Name: 질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 배우세요 마우스 피부 각질 세포를 분리하고 금속 표지 항체로 염색하여 질량 세포 측정으로 세포 주기 특이적 단백질 발현을 분석하는 방법을. 40개 이상의 마커를 동시에 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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이 작품에 대한 지원은 피부과, 콜로라도 대학과 콜로라도 대학의 재생 의학을위한 게이츠 센터에서 왔다 (UC) 피부 질환 센터 형태학 및 표현형 코어 (NIAMS P30 AR057212). 저자는 UC 암 센터 유동 세포 측정 공유 자원 및 지원 보조금 (NCI P30 CA046934)을 인정질량 세포계의 작동에 대한 및 흐름과 질량 세포 측정에 대한 전문가의 조언에 대한 핵심 카렌 헬름과 크리스틴 어린이에 대한 감사 기술을.

콜로라도 안슈츠 대학 의과 대학' 기관 동물 관리 및 사용 위원회는이 프로토콜에 설명 된 동물 실험을 승인.
1. 준비
<ol><li>금속 태그가 지정된 항체 패널을 디자인합니다. 무료 온라인 패널 설계 소프트웨어(12)를 사용하고 127개의IododeoxyUridine(IdU), 164Dy(Dysprosium) 라벨이 부착된 안티 CCNB1(CYCLIN B1), 175Lu(루테리움) 인포(p)-HISTONEH3 Ser28(pHH3) 및 150을 포함합니다. Nd (네오디뮴)-pRETINOBLASTOMA 단백질Ser807/811 (pRB)13. 그들의 채널신호(14)에서겹치지 않는 추가금속 태그가 달린 항체를 추가한다.</li>
	<li>IdU 재고 솔루션을 준비합니다. IdU 분말을 60°C에서 0.1 N NaOH에서 10 mg/mL로 용해시면 됩니다. Aliquot IdU 스톡 솔루션을 미세 원심 분리튜브에 넣고 -20°C에서 동결하여 장기 보관합니다.<ol>
<li>사용하기 직전에 12 N HCl으로 IdU 용액의 pH를 7.5로 조정합니다. 용액이 pH 7.5에 있는지 확인하기 위해 폐기 aliquot에 pH 스트립으로 테스트합니다. 참고: pH 7.5에서 IdU의 장시간(>5분)은 강수량이 발생하고 이 경우 IdU의 새로운 aliquot가 필요합니다.</li>
		<li>적절한 개인 보호 장비(예: 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 사용하고 NaOH 또는 HCl 솔루션을 취급할 때 안전 캐비닛에서 작업하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2x 파라포름알데히드(PFA) 고정 용액을 준비한다. 5 mL의 10x PBS (pH 7.5) 및 1 mL의 1 mL 16% PFA와 44 mL의 순수 분자 등급 dH2O (3.2% 최종 농도)를 결합합니다. 참고 : PFA의 주식은 이전에 게시 된 대로 준비 할 수 있습니다15 또는 구매 16% 오염 금속무료 주식.<ol>
<li>PFA 분말 및 용액을 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 안전 캐비닛에서 작업하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL의 금속이 없는 10x PBS(pH 7.5)와 45 mL의 순수 분자 등급 dH2O를 결합하여 바륨(Ba2+)무료 1x PBS를 준비합니다. 참고: PBS 및 기타 시약의 품질은 질량 세포 측정 데이터를 분석하는 동안 배경 잡음을 유발할 수 있는 금속을 오염시키는 것을 방지하는 데 매우 중요합니다.</li>
	<li>100mM 시스플라틴 스톡 솔루션을 준비합니다. DMSO 10 mL에 시스플라틴 파우더 300.5 mg을 녹입니다. -80 °C에서 알리쿼트에 보관하십시오. 1d 이상 사용할 실험을 위해 10 mM cisplatin 작업 솔루션을 준비합니다.</li>
	<li>표피/진피 분리 솔루션을 준비합니다. HBSS 또는 PBS의 1 mL에 30 mg을 용해시켜 20x 디스파스 스톡 용액을 준비합니다. 0.22 μm 필터를 통해 필터를 살균하고 -20 °C에서 알리쿼트에 보관하십시오. HBSS에서 1 mg/mL로 1x 타입 IV 콜라게나아제 스톡 용액을 준비하고 0.22 μm 필터를 통해 필터를 살균하고 -20°C에 aliquots를 저장합니다.</li>
</ol>2. IdU 법인에 의한 S상 라벨링
<ol><li>마우스를 계량합니다. P1-P3 신생아 새끼 또는 8-10주 된 성인 마우스를 사용하고 C57BL/6, FvB 또는 129개의 배경에서 수컷 또는 암컷 마우스를 사용하십시오. 0.1 mg IdU (pH 7.5)/g 체중에서 복용량을 결정합니다. 예를 들어, 25g 마우스에는 0.25 mL의 IdU가 필요합니다.</li>
	<li>복강 내 주사에 의해 IdU의 복용량을 관리하고 세포를 수확하기 전에 2 시간 동안 기다립니다. 신생아 새끼 를 주입하는 결핵 주사기를 사용합니다. 참고: IdU의 2 mg/mL의 복용량은 대량 세포 측정을 위해 수확하고 라벨링하기 전에 37 °C에서 1 시간 배양된 조직 배양 세포와 함께 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 라벨링을위한 셀 의 격리
<ol><li>해동 디스파스 와 콜라게나제 스톡 솔루션. 멸균 HBSS 또는 PBS에서 20x 디스파스 스톡 용액을 1x(1.5 mg/mL)로 희석합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음을 유지하십시오.</li>
	<li>2부분량의 디스파스와 콜라게나아제 1부량을 총 부피로 결합하여 피부가 자유롭게 떠다닐 수 있도록 합니다. 예를 들어, 5개의 신생아 마우스 스킨의 소화는 100 mm 페트리 접시에 4 mL의 콜라게나아제와 함께 1x 디스파제의 8 mL에 떠있을 수 있습니다.</li>
	<li>실험 마우스를 안락사시키는 승인된 방법을 따르십시오 (예를 들어, 이소플루란 과다 복용 / 발가락 핀치 검사 또는 CO2 흡입 / 자궁 경부 탈구). 요오드 용액으로 성인 귀 피부를 청소하고 (재료 표참조) 분리 된 세포가 조직 배양에 사용될 때 멸균수로 헹구어 줍니다.</li>
	<li>외과적으로 기지에서 귀를 제거합니다 (그림1A). 분리된 세포가 조직 배양에 사용될 때 멸균 된 PBS에서 귀를 헹구는 다. 건조한 100mm 페트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>미세한 집게를 사용하여 절단 영역의 중간 또는 가장자리에 포켓을 만들고 두 개의 피부 플랩을 분리하여 후방 피부로부터 조심스럽게 앞쪽으로 분리합니다(그림 1B-D). 전방 및 후방 스킨을 모두 진행합니다. 참고 : 신생아 마우스 피부를 해부하는 자세한 지침은 Litchi et al.16에 의해 제공됩니다. 또한 해부 범위의 사용은 후방 피부에서 전방을 분리하고 해부된 표피 / 진피 면을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 피부: 머리카락은 표피 측에서 볼 수 있는 반면 진피는 젤라틴 모양을 갖습니다.</li>
	<li>디스파제/콜라게나아제 용액을 만지는 피부의 진피 면과 함께 귀의 전방 및 후방 피부를 조심스럽게 놓습니다(그림 1E). 12웰 배양 플레이트의 웰당 단일 귀의 전방 및 후방 피부 모두에 1 mL을 사용하십시오. 37°C에서 1시간 동안 배양, 1x 디스파제 용액에 16-18h.3 참고 : 세포가 배양 될 때 멸균 기술로 조직 배양 후드에서 작동합니다.</li>
	<li>깨끗한 페트리 접시의 표면에 닿는 표피 쪽으로 소화 된 피부를 놓습니다. 피부를 평평하게 하고 원형 패턴으로 중앙에서 가장자리까지 작업하여 표피에서 진피를 부드럽게 밀어 냅니다.</li>
	<li>진피를 버리거나 조직 배양 또는 분석을 위한 섬유아세포해방을 위해 더 소화한다16. 참고 : 진피의 외관이 어두워지고 젤라틴과 끈적 끈적한 구성이 있습니다. 진피는 쉽게 벗겨져야합니다. 진피 제거에 실패 또는 어려움은 부족한 조직 소화를 건의합니다. 그러나, 소화 버퍼에 있는 확장된 배양은 세포 생존을 감소시킬 것입니다. 표피는 페트리 접시에 남아 표백 된 모양을해야합니다.</li>
	<li>가장자리를 잡고 조심스럽게 표피를 들어 올리고 페트리 접시의 표면에서 벗깁니다. 미리 온난한 세포 분리 용액에 표를 조심스럽게 놓고 (재료 표참조) RT에서 37 °C 또는 20 분에서 5 분 동안 500 μL의 세포 분리 용액을 사용하여 12 웰 배양 판당 2 성인 귀 표피에 500 μL을 사용하고 750 μL의 세포 분리를 사용합니다. 6 웰 배양 판의 우물 당 하나의 신생아 표피에 대한 솔루션.</li>
	<li>멸균 집게를 사용하여 표피를 잡고 표피를 접시의 바닥에 드래그하여 세포를 해리합니다. 1% FBS (0.01 mL)를 포함하는 DMEM 의 1 mL을 추가하고 수집 튜브로 40 μm 세포 체를 통과합니다. DMEM 2 mL를 추가로 헹구고 셀 서스펜션에 추가하십시오.</li>
	<li>원심분리기는 120 x g에서 5 분 동안 조심스럽게 흡인합니다.</li>
	<li>1% FBS를 함유하는 DMEM의 1-2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단. Trypan Blue 및 혈세포계 또는 자동화 된 계수 장치를 사용하여 셀 및 % 라이브 셀 카운트를 결정합니다. 펠릿 세포는 단계 3.11에 기재된 바와 같이. 참고: 세포는 3.12단계 이후 적절한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다. 17세</li>
</ol>4. 살아있는 / 죽은 세포를 결정하는 시스 플라틴 라벨링
<ol><li>25 μM 시스플라틴(2.5 μL의 스톡/mL)을 함유한 DMEM 1mL당 1-3 x 10 6셀을 다시 일시 중단합니다. 1 분 동안 배양하고 동일한 부피의 FBS (예 : 1 mL)로 파이펫팅하여 담금질하십시오.</li>
	<li>120 x g에서 5 분 동안. 희석 표백제와 반전 튜브를 포함하는 비커에 120 x g의 원심 분리기를 종이 타월에 남은 용액을 배출합니다. 부드럽게 탭하여 튜브의 펠릿과 측벽에 남아 있는 용액을 해방시냅니다.</li>
	<li>Ba+2-free PBS 의 2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 펠릿 세포는 단계 4.2에 기재된 바와 같이. 참고 : 즉시 얼룩질 수없는 경우 세포를 수정하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>5. 시스플라틴 라벨 셀 의 고정 (선택 사항)
<ol><li>Ba+2-free PBS의 1 mL에서 1-3 x 106 시스플라틴 라벨 세포를 다시 일시 중단하십시오. 연속 저전력 하에서 와류 세포를 2x PFA 고정 버퍼의 드롭와이즈 1 mL(1 볼륨)을 추가합니다. 흔들 플랫폼에서 RT에서 10 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>펠렛 세포는 단계 4.2에 기재된 바와 같이, 500 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하였다.</li>
	<li>5.2단계에서 설명한바와 같이 2 mL의 Ba+2-free PBS 및 펠릿 셀로 세포를 세척하였다. 5.3단계를 한 번 반복합니다.</li>
	<li>바+2-free PBS의 2 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 4°C에서 <3 d. FBS를 3%(예: FBS/mL 셀의 0.3 mL)에 추가한 후 더 오래 저장하는 경우 >3d를 더 오래 보관한 다음 -80°C에서 혼합및 동결합니다. 참고: 고정은 특정 에피토프의 검출에 영향을 줄 수 있습니다. 항체 신호에 대한 고정의 효과는 경험적으로 결정될 필요가 있습니다.</li>
</ol>6. 샘플의 바코드 (선택 사항이지만 권장)
<ol><li>펠렛 셀은 5.2단계에서 설명한 대로 1x 고정 버퍼의 1 mL에서 1-3 x 106 셀을 다시 일시 중단합니다(재료 표참조). 5.2단계에서 설명한 바와 같이 RT에서 10분 동안 펠릿 세포를 배양하였다.</li>
	<li>바코드 투과 버퍼의 1 mL로 셀을 세척하십시오(재료 표참조). 5.2단계에서 기재된 바와 같이 펠릿 세포. 6.2단계를 한 번 반복합니다.</li>
	<li>바코드에 100 μL의 바코드 투과 버퍼를 추가하고(재료 표참조)18을 넣고 6.2단계의 셀이 펠릿화되는 동안 즉시 혼합합니다.</li>
	<li>바코드 투과 완충액의 800 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 5.2단계에서 설명한 바와 같이 셀에 바코드 솔루션을 추가하고 RT에서 30분 동안 혼합및 배양합니다. 세포 염색 완충제 2 mL에서 세포를 세척하고 다시 펠릿을 확인하십시오. 참고 : 최대 20 개의 샘플은 팔라듐 금속18의다양한 조합으로 표지 될 수 있습니다. 다른 바코드 전략은 다른곳에서 설명 15.</li>
</ol>7. 질량 세포 측정을 위한 세포의 표지
<ol><li>핵 항원 염색 완충액 의 1 mL에 1-3 x 106 세포를 다시 일시 중단하십시오 (재료 표참조). 바코드 된 샘플을 사용할 때 후속 단계를 위해 샘플을 단일 튜브로 결합하십시오. 5.2단계에서 설명한 바와 같이 RT에서 30분 동안 펠렛을 배양한다.</li>
	<li>핵 항원 염색 투과 완충액의 2 mL에서 1-3 x 106 세포를 다시 일시 중단하십시오 (재료 표참조). 필요에 따라 배율을 조정합니다. 예를 들어, 9 x 106 셀의 셀 카운트와 함께 10개의 결합된 샘플에 대해 6mL의 버퍼를 사용합니다. 5.2단계에서 설명한 바와 같이 펠릿.</li>
	<li>7.2단계를 반복합니다. 튜브에 남아있는 잔류 부피에서 세포 펠릿을 부드럽게 소용돌이치십시오.</li>
	<li>1-3 x 106 세포 당 세포 내 항체 칵테일 50 μL을 추가하십시오. 필요에 따라 배율을 조정합니다. 예를 들어, 9 x 106 세포의 세포 수와 10 결합 된 샘플에 대한 항체 칵테일의 150 μL을 사용합니다. 45 분 동안 RT에서 혼합하고 배양. 단계 5.2에 설명 된 바와 같이 세포 염색 완충제 및 펠릿의 2 mL를 추가합니다.</li>
	<li>세포 염색 완충액 2 mL에 1-3 x 106 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 5.2단계에서 기재된 바와 같이 펠릿 세포. 7.5단계를 한 번 반복합니다. 참고: 다른 완충액은 세포외 막 또는 세포질 마커염색에 사용될 수 있으며, 실험자는 다른 세포 위치에서 에피토프를 검출할 필요가 있는 경우 염색을 최적화해야 할 수 있습니다. 세포는 염색을 위해 살아있는 세포를 사용하는 경우 7.5 단계 후에 PFA에서 고정될 수 있습니다.</li>
	<li>인터칼레이션 용액 의 1 mL에 1-3 x 106 세포를 다시 중단하고 4 °C에서 1-3 d용으로 보관하십시오.<ol>
<li>세포가 인터칼레이션 용액에 있는 경우 5.2단계에서 설명한 바와 같이 펠릿 세포 >3 d. 펠렛 세포에 대한 용액을 포함하는 DMSO에서 -80°C에서 세포를 저장한다. 5.2단계에서 설명한 바와 같이 1 mL의 세포 염색 완충제 및 펠릿 세포에서 펠릿(1-3 x 106 세포)을 다시 중단시켰다. 10% DMSO/90% FBS19의1 mL에 펠릿을 다시 일시 중단하고, 극저온으로 옮기고, 이소프로판올 동결 용기에 넣고-80°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5.2단계에서 기재된 바와 같이 펠릿 세포. 1-3 x 106 세포를 2 mL의 세포 염색 완충액으로 씻어 내고, 5.2 단계에서 설명한 바와 같이 펠릿을. 5.2단계에서 설명한 대로 2 mL 의 물로 2개의 추가 세서를 수행합니다.</li>
	<li>희석 EQ 교정 비드 1:9 물에 (3.3 x 105 비드 / mL에서 재고 용액).</li>
	<li>희석 된 EQ 비드 용액으로 1 x 106 세포 / mL의 농도로 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 35 μm 스트레이너 캡 흐름 튜브를 통해 세포를 필터링합니다.</li>
	<li>질량 세포계에서 샘플을 실행하고 데이터를 수집합니다. 데이터는 유세포 분석 표준(FCS) 파일 형식으로 증착됩니다.</li>
</ol>8. 대량 세포 분석 데이터 파일 처리 및 분석
<ol><li>FCS 파일을 정규화합니다. https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20에서 사용할 수있는 무료 프로그램을 사용
</li>
	<li>Deconvolute 바코드 FCS 파일. 풀된 바코드 모집단을 별도의 바코드 파일로 분리하고 https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18에서 사용할 수 있는 무료 프로그램을 제공합니다.
</li>
	<li>정규화된 FCS 파일을 분석합니다. 상업용21,22 또는 프리웨어 프로그램을 사용합니다(web.stanford.edu/group/nolan/resources.html 참조).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 백서에 설명된 프로토콜은 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 최종 결과는 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현을 위해 분석될 수 있는 KC에서 농축된 세포의 현탁액이다. 몇몇 이전 연구 결과는 인간과 마우스 피부에서 PC를 격리하는 방법을 설명했습니다16,25. 이러한 연구는 또한 유세포분석26에 대한 CS의격리를 위한 프로토콜을 포함한다. 그러나, 상세한 프로토콜은 질량 세포 측정을 사용하여 단백질 발현 및 세포 주기 역학의 분석과 KC의 분리를 결합하는 이전에 기술되지 않았습니다.
이 프로토콜에서 고품질 결과를 얻는 가장 큰 장애물은 사용되는 라이브 셀의 품질입니다. 문헌에서, 표피/진피 분리에 대한 제안된 조건 및 효소는 크게 변화한다16,<sup class=...

세포 주기 단계와 유전자 발현의 상관관계는 암과 같은 과형성 질환의 동물 모델 분석에 여전히 도전과제로 남아 있다. 이 도전의 일부는 증식의 마커를 가진 관심있는 단백질 (POI)의 공동 검출입니다. 증식 세포는 G1, S, G2 및 M. Ki67을 포함한 다양한 세포 주기 단계에서 발견될 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 증식 마커 중 하나이며 세포 주기의 모든 단계에서 발현된다. 그것은 광범위하게 인간과 마우스 조직 모두의 분석에사용되어왔다 1,2,3. 그러나, 다른 일반적인 증식 마커 처럼, Ki67 개별 세포 주기 단계를 분별 하지 않습니다. 보다 정밀한 접근법은 브로모데독시우리딘(BrdU)과 같은 티미딘 뉴클레오티드 유사체를 게놈(즉, S상)을적극적으로 복제하는 세포에 4,5를사용합니다. 뉴클레오티드 유사체의 사용에 대한 한 가지 단점은 분석 하기 전에 살아있는 동물에 그들을 관리 하는 필요. Ki67 및 BrdU는 항체의 사용에 의해 고정된 조직 단면도에서 일반적으로 검출됩니다. 이 접근법의 한 가지 장점은 POI의 위치가 조직 아키텍처(예를 들어, 피부 표피의 기저층) 내에서 확인될 수 있다는 것입니다. 이 접근은 또한 유전자 발현에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있는 조직 해리를 요구하지 않습니다. 한 가지 단점은 OCT 동결 또는 파라핀 절편을 위한 조직의 조직 고정 또는 처리가 항체 표적(즉, 항원)을 폐색시킬 수 있다는 것이다. 항원의 검색은 전형적으로 열 또는 조직 소화를 요구합니다. 염색 강도의 정량화도 어려울 수 있습니다. 이는 염색, 단면 두께, 신호 감지 및 실험자 바이어스의 변화에 기인합니다. 또한 대부분의 일반적인 실험실 설정에서 제한된 수의 마커를 동시에 감지할 수 있습니다. 그러나, 새로운 멀티플렉스 염색 접근 방식은 이러한 한계를 극복할 것을 약속합니다. 예는 이미징 질량 세포 측정 및 티라 미드신호 증폭 6,7.
유세포측정은 증식 세포를 검출하는 또 다른 강력한 기술입니다. 그것은 동일 세포에 있는 마커의 다중 검출을 허용합니다 그러나 대부분의 비 조혈 세포 모형을 위한 조직 해리를 요구합니다. 증식 세포의 분석은 DNA를 결합하는 염료(예를 들어, 프로피듐 요오드화물(PI))의사용에 의해 일상적으로 수행된다 8. 유세포측정은 또한 BrdU 법인9의검출과 결합될 때 세포 주기 단계의 보다 정확한 측정을 허용한다. 강력한 접근 방식이지만 BrdU/PI 유동 세포측정은 단점이 있습니다. 위상 특이적 항체를 포함하지 않고는 G2/M 및 G0/G1 단계를 해결할 수 없습니다. 그러나, 사용될 수 있는 항체의 수는 세포 자가형광, 불소 방출의 스펙트럼 유출, 및 보상 제어의 사용에 의해 제한된다. 이 한계는 POI를 가진 세포 주기 마커의 표현을 공동 검출하기 위하여 더 도전적이고 힘든 표시합니다. 더 허구적인 접근법은 질량 세포 분석10,11을사용하는 것입니다. 이 기술은 더 좁은 검출 스펙트럼을 가진 금속 공액 항체를 사용합니다. 일단 세포가 금속 태그가 달린 항체로 염색되면 기화되고 세포 분석 시간(CyTOF) 질량 분석법에 의해 검출된 금속이 기화됩니다. 이러한 특성으로 인해 질량 세포 분석은 기존 플랫폼10,11을사용하여 >40 다른 마커의 멀티플렉스 검출을 가능하게 한다. 또한, 귀중한 항체를 절감하는 한편 시료 간 염색 가변성을 줄이는 금속으로 시료를 바코드화할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 질량 세포측정은 몇몇 단점이 있습니다. 비혈액 유래 세포에 대한 시판되는 금속 태그항체의 수가 제한되어 있다. 형광 DNA 염료 및 질량 세포측정의 사용에 비해 DNA 함량의 정량화는 형광 유동 세포측정에 비해 신호 검출의 감소된 동적 범위를 가지고 있다.
여기에서 기술된 프로토콜은 마우스 피부로부터 새로 단리된 각질세포(KC)로부터 세포 주기 역학을 분석하고 대량 세포분석기를 사용하여 이들 세포에서 세포 주기 특정 단백질 발현을 특성화하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 또한 배양된 세포와 함께 사용되거나 다른 세포 유형에 적응될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Cell Treat</td><td>229512</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator 솔루션</td><td>Fluidigm</td><td>201192A</td><td>125 &micro; M - Ir 인터칼레이터 용액</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>30525-89-4</td><td>16 %&nbsp; PFA</td></tr><tr><td>스트레이너 캡 플로우 튜브</td><td>Fisher/Corning</td><td>352235</td><td>35 &micro; M 모공 크기&nbsp;</td></tr><tr><td>세포체</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td>40 &mu; M 모공 크기&nbsp;</td></tr><tr><td>세포 제거 용액</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-ACCUTASE-100</td><td>Accutase</td></tr><tr><td>요오드 용액</td><td>ThermoFisher/Purdue</td><td>67618-151-17</td><td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td></tr><tr><td>바코드 투과화 완충액;</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Pd 바코드 키트</td></tr><tr><td>바코드</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Pd 바코드 키트</td></tr><tr><td>pH 스트립</td><td>EMD</td><td>9590</td><td>colorpHast</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Dulbecco' s Modified Eagle Media</td></tr><tr><td>파인 펜치</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-5-PO</td><td>Dumostar #5</td></tr><tr><td>곡선 정밀 집게</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-7-PO</td><td>Dumostar #7</td></tr><tr><td>보정 비드</td><td>Fluidigm 201078</td><td></td><td>EQ Four Element 보정 비드</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>Hank's Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>Water</td><td>Fisher</td><td>SH30538.03</td><td>Hyclone 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>물 요오도데옥시우리딘</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>I7125</td><td>IdU</td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>ThermoFisher</td><td>366656PK</td><td>내부 스레드</td></tr><tr><td>셀 염색 완충액</td><td>Fluidigm</td><td>201068</td><td>Maxpar 세포 염색 완충액</td></tr><tr><td>Fix & 펌 버퍼</td><td>Fluidigm</td><td>201067</td><td>Maxpar Fix & 펌 버퍼</td></tr><tr><td>Fix I 버퍼</td><td>Fluidigm</td><td>201065</td><td>Maxpar Fix I 버퍼</td></tr><tr><td>인산염 버퍼 식염수</td><td>Rockland</td><td>MB-008</td><td>금속 프리 10x PBS</td></tr><tr><td>이소프로판올 냉동 용기</td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>Mr.Frosty</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher</td><td>BP359-500</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Kord-Valmark</td><td>2900</td><td>Genesee 32-107에서 제공&nbsp;</td></tr><tr><td>15mL 원뿔</td>형 <td>Olympus/Genesee</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔</td>형 <td>Olympus/Genesee</td><td>28-106</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>세포 치료</td><td>제 229506</td><td></td></tr><tr><td>시스플라틴</td><td>Sigma</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>시그마/Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Fisher</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>핵 항원 염색&nbsp; 투과 완충액</td><td>Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>핵 항원 염색 완충액</td><td>Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>투베르쿨린 주사기</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>IV형 콜라겐분해효소&nbsp;</td><td>워딩턴 생명과학</td><td>CLSS-4</td><td></td></tr></tbody></table>

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

이 프로토콜의 목표는 마우스 피부의 표피로부터 단리된 단일 세포를 사용하여 세포 주기 의존적 방식으로 단백질 발현 변화를 검출하고 정량화하는 것이다. 7개의 중요한 단계가 있습니다: 진피에서 표피의 분리, 표피의 소화, 시스플라틴을 가진 표피 세포 집단의 염색, 견본 바코드, 세포 주기 마커 및 단백질을 위한 금속 태그가 붙은 항체를 가진 염색 관심, 질량 세포 분석에 의한 금속 태그 항체의 검출, 및 다양한 세포 주기 상에서발현의 분석. 조직학적 방법에 대한 이러한 접근법의 장점은 세포 주기의 상이한 단계에서 단일 세포에서 >40의 발현 패턴을 분석할 수 있는 가능성이다. 이 접근은 또한 조직학/화상 진찰 방법 보다는 더 정량화할 수 있는 단백질 발현의 다변량 상관 성 분석을 허용합니다. 이 프로토콜의 단점은 단일 세포의 현탁액이 필요하며, 이는 조직 섹션의 염색에 의해 제공되는 위치 정보의 손실을 초래한다는 것입니다. 이 접근법은 또한 조세포 현탁액에서 상이한 세포 유형을 식별하기 위해 추가 마커의 포함을 요구할 수 있다. 이 프로토콜의 적용은 과형성 피부 질환 모델의 분석에서 분명합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 계보 특이적 항체의 첨가에 의해 특정 하위 유형의 세포(예를 들어, 줄기 세포)의 분석을 위해 적응될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 다른 실험 종에서 피부 세포의 분석을 위해 적응될 수 있다.

표 1은 비병리학적 조건 하에서 성인마우스 귀 및 신생아 피부로부터의 예상 세포 수율 및 생존율을 나타낸다. 이 표에는 혼합 C57/126 배경에서 동물의 대표 데이터도 표시됩니다. 그것은 다른 균주의 피부가 유사한 세포 수율과 부채를 초래할 것으로 예상된다. 대략적인 수율은 피부의 표면적에 의존하며 신생아 피부가 더 많은 수의 세포를 필요로 하는 실험에 더 나은 선택이 될 것임을 나타냅니다(표 1). 낮은 수율 또는 감소된 생존율(&amp;50%) 피부 무결성을 감소 또는 세포 죽음의 유도 소화 또는 실험 조건 문제를 나타냅니다. 적절한 매체 및 보충제로 세포를 배양하면 KC 제제의 품질을 평가하는 데 도움이 될 수있다 17.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

이 프로토콜은 두 가지 주요 이유로 중요합니다. 제1, 사용자가 동물 모델으로부터 분리된 피부 세포의 세포 주기 상태를 확인할 수 있게 한다. 그것은 또한 우리가 세포 주기의 이산 단계에서 단백질 발현을 분석할 수 있게 합니다.세포 증식을 결정하는 이전 방법에 비해, 우리의 방법은 세포 주기에서 상이한 위상의 보다 정확한 측정을 허용하고, 우리는 또한 세포 분열의 다양한 단계에서 40 개 이상의 다른 마커를 분석 할 수 있습니다. 이렇게 하면 방법의 적용과 다재다능함이 크게 향상됩니다. 이 프로토콜은 암 연구와 세포 주기 특정 단백질 발현 패턴을 결정할 필요가 있는 질병의 그밖 모형에서 이용될 수 있습니다.또한, 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 다른 모델 유기체로 변형될 수 있다. 처음으로 사용자는 가능한 최고의 품질의 셀 준비를 얻는 데 집중해야합니다. 이를 위해서는 신선한 시약을 사용하여 실험적 피부를 적시에 처리하고, 최소한의 조직 소화 시간을 하며, 세포의 무결성과 양을 보존하기 위해 원심 분리 후 상체를 신중하게 폐기해야 합니다.먼저 원고에 설명된 대로 무료 온라인 패널 설계 소프트웨어를 사용하여 금속 태그가 지정된 항체 패널을 설계합니다. 그런 다음 IdU 분말을 밀리리터 당 10 밀리그램에서 0.1 섭씨 60도에서 수산화 나트륨을 용해하여 IdU 스톡 솔루션을 준비하십시오. IdU 스톡 솔루션을 미세 원심 분리튜브에 알리코팅한 후 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도에서 동결하십시오.사용 직전에 IdU 용액의 pH를 12개의 일반 염산으로 7.5로 조정하고, 폐기 된 알리쿼트에 pH 스트립으로 테스트하여 용액이 pH 7.5에 있는지 확인하십시오. 2개의 파라포멀데히드 고정 솔루션을 준비하려면 10x PBS5밀리리터와 16%PFA1밀리리터를 순수한 분자등급 증류수 44밀리리터와 결합합니다. 100 밀리몰라 시스플라틴 스톡 솔루션을 준비하려면 300.5 밀리그램의 Cisplatin 파우더를 DMSO 10 밀리리터에 녹입니다.실험이 하루 이상 사용되려면 10 밀리머 시스플라틴 작업 용액을 준비하십시오. 쥐를 무게 하 고 체중의 그램 당 IdU의 0.1 밀리 그램에서 복용량을 결정. 관면 주사에 의해 IDU의 계산된 복용량을 관리하고, 세포를 수확하기 전에 2 시간 동안 기다립니다.이전에 귀 기저에 IdU로 주입된 안락사 마우스의 귀를 외과적으로 제거하기 위해 한 쌍의 외과 적 등급 가위를 사용합니다. 100mm 페트리 접시에 귀를 놓습니다. 미세한 집게를 사용하여 앞쪽을 뒤쪽 피부와 조심스럽게 분리하여 절단 영역의 중간 또는 가장자리에 포켓을 만든 다음 두 개의 피부 플랩을 분리한 다음 전방 및 후방 스킨을 모두 진행합니다.한 귀의 전방 및 후방 스킨을 12웰 컬쳐 플레이트의 한 웰에 조심스럽게 놓고, 갓 준비된 디스파스/콜라게나제 용액 1밀리리터로 채워져 피부의 피부면이 용액을 만지고 있습니다. 피부를 소화하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 소화된 귀나 신생아 껍질을 깨끗한 페트리 접시에 놓고 표피 쪽이 접시 표면에 닿습니다.집게를 사용하여 피부를 평평하게 하고 중앙에서 가장자리까지 원형 패턴으로 작업하여 진피를 표피에서 부드럽게 밀어냅니다. 집게로 가장자리에 표피를 잡고 페트리 접시 표면에서 벗겨서 부드럽게 들어 올립니다. 미리 데운 세포 분리 용액에 표피를 접시의 한 웰에 조심스럽게 놓습니다.섭씨 37도에서 5분 또는 실온에서 20분 간 배양하세요. 멸균 집게를 사용하여 표피를 사용하여 표피를 접시 바닥에 드래그하여 세포를 분리합니다. 1%FBS를 함유한 DMEM 1밀리리터를 추가하고 40마이크로미터 셀 체를 수집 튜브에 전달합니다.DMEM의 추가 2 밀리리터와 잘 헹구고 세포 현탁액에 추가합니다. 원심 분리 후 5 분 동안 120 배 g에서 조심스럽게 슈퍼 나탄을 흡인합니다. 1%FBS를 포함하는 DMEM의 1~ 2밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 이전과 같이 세포를 다시 펠릿.살아있는 세포와 죽은 세포를 결정하기 위하여 세포를 레이블을 붙이려면, 25 마이크로 몰라 시스플라틴을 포함하는 DMEM의 1 밀리리터에 있는 1-3 백만 세포를 재중단하고 1 분 동안 배양합니다. 동일한 볼륨의 FBS로 파이펫팅하여 담금질합니다. 5 분 동안 120 배 g에서 원심 분리 한 후, 희석 된 표백제를 포함하는 비커에 상체를 데칭하고, 나머지 용액을 종이 타월에 배출하기 위해 튜브를 반전시십시오.바륨 양이온이 없는 PBS의 2밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 이전에 설명한 대로 다시 원심분리기. 세포를 고치려면, 바륨 양이온이 없는 PBS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 연속 저전력 하에서 세포를 소용돌이치고 두 x PFA 고정 버퍼 드롭 와이즈의 1 밀리리터를 추가합니다.흔들 기 플랫폼에 놓고 10 분 동안 실온에서 배양하십시오. 5분 동안 500배 g에서 원심분리한 후, 상퍼를 주의 깊게 절개합니다. 동일한 조건에서 다시 원심분리기의 2 밀리리터로 세포를 세척하고 세척 단계를 반복합니다.마지막으로, 바륨 양이온이 없는 PBS의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리하고 신중하게 상체를 데칭합니다. 1x 고정 버퍼의 1밀리리터로 셀을 다시 중단하고 실온에서 10분 동안 배양하고 원심분리를 반복합니다.셀을 세척하려면 바코드 permeabilization 버퍼1 밀리리터를 추가합니다. 셀 원심 분리 시 5분간 500배g의 세포 원심분리를 통해 바코드 투과화 버퍼 100마이크로리터를 추가하여 바코드를 준비하고 즉시 섞는다. 바코드 투과화 버퍼의 800 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.바코드 솔루션을 셀에 추가하고 실온에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다. 5분간 500배 g의 원심분리기. 세포 염색 완충제와 원심분리기의 2밀리리터로 세포를 다시 세척합니다.다음으로, 핵 항원 염색 완충액의 1밀리리터에서 1~300만 개의 세포를 재중단하고 실온에서 30분 동안 배양한다. 5분 동안 500배 g에서 원심분리한 후, 상퍼를 주의 깊게 절개합니다. 핵 항원 염색 충류 완충및 원심분리기의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.반복 반복 반복 된 현탁액 및 원심 분리 후, 부드러운 소용돌이와 잔류 볼륨의 세포 펠릿을 다시 중단. 셀룰러 내 항체 칵테일 50마이크로리터를 실내 온도에서 45분간 혼합하고 배양합니다. 셀 염색 버퍼 2밀리리터를 추가합니다.원심분리기는 이전 단계와 동일한 조건에서 다시 원심분리기를 제거하고 상체를 제거합니다. 셀 염색 완충제의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 원심분리기는 5분 동안 500배 g로, 재연 및 원심분리를 반복한다. 인터컬레이션 용액의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 섭씨 4도에서 1~3일 동안 보관하십시오.세포를 원심분리한 후, 동일한 조건하에서 두 밀리리터의 세포 염색 완충제, 원심분리기로 펠릿을 세척하고, 동일한 원심분리와 함께 2밀리리터의 물로 2개의 추가 세척을 수행한다. 희석 된 EQ 비드 용액으로 밀리리터 당 백만 세포의 농도로 세포 펠릿을 다시 중단 한 다음 질량 세포계에서 샘플을 실행합니다. 성인 마우스 귀와 신생아 피부에서 예상되는 세포 수율 및 생존능력이 결정됩니다.대략적인 수율은 피부의 표면적에 따라 달라집니다. 신생아 피부는 세포의 더 큰 수를 필요로 하는 실험에 대 한 더 나은 선택. 바코드 질량 세포측정 데이터의 정규화 및 절충볼루션 후, 그대로, 단일 및 실행 가능한 셀을 선택하는 기본 게이팅 전략이 표시됩니다.실행 가능한 세포의 백분율은 염색하기 전에 세포의 품질 또는 상태를 나타낼 수 있습니다. 배양된 암종 세포와 분리된 마우스 이어 셀 간의 생존가능성에 대한 차이도 나타난다. 실행 가능한 세포는 조혈 세포를 제외하기 위하여 CD45 대 이벤트 길이에 문지였습니다.리니지 마커의 포함은 다른 세포 주기 단계에 관심있는 세포 집단의 선택을 허용합니다. 기본 세포 주기 프로파일은 형광계 유동 세포측정에서 BRdU 대 PI의 검출에 의해 얻어진다. 그러나, 질량 세포종을 가진 그밖 증식 마커의 포함은, 세포 주기 단계의 더 정확한 확인을 허용합니다.이러한 접근법에 따라, 세포 주기 프로파일은 동일한 실험에서 CD45 음성 대 CD45 양성 세포에 대한 프로파일과 같은 상이한 세포 유형 또는 실험 조건에 대해 구성될 수 있다. 또 다른 예에서, G-1 단계에서 EGFR 및 mTOR PI3K 신호 경로를 정의하는 마커의 분석은, 파란색으로 표시된 주황색 및 CD45 양성 세포에 도시된 CD45 음성 세포에서 유사한 발현 프로파일을 드러냈다. 질량 세포측정은 고품질 의 세포를 많이 필요로한다.사용자가 희귀 세포 집단에 관심이 있는 경우 더 많은 셀 수가 필요할 수 있습니다. 고립 된 살아있는 세포는 DNA 또는 RNA 분석, 생화학 연구에 사용될 수 있거나 대량 세포 측정을 위한 고정 및 염색 전에 조직 배양에 사용될 수 있다. 사용자는 파라포름알데히드, 염산 또는 수산화나트륨과 함께 작업할 때 필요한 경우 개인 보호 장비와 안전 캐비닛을 사용해야 합니다.

isolation-staining-mouse-skin-keratinocytes-for-cell-cycle-specific

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

발암 성 암 세포와 암 미세 환경 사이의 상호 작용을 포함하는 프로세스입니다. 분자 이벤트를 해부 한 암을 개발하는 동안 여러 단계에서 서로 다른 세포 집단을 분리해야합니다. 기저 세포 암종에 대한 마우스 모델을 사용하여, 우리는 발암 동안 세포 분석을위한 프로토콜을 설명합니다.

세포 인구 분석 피부 발암 중

피부는 복잡한 면역 세포 네트워크의 본거지입니다. 우리는 단일 세포 현탁액을 얻고 유세포 분석을 통해 피부에 거주하는 다양한 백혈구 집단을 분석하기 위해 동물의 신체의 여러 부분에서 마우스 피부를 소화하기 위한 효율적인 방법론을 설명합니다.

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

이 프로토콜은 영양이 풍부한 배지에서 마우스 피부의 효소 분해 후 백혈구를 분리하기 위한 구배 분리를 설명합니다.  이렇게 파생된 세포는 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 조직 해리 기계와 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 조직 소화 프로토콜에 대한 효과적이고 경제적이며 개선된 대안입니다.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

성체 줄기세포 생물학을 연구하기 위한 이상적인 모델은 쥐의 모낭입니다. 여기에서는 모낭, 줄기세포 및 표피 각질세포의 다양한 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시하며, 쥐 등쪽 피부의 효소 분해와 FACS 분석을 사용합니다.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

이 문서에서는 질량 세포 분석을 위한 샘플 수집 및 처리에 대해 설명합니다.

대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

이 프로토콜의 목표는 분자 생물학, 생화학, 형광 활성화 세포 선별 및 1 차 체외 용도 (예를 들어, 클로노겐성)와 같은 다양한 다운스트림 응용 을 위해 성인 마우스의 등쪽 피부로부터 표피 각질 세포를 분리하는 것입니다. 각질 세포).

마우스 표피 각질 세포와 체외 클로노겐 문화의 격리

클로날 팽창은 항원 특이적 T 세포 반응의 주요 특징이다. 그러나, 항원 반응 T 세포의 세포 주기는 기술적인 한계 때문에 부분적으로, 제대로 조사되었습니다. 우리는 예방 접종 마우스의 비장 및 림프절에서 복제 확장 항원 특정 CD8 T 세포를 분석하는 유동 세포 측정 방법을 설명합니다.

예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석

여기에 제시된 것은 뉴클레아제를 사용한 표적 절단 및 방출에 의한 근육 섬유의 전사 조절 연구에 적합한 마우스 사지 근육 위성 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분리를 위한 효율적인 프로토콜입니다(CUT&amp;RUN).

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&amp;RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

우리는 마우스 흉선 상피 세포의 단일 세포 현탁액 준비 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells (마우스 흉선 상피 세포의 단세포 현탁액 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색)

배우세요 마우스 피부 각질 세포를 분리하고 금속 표지 항체로 염색하여 질량 세포 측정으로 세포 주기 특이적 단백질 발현을 분석하는 방법을. 40개 이상의 마커를 동시에 정밀하게 분석할 수 있습니다.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

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