 카세트의 설계 및 시공을 포함하고 있으며, 고유한 50bp DNA 커넥터 서열과 별도의 통합 측면 DNA 서열을 사용하여 단순화하는 통합 접근 방식을 활용합니다. 표준화 및 모듈화를 통한 실험 설계및 적용 범위를 확장합니다. 마지막으로, 우리는 구성 된 효모 균주를 생산하는 다른 색깔의 카로티노이드를 사용하여 음향 액체 처리기로 효모 픽셀 아트를 만드는 간단한 기술을 보여줍니다.

CRISRP/Cas12a를 이용한 멀티플렉스 게놈 편집프로토콜은 이종프로모터를 사용하여 crtE, crtYB 및 crtI 유전자를 발현하는 세레비시아균을 생산하는 3개의 카로티노이드를 생성함으로써 입증되었다. 높음, 중간 강도 및 낮은 강도: 변형 1, 2 및 3 각각 (보충표3). 이러한 균주의 구성은 게놈 DNA에서 3개의 상이한 궤체를 표적으로 하기 위한 균주당 3개의 공여자 DNA 발현 카세트 및 6개의 측면 영역의 생성을 요구했다(그림 2B에도시됨). 본 명세서에 기재된 바와 같이, 프로모터, 개방 판독 프레임, 터미네이터 및 2개의 연속50-bp 커넥터 서열은 골든 게이트 클로닝 반응을 통해 발현 카세트로 조립되었고 조립체는 PCR에 의해 확인되었다(도3A). 단일 crRNA 어레이는 합성 DNA 단편으로서 주문되었고 PCR에 의해 증폭되었다(도3B). 단일 crRNA 어레이(plasmid pRN1120)에 대한 수용자 플라스미드를 에코RI-HF 및 XhoI로 선형화하고 선형화하여 전기영동에 의해 확인하였다(도3C). 도입된 공여자 DNA 발현 카세트 및 측면 영역의 설계 및 뉴클레오티드 서열은 보충표 3 및 보충표4에 도시되어 있다. 단일 crRNA 배열 발현 카세트의 서열은 보충 표1에 제공된다. 단일 crRNA 어레이에 포함된 스페이서의 기능은 개별 crRNA19를통한 단일 플렉스 게놈 편집에 의해 사전에 테스트되었다.
Cas12a를 이용한 게놈 편집의 효율은 먼저 변형 후 얻어진 유색 콜로니의 수에 기초하여 평가되었다(표1, 도4). 3개의 구성된 균주의 편집 효율은 50%에서 94%까지 다양했습니다. 특히, 균주 1을 생성하는 데 사용되는 발현 카세트의 도입은 가장 낮은 편집효율을 표시, 아마도 기증자 DNA의 특성에 의해 발생 (즉, 이러한 발현 카세트 는 crtE, crtYB 및 crtI를 인코딩 3개의 고강도 프로모터)에서) 둘째, 게놈 DNA상에서 의도된 자위부에서 3개의 공여자 DNA 발현 카세트를정확하게 통합하여 PCR에 의해 확인되었다(도 5). 프라이머는 의도된 궤적에서 공여자 DNA의 정확한 통합이 발생했을 때 PCR 제품을 수득하는 방식으로 설계되었다. 각 변환 실험에 대해, 8개의 콜로니를 변형 플레이트로부터 선택하여 시험하였다(그림 5에는 3개만 제시된다). 일반적으로, 기증자 DNA당 시험된 8개의 콜로니 중, INT1 궤적에서 crtE 기증자 DNA의 정확한 통합, INT2 궤적에서의 crtYB 및 INT3 궤적의 crtI는 형질전환제의 &gt;90%에서 확인되었다. 이러한 결과는 단일 crRNA 어레이와 결합된 CRISPR/Cas12a 시스템을 입증하여 여러 로시에서 S. 세레비시아 게놈의 효율적인 멀티플렉스 편집을 동시에 가능하게 합니다.
또한, 우리는 비 착색 야생 형 균주와 함께 건설 된 세 개의 카로 티노이드 생산 균주를 사용하여 "효모 픽셀 아트"의 생성을 보여줍니다. 로잘린드 프랭클린 (그림6A)의 흑백 그림에서 시작하여 4 색 그림 (그림6B)과 스포팅 리스트가 작성되어 한천 마이크로 플레이트에서 4 개의 다른 효모 균주를 발견하는 데 사용되었습니다. 로잘린드 프랭클린 (그림6C, D,E)의 고해상도 "효모 페인팅"의 결과로 음향 액체 처리기.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> 그림 1 : CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집을 위한 프로토콜 워크플로우 워크플로에는 제시된 메서드의 중요한 단계가 포함됩니다. 자세한 내용은 프로토콜을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> 그림 2 : 단일 crRNA 어레이를 이용한 CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 방식. (A) 단일 crRNA 어레이는 성숙한 형태의 3개의 crRNA 단위로 구성되며, 23-bp 가이드 시퀀스(컬러 다이아몬드)를 가진 LbCas12a(회색 사각형)에 대해 20-bp 직접 반복된다. crRNA 어레이의 발현은 SNR52 프로모터 및 SUP4 터미네이터에 의해 활성화된다. s. 세레비시아의 선형화된 pRN1120 및 pRN1120(대각선 줄무늬)을 함유하는 단일 crRNA 배열 발현 카세트를 사용하여 세포에서 원형 플라스미드로 재조합을 미리 발현할 수 있다. LbCas12a. 단일 crRNA 어레이는 이후 Cas12a에 의해 처리된다. (B) Cas12a는 의도된 INT1, INT2 및 INT3 게놈 표적 부위로 향하고 이중 연선 브레이크를 생성한다. 형질전환 혼합물에서, 측면 영역 및 카로티노이드 유전자 발현 카세트로 구성된 공여자 DNA가 포함되었다. 공여자 DNA 어셈블리는 50-bp 상동성 커넥터 서열의 존재로 인하여 생체 내 재조합에 의한 INT1(crtE), INT2(crtYB) 및 INT3(crtI) 주위의 게놈 DNA에서 1개의 스트레칭을 표적으로 하였다. 5, A, B, C, D 또는 E. P1-P3, 상이한 프로모터로 표시; T1-T3, 다른 종기. 이 수치는 Verwaal 외. 201819에서수정되었습니다. 합성 생물학 개방 언어 (SBOL) 시각적 기호를 사용하여 표시된 유전 구조40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> 그림 3 : 게놈 편집 실험을 검증하는 PCR. (A) 조립된 기증자 DNA 카세트의 골든 게이트 복제 반응 검증. 얻은 결과는 예상 길이와 일치합니다. (B) 단일 crRNA 어레이의 PCR. (C) 플라스미드 pRN1120의 선형화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> 그림 4 : 멀티플렉스 게놈 편집 방식을 이용한 S. 세레비시아 형형판. (A) 3개의 강한 프로모터(다크 오렌지 콜로니)로부터 crtE, crtYB 및 crtI를 발현하는 균주 1. (B) 3개의 중간 강도 프로모터(주황색 콜로니)로부터 crtE, crtYB 및 crtI를 발현하는 균주 2. (C) 3개의 저강도 프로모터(노란 콜로니)로부터 crtE, crtYB 및 crtI를 발현하는 균주 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> 그림 5 : PCR은 게놈 DNA 내의 의도된 궤체에서 공여자 DNA 발현 카세트의 통합을 확인한다. (A) 균주 1의 3 개의 콜로니의 확인. (B) 균주 2의 3 개의 콜로니의 확인. (C) 균주 3의 3 개의 콜로니의 확인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> 그림 6 : 로잘린드 프랭클린의 효모 픽셀 아트. (A) 템플릿으로 사용 된 로잘린드 프랭클린의 220 × 280 픽셀의 흑백 RGB 사진. (B) 로잘린드 프랭클린의 흑백 사진을 4색 64 × 96 픽셀 목록으로 컴퓨터 변환. (C) 64 × 96 효모 콜로니가있는 효모 픽셀 아트의 사진 확대 섹션. (D) 두 개의 전체 재배 플레이트가있는 음향 액체 핸들러의 사진. (E) 64 × 96 효모 콜로니가있는 전체 재배 마이크로 플레이트 의 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>변형 변형 1</td>
			<td>변형 변형 2</td>
			<td>스트레인 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>유색 식민지</td>
			<td>16세</td>
			<td>279</td>
			<td>220개</td>
		</tr>
<tr>
<td>백색 식민지</td>
			<td>16세</td>
			<td>18세</td>
			<td>18세</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 식민지</td>
			<td>32세</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
<tr>
<td>효율성</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 멀티플렉스 게놈 편집 접근법의 편집 효율.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>crRNA 배열 시퀀스a, b, c, d, e, f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
CATGTTTGACAGCATATATATATATATCCGGTTAGCATGCGCTTTAGAACTAGTGGGCCCCGGCGCGCGCAGAACTAGTGGATCCCCGGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC TCTTTGAAAA 가타트가타트GCTTTATAT타타카가가가가가가가가가가가가트는TTTCT가그타타타카그 TGATTACATGTACTTGAAGTACAACTAACTACTAGATTTTTGCGCTTTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGCTTGCTTGCTTGCTTGCTAAAAGAAAGA TTTTCACACCACCATTTTTTTTTCAAAGATTTTCAAACTTTTTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAAGGAAAGTTGGCGCGCGCGC ATGTTTCGGCTCGAAACTTCTCCGCAGAAAATAtCAtATCTACTAGTGTAGATAT CTGGGGGGAGAAGCTATATGAATTTCTACTAGTGTAGATGTGCCGTAC GCCGGAGGACGG아타타타가트TGCCTCTTATACtGATTATTTT TtTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGGGCCCCGCACCTTTTTTTTAGTGAGG GTTAATTCCGTGTTTTTTTTTTGTG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. pRN1120 (굵게)에 대한 상동성. b. SNR52 프로모터 (기울임꼴). c. 게놈 표적 서열(밑줄이 그어진). d. LbCas12a(기울임꼴, 굵게)에 특정한 직접 반복을 안내합니다. e. SUP4 터미네이터(기울임꼴). f. pRN1120 (굵게)에 대한 상동성.</td>
		</tr>
</tbody></table>보충 표 1: 플라스미드 pRN1120을 함유하는 상동성을 함유하는 LbCas12a에 대한 단일 crRNA 어레이.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>이름</td>
			<td>시퀀스a</td>
			<td>설명b</td>
			<td>점에서 사용</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>카트가카카타캣</td>
			<td>단일 crRNA 어레이의 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>카카가아카카GCTATGAC</td>
			<td>단일 crRNA 어레이의 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>아그CGACTTCCAATCTTTGC</td>
			<td>커넥터를 통해 기증자 DNA증폭을 위한 FW 프라이머 5</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>아아카아가아가가가가가가가가가가가가</td>
			<td>커넥터 A를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>크가트가트타카아카카아크</td>
			<td>커넥터 B를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>카카그그크가트가타타타크</td>
			<td>커넥터 C를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCTTGTATCC</td>
			<td>커넥터 D를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>아그타카아카그카그가카그</td>
			<td>커넥터 E를 통해 기증자 DNA 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>선인장</td>
			<td>커넥터 5를 갖춘 INT1 5' 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
아악GCGCGTGTGTGGGGTAC TGGATATGCAAGC가트가가아 GTCGCTT[GCCGTC] ATTCC</td>
			<td>커넥터 5를 갖춘 INT1 5' 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
TTGCCCATCGAACGTACAAG 택트CTTCTCTCTCCCCCCTT TGCTTTAAGCGTTTTGAAGTTTCCTC TTTG</td>
			<td>커넥터 A를 갖춘 INT1 3' 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTG가가GCTATCG</td>
			<td>커넥터 A를 갖춘 INT1 3' 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>아가가트CTCTCTCTC</td>
			<td>커넥터 B를 갖춘 INT2 5'의 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTA가트GTTCGTT TGGGTGCAGTGTGTGTTTTTTACAT CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC TGGTTG</td>
			<td>커넥터 B를 갖춘 INT2 5' 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
아카트CCGGCTCTTCCA 가카카그타트CCCCCT CCTGTGGGCGATTACACAAGCG GTGG</td>
			<td>커넥터 C를 갖춘 INT2 3' 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCTTTCGATGGGG</td>
			<td>커넥터 C를 갖춘 INT2 3' 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTTGTGCGCATAtTG</td>
			<td>커넥터 D를 갖춘 INT3 5' 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
GCGGATATTGGCGGAACGG 아카카그GT가타아카아아크 가카에그트TTCCAAGGAggTG 아가아CG</td>
			<td>커넥터 D를 갖춘 INT3 5' 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
아타카아카아카아카트CC CCCATATGCTCGTGCTTT GTACCT가트그가브크카카그액트 GTAC (주)(주)</td>
			<td>커넥터 E를 갖춘 INT3 3' 증폭을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>가그CTACTATATATTCatC</td>
			<td>커넥터 E를 갖춘 INT3 3' 증폭을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAACTGAACTGCCG</td>
			<td>CON5-crtE-conA에서 INT1 5'로 의 통합 검증을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>선인장타액타그트택트</td>
			<td>CON5-crtE-conA에서 INT1 3'에 통합검증을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>선인장</td>
			<td>CONB-crtYB-conC와 INT2 5'의 통합 검증을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTAGCTGAATTCC</td>
			<td>CONB-crtYB-conC와 INT2 3'의 통합 검증을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>COND-crtI-conE와 INT3 5'의 통합을 검증하기 위한 FW 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>가트CG트카트타그그가그</td>
			<td>COND-crtI-conE와 INT3 3'의 통합검증을 위한 FW 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTCC</td>
			<td>CON5-crtE-conA에서 INT1 5'로 의 통합 검증을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCAT가CTGT가타악</td>
			<td>CON5-crtE-conA에서 INT1 3'에 통합검증을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTT가가카아츠GC</td>
			<td>CONB-crtYB-conC와 INT2 5'의 통합 검증을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAGTCTG</td>
			<td>CONB-crtYB-conC와 INT2 3'의 통합 검증을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTTGGAGCAGCAG</td>
			<td>INT3 5'에 conD-crtI-conE의 통합검증을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>INT3 3'에 conD-crtI-conE의 통합 검증을 위한 RV 프라이머</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. 굵은 시퀀스는 커넥터 시퀀스를 나타냅니다. b. 정방향 및 후진 프라이머는 각각 FW 및 RV로 지정됩니다.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>보충 표 2: 프라이머 서열.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> 보충 표 3: 건설된 균주의 설계.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> 보충 표 4: 기증자 DNA 발현 카세트 및 박리 영역의 서열. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

단일 crRNA 어레이와 결합된 CRISPR/Cas12a 시스템은 여러 로시에서 동시에 S. 세레비시아 게놈의 효율적인 멀티플렉스 편집을 가능하게 합니다. 이것은 이후에 효모 픽셀 예술을 만드는 데 사용되는 효모 균주를 생산하는 카로티노이드를 구성하여 입증됩니다.

CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 사카로미세세세레비시아와 이스트 픽셀 아트의 창조

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

이 프로토콜은 단일 변환 단계에서 다른 loci에 여러 발현 카세트를 도입하여 사카로미세스 cerevisiae의 멀티플렉스 게놈 편집을 위한 새로운 방법을 보여줍니다. 단일 crRNA 어레이를 표현하기 위한 이 복제 무료 플라스미드 어셈블리 접근 방식은 신속하고 효율적이며 유연한 게놈 편집 프로토콜로 이어집니다. 우리는 야생 형 효모 세포를 설계하여 무료 게놈 loci에 무료 이종 유전자를 도입하여 카로티노이드를 생산할 것입니다.단일 crRNA 어레이는 RNA 폴리머라제 프리 프로모터로부터 발현된 자유로운 개별 crRNA로 구성된다. Cas12a는 crRNA 배열을 개별 crRNA로 생체 내에서 처리합니다. crRNAs는 Cas12a가 이중 가닥 브레이크를 소개하는 게놈 DNA에 있는 표적 loci에 Cas12a를 안내합니다.하향 DNA 단편은 생체 내 재조합을 위해 재결합하고 게놈 DNA에 통합합니다. 프로토콜을 시연하는 것은 박사 과정 학생인 클라우디아 시우르코트(Klaudia Ciurkot)입니다. 제프리 반 위크, 준과학자.그리고 브렌다 본크, 우리의 실험실에서 수석 준 과학자. 합성 DNA의 멀티플렉스 게놈 편집 실험을 위한 단일 crRNA 어레이를 얻은 후 PCR 증폭 믹스를 준비하고, 증폭을 위해 열순환기로 배열을 로드한다. 전기전도로 PCR 제품을 분석하려면 샘플을 5V/cm에서 0.8%의 아가로즈 젤로 40분간 실행합니다.DNA 사다리에 100 10000 베이스 쌍에 이르는 DNA 조각을 적재한 다음 제조업체의 지시에 따라 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다. 효모 변환을 위해, 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 또는 YEPD 배지의 20mL를 포함하는 100mL 플라스크에서 야생형 효모를 미리 배양하는 것으로 시작한다. 하룻밤 배양의 경우, 섭씨 30도, 분당 250회 회전 다음날 아침, 하룻밤 전 배양 효모의 계산된 부피로 신선한 YEPD 배지 20mL를 접종한다.600 나노미터로 측정된 1.0의 광학 밀도가 도달할 때까지 흔들리는 인큐베이터에 배양을 놓습니다. 원심분리에 의해 효모 세포를 수확한다. 효모 세포 펠릿을 실온 탈염 수의 20mL로 씻고 추가 원심 분리가 뒤따릅니다.리튬 아세테이트 Tris-EDTA 용액의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고 효모를 미세 원심 분리튜브로 옮기습니다. 단일 좌초 캐리어 DNA의 5 마이크로 리터와 플라스미드 pCSN067의 마이크로 그램을 효모 세포 현탁액과 혼합합니다. 그런 다음 폴리에틸렌 글리콜 LiAc-TE 용액 600 마이크로리터를 샘플과 혼합합니다.효모 세포와 플라스미드를 섭씨 30도에서 30분, 테이블 탑 히트 블록에 450prm을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 디메틸 설프리산화물 70mL를 변환 용액과 혼합합니다. 42도의 수조에서 혼합물을 15분 동안 열충격을 가합니다.혼합물을 15mL 원형 하단 튜브로 옮기. 10mL의 YEPD를 튜브에 추가하여 섭씨 30도, rpm 250도에서 하룻밤 동안 배양을 합니다. 다음 날 아침, 원심분리에 의해 변형된 세포를 수집하고, 상류체의 최종 200 마이크로리터를 제외한 모든 것을 흡인한다.나머지 상체에서 변형 된 효모 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 변형 믹스의 플레이트 150 마이크로리터, 및 YEPD에서 변형 믹스의 나머지 50 마이크로 리터의 20 배 희석의 150 마이크로 리터, YEPD 천접시에, G418의 리터 당 0.2 그램으로 보충. 섭씨 30도에서 48~72시간 후, G418의 0.2g/L로 보충된 새로운 YEPD 한천 판을 다시 선적하기 위해 단일 변압제를 선택하십시오.두 번째 변환을 위해, 방금 입증된 것처럼 배양을 600 나노미터1.0미터에서 광학 밀도로 성장시다. 또한 마이크로센심분리기 튜브에 20마이크로리터의 세포를 추가합니다. 원심 분리 후 LiAc-TE 용액의 100 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 ssDNA를 추가합니다.별도의 튜브에서, 단일 crRNA 어레이의 1마이크로그램, crRNA 어레이를 위한 선형화된 수신자 플라스미드의 1마이크로그램, 각 기증자 DNA의 1마이크로그램 및 각 측면 영역의 1마이크로그램을 결합한다. 그런 다음 DNA 혼합물을 유능한 효모 세포의 튜브로 옮기고 제1 변환을 위해 입증된 바와 같이 두 번째 변환을 완료합니다. 다음 날 아침, 원심분리로 세포를 수집하고 상류제의 작은 알리쿼트에 펠릿을 다시 놓습니다.그런 다음 변환 믹스의 150 마이크로 리터를 플레이트, YEPD 배지에서 변형 믹스의 20배 희석제 150마이크로리터, YEPD 에이프라 플레이트에 0.2g/L G418로 보충되고, 48~72시간 후 0.2g/L nourseothricin을 30도에서, 새로운 YEPD 플레이트에서 단일 컬러 변환제를 선택하여 새로운 YEPD 플레이트를 획득할 수 있습니다. 게놈 편집 효율을 결정하기 위해 변환 플레이트의 유색 및 흰색 식민지 수를 계산하고 유색 식민지 수를 총 식민지 수로 나눕니다. 효모 픽셀 아트를 만들기 위해 YEPD 배지 100mL를 포함하는 개별 500mL 쉐이크 플라스크를 접종하고 S.cerevisiae 균주를 생산하는 세 가지 다른 색의 카로티노이드와 야생 형 CEN을 생성합니다.PK113-7D 스트레인. 250 rpm에서 흔들어와 섭씨 30도에서 하룻밤 문화를 배양. 각 야간 배양의 0.5mL을 튜브당 0.5mL, 비이온 밀도 그라데이션 배지를 포함하는 개별 튜브로 전송하고, 소용돌이에 의해 용액을 짧게 혼합한다.셀 서스펜션을 개별, 자격을 갖춘 저수지 2 x 3 개의 우물로 전송합니다. 음향 액체 처리기 기기에 6RES_AQ_GPSA2 유체 교정 설정이 있는 csv 파일을 사용하여 YEPD agar 50mL를 포함하는 6144개의 웰 대상 마이크로플레이트에 적절한 자격을 갖춘 저수지 소스 플레이트에서 각 S.cerevisiae 변형의 25 나노리터를 발견한다. 모든 우물이 발견되면 마이크로 플레이트를 48 시간 동안 섭씨 30에서 배양하십시오.균주의 색상을 강화하려면 한천 판을 섭씨 4도에서 최소 72시간 동안 보관하십시오. 로잘린드 프랭클린의 사진이 접시에 나타났다. 입증된 바와 같이, 프로모터, 오픈 판독 프레임, 터미네이터 및 두 개의 연속적인 50bp 커넥터 시퀀스를 골든 게이트 복제 반응을 통해 발현 카세트로 조립하고 PCR에 의해 검증될 수 있다.PCR에 의한 단일 crRNA 어레이의 증폭 후, 단일 crRNA 어레이에 대한 수신자 플라스미드는 전기포고증에 의해 확인된 바와 같이 선형화된다. 멀티플렉스 게놈 편집의 효율은 변형 후 유색 식민지의 백분율에 의해 계산될 수 있으며, 의도된 게놈 DNA 위치에서 기증자 DNA의 통합을 확인하는 PCR 분석결과에 의해 계산될 수 있다. 예를 들어, 로잘린드 프랭클린의 흑백 사진에서 시작하여, 4가지 색상 사진과 스포팅 리스트가 만들어졌으며, 이는 음향 액체 처리기를 통해 한천 마이크로 플레이트에서 4개의 다른 효모 균주를 발견하는 데 사용되어 과학자의 고해상도 효모 페인팅을 초래했습니다.이러한 변환을 위해 갓 준비된 솔루션과 고품질의 DNA 단편을 사용하십시오. 이 방법은 또한 게놈 DNA로 정의된 삭제 및 점 돌연변이의 멀티플렉스 도입을 위해 적용될 수 있습니다. 또한 CRISPR 규정 실험을 수행할 수 있습니다.이 메서드는 배열 내에서 자유 crRNA 이상을 도입하여 동시 수정 횟수를 늘리기 위해 수정할 수 있습니다.

crisprcas12a-multiplex-genome-editing-saccharomyces-cerevisiae

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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