Name: 대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3D 광학 일관성 단층 촬영 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 배우세요 자동화된 3D OCT 시스템을 이용하여 대규모 공간 스케일에서 미생물 생물막의 형태 형성을 비침습적으로 모니터링하는 방법을. 이 기술은 생물막 발달과 미생물 생태학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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마우리시오 아구에르 모랄레스가 이 시스템 개발에 기여한 것에 대해 감사드립니다.  재정 지원은 스위스 국립 과학 재단에서 T.J.B에 왔습니다.

1. 위치 지정 장치 설정
<ol><li>https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl 지시에 따라 위치 장치를 마이크로 컨트롤러 보드에 연결합니다.</li>
	<li>USB 케이블을 통해 인터넷에 연결되는 단일 보드 컴퓨터에 마이크로 컨트롤러를 연결하고 https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git 설명된 대로 GRBL 서버를 설치합니다. 이제 위치 지정 장치는 http://IP:5020/ 호스팅되는 웹 페이지에서 탐색할 수 있어야 합니다. 또는, 포지셔닝 디바이스는 파이썬 스크립트로 탐색할 수있으며, 작업된 예제 ImagesAcquisition.ipynb(보충 파일 2)의 첫 번째 부분에서 설명한 바와 같이.</li>
</ol>2. 10월 설정
<ol><li>호환되는 비둘기 꼬리 홀더를 사용하여 OCT 프로브를 포지셔닝 장치에 장착합니다. 필요한 경우 대물 렌즈에 침지 어댑터를 설치합니다.</li>
	<li>컴퓨터 및 OCT 베이스 유닛을 실험 옆에 있는 벤치에 배치합니다(예: 미세 유체 장치, 유량 챔버, 수로, 여과 시스템). 광학 코드(최대 길이 약 1.8m)가 자유롭게 움직여 모든 의도한 위치에 도달할 수 있고 실험 설정을 방해하지 않도록 하십시오.</li>
	<li>제조업체에서 설명한 대로 사용 가능한 소프트웨어와 함께 OCT 시스템을 설치합니다.</li>
	<li>https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 설명된 대로 자동화된 OCT 스캔 수집을 위해 소프트웨어 패키지를 설치합니다.</li>
</ol>3. 이미지 획득
<ol><li>OCT 시스템과 포지셔닝 장치의 전원. 장치가 자유롭게 이동할 수 있는지 확인합니다.</li>
	<li>텍스트 편집기에서 파일 config.json을 엽니다. config.json 파일을 편집하여 기본 이미지 수집매개변수(표 2)를 조정하여 굴절률(20°C의 물1.33, 공기의 경우 1.00)과 획득한 데이터 및 메타데이터의 대상 폴더를 조정합니다.</li>
	<li>config.json에서뷰 필드(FOV)의 크기와 B 스캔당 A-스캔 수를 정의합니다. 참고: 이 두 매개변수는 최종 데이터 집합의 복셀 크기와 출력 파일의 크기를 결정하며 프로브의 광학 해상도와 일치해야 합니다(x-y 복셀 크기는 광학 해상도의 절반보다 작아야 합니다). A- 및 B 스캔의 수는 사용 가능한 디스크 공간 및 처리 기능에 대해 어떤 장단점을 다루는 공간 범위에 영향을 줍니다.</li>
	<li>config.json에서출력 OCT 스캔의 신호 경계를 정의합니다. 이들은 견본의 모형에 달려 있습니다. 따라서 예비 검사 세트의 강도 히스토그램을 기반으로 이러한 매개 변수를 결정하는 것이 좋습니다. config.json의변경 내용을 저장합니다.</li>
	<li>OCT 프로브를 관심 사이트로 이동합니다. 최적의 이미지 품질을 위해 샘플에 초점을 맞추고 기준 암 및 광원 강도를 조정합니다. 여러 위치에 대해 이 절차를 반복하고 좌표를 기록합니다. 참고: 이렇게 하면 이러한 참조 점 주위에 후속 자동 OCT 스캔 수집이 허용됩니다. 자동 이미지 수집 중에는 참조 암 길이와 강도를 변경할 수 없습니다.</li>
	<li>Juypter 노트북에서 ImageAcquisition.ipynb 파일(보조파일2)을 엽니다. 각 셀에는 특정 작업을 수행하는 코드가 포함되어 있으며 셀 을 눌러 별도로 실행할 수 있습니다 | 실행, 또는 Ctrl + 입력 또는 이동 + 입력.<ol>
<li>필요한 라이브러리와 기본 구성 매개 변수로 경로를 설정합니다. 또는 임시 매개 변수의 새 집합을 정의합니다.
</li>
		<li>위치 지정 장치에 연결하고 OCT를 초기화합니다.</li>
		<li>포지셔닝 장치를 보정합니다(즉, "호밍"을 수행). </li>
		<li>단일 스캔 또는 모자이크 패턴의 관심 위치를 포함하는 데이터 집합을 획득하여 숫자와 겹침(예:., 30%)을 지정합니다. 이웃 타일의. 참고: 컴퓨터 리소스 사용을 최적화하는 검색 전에 메모리가 할당됩니다. 데이터는 저장 공간을 저장하기 위해 8비트 *.raw 형식으로 저장되며, 타임스탬프와 명명 규칙(즉, %Y%m%m%M%M%M%M%S_&amp;lt&amp;lt&amp;t;위치&gt;)을 사용하여 config.json에정의된 대상 폴더에 저장됩니다. OCT 설정 및 좌표를 포함한 메타데이터는 동일한 명명 규칙이 있는 *.srm 파일의 동일한 폴더에 저장됩니다. FOV 및 해상도와 같은 설정에 따라 파일 크기는 OCT 스캔당 최대 1.5GB에 도달할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 수집을 방지하려면 충분한 사용 가사용 디스크 공간이 있는지 확인하거나 OCT 데이터 집합을 외장 하드 드라이브로 지속적으로 이동해야 합니다.</li>
</ol>4. 이미지 보정 및 디스플레이
<ol><li>OCT 이미지 처리(왜곡 보정, 배경 빼기, 고도 맵 계산, 고도 맵 스티치)의 작업 예에 대해 Jupyter 노트북 ImageProcessing.ipynb(보조 파일1)을 엽니다.</li>
	<li>필요한 경우 스퓨리어스 신호를 배제하고 데이터 집합의 방향을 재조정하기 위해 OCT 를 자르십시오(생물막은 지층 위에 나타나야 합니다).</li>
	<li>구면 수차에 적합합니다. 이것은 평평한 것으로 알려진 고반사 기준 표면을 활용하는 보정 알고리즘에 의해 달성됩니다 (예를 들어, 수로의 바닥, 지층). 첫째, 알고리즘은 OCT 스캔의 xy 평면에 걸쳐 정기적으로 간격을 두는 20×20개의 수직 선 그리드를 정의합니다. 그런 다음, 각 점 주위의 원형 영역을 선택하고 수직 프로파일을따라 신호 강도를 평균화합니다(도 2B). 수직 프로파일은 수정된 가우시안 필터로 처리됩니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59356/59356eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> 여기서 x는 입력 신호이고 표준 편차를 σ로, C는 다음과 같이 결정됩니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59356/59356eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> 참조 서피스는 이러한 각 프로파일에서 로컬 최대값으로 지역화됩니다. 잘못 식별된 점은 3차원으로 이웃의 위치에 따라 필터링됩니다(그림2C). 마지막으로, 스캔 렌즈에 의해 도입된 왜곡을 반영하는 2차 다항식 표면이 이러한 점에 걸쳐 장착된다(도2C). 그런 다음 장착된 표면을 사용하여 각 픽셀을 z 방향으로 이동하여 평평한 이미지를 얻습니다. 이 알고리즘의 매개 변수는 OCT 스캔의 특성에 맞게 조정되어야 합니다.</li>
	<li>배경 소음에 대 한 수정. 이미지의 빈 영역(일반적으로 생물막 위)을 식별하고 보정 알고리즘을 사용하여 이미지의 강도 값에서 평균 배경 강도를 빼서최종 수정된 OCT 이미지를 생성합니다(그림 2D).</li>
	<li>3D OCT 데이터 집합에서 입면 맵을 계산합니다. 이 단계에서는 특정 실험(예를 들어, 지층)에 대한 관심 있는 기준 표면과 적절한 임계 강도를 정의합니다. 그런 다음 입면 맵 계산 알고리즘을 사용하여 이진 마스크의 각 좌표(x,y)에 대한 생물막의두께를 계산하고 이를 새 2D 행렬에 할당합니다(그림 3A). 그런 다음 두께 값이 x 및 y 방향으로 원본 이미지 크기의 2D 행렬에 할당됩니다. 지표면의 표고가 그레이스케일 값으로 보고되는 이미지가렌더링됩니다(그림 3B).</li>
	<li>여러 OCT 스캔이 모자이크 패턴으로 수행되는 경우 행과 열 의 수를 정의하고 각 입면 맵을 스티치합니다. 그림 5는 설명된 설정으로 달성 가능한 광범위한 공간 스케일 및 해상도를 포함하는 스티치된 고도 맵의 예를 제시합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature reviews. Microbiology. 14, 563(2016).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillation+characteristics+of+biofilm+streamers+in+turbulent+flowing+water+as+related+to+drag+and+pressure+drop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop.</a> Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+migratory+ripples+in+a+mixed+species+bacterial+biofilm+growing+in+turbulent+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow.</a> Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).</li>
<li>Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Natural+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).</li>
<li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Microbiology. 14, 251-263 (2016).</li>
<li>Battin, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+landscapes%3A+new+paths+to+biofilm+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial landscapes: new paths to biofilm research.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).</li>
<li>Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+coherence+microscopy+for+the+in+situ+investigation+of+the+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm.</a> J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002(2016).</li>
<li>Wagner, M., Horn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+in+biofilm+research%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography.</a> Science. 254, 1178-1181 (1991).</li>
<li>Haisch, C., Niessner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+transient+processes+in+biofilms+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography.</a> Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).</li>
<li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+W+%22Optical+Coherence+Tomography%3A+Technology+and+Applications%22">Optical Coherence Tomography: Technology and Applications</a>. , Springer Verlag. (2008).</li>
<li>Fercher, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+%E2%80%93+development%2C+principles%2C+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Medizinische+Physik%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography – development, principles, applications.</a> Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).</li>
<li>Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+speed+spectral-domain+optical+coherence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy.</a> Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).</li>
<li>Fortunato, L., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+biofouling+assessment+in+spacer+filled+channels+using+optical+coherence+tomography+%28OCT%29%3A+3D+biofilm+thickness+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping.</a> Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
<li>Roche, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benthic+biofilm+controls+on+fine+particle+dynamics+in+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams.</a> Water Resources. 53, 222-236 (2016).</li>
<li>Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approach+to+characterize+fouling+on+a+flat+sheet+membrane+gravity+driven+submerged+membrane+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor.</a> Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).</li>
<li>Morgenroth, E., Milferstedt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+engineering%3A+linking+biofilm+development+at+different+length+and+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Environmental+Science+and+Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales.</a> Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).</li>
</ol>

세바스찬 셰퍼는 Thorlabs Inc.에서 근무하고 있습니다.

OCT 이미징은 수 제곱 밀리미터의 FOV로 마이크로미터 범위의 구조를 해결하는 데 적합합니다. 따라서 생물막 연구를 위한 강력한 도구10,18. 그러나 OCT는 현재 최대 스캔 면적이 100- 256 mm2로 제한되어 있으며, 생물막 구조 패턴은 종종 이 공간 스케일19를초과하는 반면, 특히 형태학적 차별화가 대규모 환경 그라데이션에 의해 구동되는 경우 20. 이 프로토콜에 설명된 자동화된 OCT 이미징 시스템은 OCT를 특징으로 하는 표면적을 몇 평방 센티미터까지 확장하여 관련 공간 스케일 범위에서 생물막 형태학적 분화를 효과적으로 모니터링할 수 있게 합니다. (몇 밀리미터에서 몇 센티미터까지). 높은 포지셔닝 정확도(16 μm 이내; 그림5) 장시간 생물막의 구조...

생물막은 매우 성공적인 미생물 라이프 스타일 적응이며, 이러한 상간 관련 미생물의 매트릭스 동봉 된 지역사회는 자연 및 산업 설정에서 미생물 의 삶을 지배 1,2. 거기서, 생물막은 길쭉한 스트리머 3,리플4 또는 버섯형 캡5와 같은 복잡한 구조를 형성하며 생물막 성장, 구조적 안정성 및스트레스에대한 저항성 6. 생물막 구조화에 관한 많은 것들이 미니어처 플로우 챔버에서 자란 모노종 문화에 대한 작업에서 배웠지만, 대부분의 생물막은 종종 생명의 모든 영역의 구성원을 포함하는 매우 복잡한 공동체이다6. 이러한 복잡한 생물막을 미생물 풍경 7로 이해하고 복잡한 지역 사회에서 생물막 구조와 기능이 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 것이 생물막 연구의 최전선에 있습니다.
환경 단서에 반응하여 복잡한 생물막의 형태 형성에 대한 기계적 이해는 관련 에 걸쳐 생물막 물리적 구조의 공간적 및 시간적으로 해결 된 관찰과 함께 신중하게 설계된 실험을 필요로합니다. 저울8. 그러나, 실험 시스템에서 생물막 성장의 비파괴적 관찰은 섬세한 생물막 구조를 손상시키는 시료(예를 들어, 현미경)를 이동시킬 필요성과 같은 물류 제약에 의해 심각하게 제한되고 있다.
여기에 제시된 프로토콜은 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 기초한 완전 자동화 된 시스템을 소개하며, 이는 메조 스케일 (mm 범위)에서 생물막 형태 형성의 현장, 비 침습적 모니터링을 허용합니다. OCT는 수처리 및 바이오폴링 연구, 의학9 및 스트림 생태학10에응용된 생물막 연구에서 새로운 이미징 기술입니다. OCT에서, 낮은 일관성 광원은 샘플 및 참조 암으로 분할된다; 생물막(샘플 암)에 의해 반사되고 산란된 빛의 간섭과 기준 암의 빛을 분석한다. 깊이 해결된 구조 정보가 포함된 일련의 축 강도 프로파일(A-스캔)을 획득하여 B 스캔(단면)으로 병합합니다. 일련의 인접한 B-스캔은 최종 3D 볼륨 스캔10을구성합니다. OCT는 약 10 μm의 범위에서 측면 광학 분해능을 제공하므로 생물막10,12의중피 구조적 분화를 연구하는 데 적합합니다. OCT에 대한 자세한 설명은 드렉슬러와 후지모토13,퍼처 및 동료14를참조하십시오. 단일 OCT xy-scan의 시야가 수백 평방 마이크로미터에 도달하지만 단일 스캔에서 OCT를 통해 대규모 패턴을 정량화할 수 없습니다. 하천과 같은 자연 서식지의 생물막과 관련하여, 현재 는 서식지의 물리적 및 유압 템플릿과 일치하는 스케일에서 생물막 형태 형성을 평가하는 능력을 제한합니다.
이러한 공간 한계를 뛰어넘고 OCT 스캔을 자동으로 획득하기 위해 스펙트럼 도메인 OCT 이미징 프로브를 3축 포지셔닝 시스템에 장착했습니다. 설치는 중첩 모자이크 패턴 (타일 스캔)에서 여러 OCT 스캔을 수집하여 최대 100cm 2까지 표면적의 단장 촬영 이미징을 효과적으로 달성 할 수 있습니다. 또한, 이 시스템의 높은 포지셔닝 정밀도를 통해 장기 실험 중에 특정 부위의 생물막 기능의 성장과 개발을 안정적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 시스템은 모듈식이며 설치의 개별 구성 요소(즉, 위치 지정 장치 및 OCT)는 독립형 솔루션으로 사용하거나 유연하게 결합할 수 있습니다. 그림 1은 설치의 하드 및 소프트웨어 구성 요소에 대한 개요를 제공합니다.
이 시스템은 시판되는 GRBL 제어 CNC 포지셔닝 장치(재료 표)로 시험하였다. 이 특정 포지셔닝 플랫폼의 작동 거리는 600×840×140mm이며, 제조업체가 표시한 정확도 +/- 0.05 mm, 프로그래밍 가능한 해상도0.005mm. GRBL은 CNC용 오픈 소스(GPLv3 License), 고성능 모션 컨트롤입니다. 장치. 따라서 모든 GRBL 기반(버전 > 1.1) 포지셔닝 장치는 여기에 제시된 지침 및 소프트웨어 패키지와 호환되어야 합니다. 또한, 소프트웨어는 몇 가지 수정과 STEP-DIR 입력 유형과 다른 스텝 모터 컨트롤러에 적응 할 수있다.
시스템의 성능을 평가하는 데 사용되는 OCT장치(재료 표)는 중심 파장이 930nm(대역폭 = 160nm)의 낮은 일관성 광원을 특징으로 하며, 조정 가능한 기준 암 길이 및 강도가 있습니다. 여기에 제시된 예에서, OCT 프로브를 흐르는 물에 담그는 침지 어댑터(표오브 머티리얼)도사용되었다. 자동화된 OCT 스캔 수집을 위해 여기에서 개발된 소프트웨어 패키지는 특정 OCT 시스템과 함께 제공되는 SDK에 따라 크게 달라지지만, 다른 스캔 렌즈와 중앙 파장이 있는 동일한 제조업체의 OCT 시스템은 쉽게 호환됩니다.
GRBL 장치는 단일 보드 컴퓨터에 설치된 웹 서버에 의해제어됩니다(그림 1). 이렇게 하면 로컬 네트워크 또는 인터넷 액세스가 있는 모든 컴퓨터에서 장치를 원격으로 제어할 수 있습니다. OCT 장치는 별도의 컴퓨터에 의해 제어되므로 자동화된 실험 설정을 제외하고 OCT 시스템의 작동이 가능합니다. 마지막으로, 소프트웨어 패키지에는 OCT 프로브 포지셔닝 및 OCT 스캔 수집을 동기화하는 라이브러리가 포함됩니다(즉, 모자이크 패턴 또는 정의된 위치 집합에서 3D 이미징 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위해). OCT 프로브의 위치를 3D로 효과적으로 정의하면 (지역) 스캔 세트에 맞게 초점 평면을 조정할 수 있습니다. 특히 고르지 않은 표면에서 각 OCT 스캔에 대해 서로 다른 초점 평면(즉, z 방향으로 다른 위치)을 지정할 수 있습니다.
원시 OCT 스캔을 처리하기 위해 소프트웨어 패키지집합이 개발되었습니다(표 1). 포지셔닝 디바이스의 탐색, OCT 스캔 수집 및 데이터 세트 처리는 파이썬 코딩 된 Jupyter 노트북으로 수행되어 소프트웨어의 개발 및 최적화에 있어 뛰어난 유연성을 제공합니다. 이러한 노트북의 두 가지 작업 및 추가 된 예제 (이미지 수집 및 처리에 대 한) 사용할 수 https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 그들은 사용자 지정에 대 한 시작 점으로 의도 메서드의. Jupyter 노트북은 추가 된 파이썬 코드가있는 셀을 포함하는 웹 브라우저 기반 응용 프로그램입니다. 각 단계는 노트북의 셀에 포함되어 있으며, 별도로 실행할 수 있습니다. 스캔 렌즈(구면 수차)(15)를 통해 광 경로의길이가 상이하기 때문에, 원시 OCT 스캔이 왜곡된 것처럼 보인다(도2A). 우리는 획득 한 OCT 스캔에서이 왜곡을 자동으로 수정하는 알고리즘을 개발했습니다 (ImageProcessing.ipynb, 보충 파일1). 또한, 생물막 형태는 이전에 멤브레인 시스템16에서사용되었던 것처럼 2D 고도 맵으로 시각화될 수 있으며, 타일링 배열에서 가져온 스캔에서 얻은 고도 맵이 어떻게 스티치될 수 있는지 설명합니다.
마지막으로, 설명된 실험실 설치의 기능은 광영양 스트림 생물막이 유속의 구배에 노출되는 수로 실험을 사용하여 설명됩니다.

<table><tbody><tr><td>OCT 프로브</td><td>Thorlabs</td><td>GAN210C1</td><td>OCT 이미징 장치</td></tr><tr><td>OCT 스캔 렌즈</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>OCT-LK3-BB</td><td></td></tr><tr><td>잠수 어댑터</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>OCT-IMM3-SP1</td><td></td></tr><tr><td>Stepcraft 840 CK</td><td>STEPCRAFT</td><td>NA</td><td>포지셔닝 장치</td></tr><tr><td>마이크로 컨트롤러</td><td>Arduino Uno R3</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>단일 보드 컴퓨터</td><td>Raspberry PI</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Canon EOS 7D Mark II</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>카메라 렌즈</td><td>Canon MACRO EFS 35mm</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3d 광학 일관성 단층 촬영

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

바이오필름은 가장 성공적인 미생물 라이프스타일이며 다양한 환경 및 엔지니어링 환경에서 우세합니다. 공동체 조립 중에 생물막의 구조적 다각화인 생물막 형태 형성을 이해하는 것은 공간적 및 시간적 비늘 전반에 걸친 놀라운 도전과제입니다. 여기에서, 우리는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 근거를 둔 자동화한 생물막 화상 진찰 시스템을 제시합니다. OCT는 생물막 연구에서 새롭게 떠오르는 이미징 기술입니다. 그러나 현재 획득 및 처리할 수 있는 데이터의 양은 생물막 형태학에서 대규모 패턴의 통계적 추론을 방해합니다. 자동화된 OCT 이미징 시스템은 생물막 성장의 큰 공간 및 확장된 시간적 스케일을 커버할 수 있게 합니다. 시판되는 OCT 시스템과 로봇 포지셔닝 플랫폼 및 소프트웨어 솔루션 제품군을 결합하여 OCT 스캐닝 프로브의 위치 지정과 3D 생물막 이미징 데이터 세트의 수집 및 처리를 제어합니다. 이 설정은 생물막 개발의 현장 및 비침습적 자동화 모니터링을 허용하며, 매크로 사진 및 마이크로센서 프로파일링과 OCT 이미징을 결합하기 위해 추가로 개발될 수 있습니다.

우리는 광영양 스트림 생물막의 spatio 측두체 형태 형성을 연구하기 위하여 디자인된 수로 실험을 사용하여 자동화된 OCT 화상 진찰 시스템의 기능을 보여줍니다. 수로의 점차적으로 좁아지는 기하학적 구조는 수로의 중심을 따라 유속의 그라데이션을 유도하였다(참조17참조).  생물막의 시간적 발달 과 구조적 분화는 생물막 형태 발생에 대한 유체 역학 적 조건의 영향을 더 잘 이해하기 위해 18 일 동안 모니터링되었습니다. 도 4는 18일 이상 성장한 생물막 소콜로니의 성장을 보여 준다. 생물막의 표면 형태는 전술한 툴세트를 사용하여 정량화하였다(도4A). 유속 구배를 따라 각 위치에 대해 3.6 mm 엣지 길이(도 4B)를 가진정사각형 이동 창에 대해 생체부피(ImageProcessing.ipynb, 보충 파일 1</s...

미생물 생물막은 서로 복잡한 구조를 형성하고 매우 규모에 의존하는 공간 패턴으로 발전합니다. 여기에서는 3D 광학 일관성 단층 촬영(OCT) 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위한 실험 시스템(하드 및 소프트웨어)을 소개합니다. 이 도구 세트는 공간과 시간에 생물막 형태 형성의 비침습적 및 다중 스케일 특성화를 허용합니다.

대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3D 광학 일관성 단층 촬영

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

여기서 우리는 광학 일관성 단층 촬영 또는 10 월에 따라 자동화 된 시스템을 제시합니다. 이를 통해 대규모 공간 비늘 또는 장기간 생물막의 구조를 모니터링할 수 있습니다. OCT 이미징은 마이크로미터 범위의 구조를 해결하는 데 적합하지만 현재 약 250 평방 밀리미터의 최대 면적으로 제한됩니다.바이오필름은 특히 대규모 환경 그라데이션에 의해 차별화가 구동되는 경우 이러한 규모를 초과하는 경우가 많습니다. 실험용 설정을 통해 대규모 공간 비늘과 장기간 생물막의 3차원 형태발생을 모니터링할 수 있습니다. 이 시스템은 빠르고 정밀하며 자율적으로 작동합니다.우리는 중요한 생태계 프로세스를 추진하는 스트림에서 생물막의 형태 형성을 연구했습니다. 그러나, 시스템은 다른 자연 시스템 또는 엔지니어링 환경에서 생물막을 연구하는 데 사용될 수있다. 위치 지정, 이미지 수집 및 분석을 위한 소프트웨어는 Python에 기록되어 있습니다.그들은 Jupyter 노트북을 통해 사용할 수 있습니다. 이들은 사용자 친화적이고 자유롭게 사용할 수 있으며 유연한 솔루션입니다. 우리는 설치의 시각적 표현이 다른 사용자가 설치를 재현하고 소프트웨어를 더 잘 이해하는 데 도움이 된다고 생각합니다.우리는 이것이 다른 연구자들이 유사한 접근 법을 채택하도록 영감을 주기를 바랍니다. 다음은 설치개요입니다. 이 시스템은 정밀 포지셔닝 장치인 OCT 프로브로 구성되며 플렉시글라스 수로 주위에 조립됩니다.GitHub에 게시된 지침과 함께 다음을 통해 위치 지정 장치를 배선하여 시작합니다. 연결되면 별도의 GitLab 페이지에 설명된 대로 GRBL 서버를 설치합니다. 이제 이 웹 페이지를 통해 포지셔닝 시스템을 제어할 수 있습니다. 또는 작업된 예제와 같이 Python 스크립트를 통해 제어할 수 있습니다.마이크로 유체 장치, 유동 실, 수로 또는 여과 시스템을 포함하는 실험 설정 옆에 컴퓨터와 OCT 기본 장치를 벤치에 배치합니다. 아직 설치하지 않은 경우 제조업체에서 설명한 대로 사용 가능한 소프트웨어와 함께 OCT 시스템을 설치합니다. 그런 다음 여기에 연결된 GitLab 문서에 설명된 대로 자동화된 OCT 스캔 수집을 위한 소프트웨어 패키지를 설치합니다.이미지 수집을 시작하려면 호환되는 도브테일 홀더를 사용하여 포지셔닝 장치에 광학 일관성 단층 촬영 프로브를 장착합니다. 필요한 경우 목표 렌즈에 침지 어댑터를 설치한 다음 OCT 시스템과 포지셔닝 장치에 전원을 공급합니다. 상용 OCT 소프트웨어를 열고 관심 있는 사이트를 찾고, 샘플에 집중하고, 참조 팔과 광원 강도를 조정하여 최적의 화질을 제공합니다.동일한 참조 팔 길이와 강도를 유지하면서 좌표를 기록하고 여러 위치에 대해 이 절차를 반복합니다. 이미지 수집을 엽니다. 이 문서의 보충 파일 2 Jupyter 노트북에서 발견 된 ipynb 파일.각 셀에는 특정 작업을 수행하는 코드가 포함되어 있으며, 누압 셀을 통해 별도로 실행할 수 있으며, 실행 또는 제어 및 입력 또는 Shift 및 Enter. 필요한 라이브러리에 대한 경로를 설정하여 위치 지정 장치를 연결하여 10월 스캐너를 초기화하는 데 필요한 라이브러리에 대한 경로를 설정합니다. 그런 다음 굴절률, 시야의 크기 및 B 스캔당 A 스캔 수를 포함하여 획득 매개 변수를 조정합니다.또한, 획득된 데이터 및 메타데이터에 대한 예비 스캔의 강도 히스토그램과 대상 폴더를 기반으로 OCT 스캔의 신호 경계를 설정합니다. 시야 및 해상도 필드에 따라 파일 크기는 10월 스캔당 최대 1.5기가바이트에 도달할 수 있습니다. 이 두 매개 변수는 최종 데이터 집합의 복셀 크기와 출력 파일의 크기를 결정합니다.그들은 OCT 프로브의 광학 해상도와 일치해야합니다. 작업 예제에서 강조 표시된 것처럼 기본 매개 변수를 가진 단일 OCT 검사를 획득하거나 다른 매개 변수 집합을 지정하는 단일 검사를 획득할 수 있습니다. 또한 위치 지정 장치를 이동하고 단일 OCT 스캔을 획득하기 위해 특정 좌표를 제공할 수도 있습니다.이 기능을 사용하면 높은 공간 정확도로 실험에서 동일한 위치로 반복적으로 돌아갈 수 있습니다. 데이터는 8비트로 저장됩니다. 원시 형식은 저장 공간을 저장합니다.OCT 설정 및 좌표를 포함한 메타데이터는 동일한 명명 규칙이 있는 json 파일의 동일한 폴더에 저장됩니다. 또는 관심 위치 목록을 지정하고 해당 OCT 스캔을 자동으로 획득합니다. 대형 환경 그라데이션에 걸쳐 생물막 형태학적 구조를 특성화하기 위해 모자이크 패턴으로 스캔을 획득합니다.이를 위해 기본 값이 30%인 인 인접 타일 수를 지정하면 원시 OCT 검사가 왜곡된 것처럼 보입니다. 이는 광학 시스템을 통한 경로 길이의 차이 때문입니다. 작업된 예제와 같이 이 왜곡을 수정하는 알고리즘을 개발했습니다.이미지 보정을 시작하려면 Jupyter 노트북 ImageProcessing.ipynb를 엽니다. 이 예제에 이어, 먼저 스퓨리어스 신호를 배제하고 바이오필름이 하위 계층 위에 나타나도록 데이터 집합을 재조정하기 위해 OCT 스캔을 먼저 자르십시오. 구형 수차에 대한 다음 올바른.이를 위해 알고리즘은 OCT 스캔에서 반사가 매우 높은 평평한 표면을 현지화하고 이를 참조로 사용하여 스캔을 평평하게 합니다. 20~20그리드에서 알고리즘은 신호 강도의 로컬 최대아를 식별하여 참조 표면을 지역화합니다. 그런 다음 두 번째 순서 다항곡면이 이러한 점에 걸쳐 장착되어 있으며 OCT 스캔의 각 픽셀을 Z 방향으로 이동하는 데 사용됩니다.이 알고리즘의 매개 변수는 OCT 검사의 특성으로 조정되어야 합니다. 이 보정을 통해 여러 이미지에서 균일한 참조 표면을 구현하여 대규모 이미지를 바느질할 수 있습니다. 이미지가 평평해지면 이미지가 생체 필름 위의 이미지의 빈 영역을 식별하고 평균 배경 강도를 빼서 배경 잡음에 대해 보정됩니다.다음으로 3D OCT 데이터 집합에서 입면 맵을 계산합니다. 이렇게 하려면 하위 계층과 같은 참조 표면을 정의하고 적절한 강도 임계값을 선택합니다. 그런 다음 입면 맵이 그레이스케일 값으로 보고된 생물막의 높이로 렌더링됩니다.모자이크 패턴으로 이미지를 획득한 경우 스티치 알고리즘을 적용하여 각 고도 맵을 스티치합니다. 자동화된 OCT imaging를 사용하여, 광트로피스트림 생물막의 현면성 형태발생은 수로 실험을 사용하여 검토되었다. 수로는 플렉시 글라스로 만들어지고 점차적으로 유출로 확대됩니다.이렇게 하면 흐름 속도의 그라데이션이 발생합니다. 전체 유동 속도 그라데이션을 따라 자라는 생물막의 고도 지도입니다. 중요한 것은, 자동화된 OCT 이미징 시스템은 저유속에서 고유속도 조건에 이르는 다양한 유동 조건에서 생물막 두께, 거칠기 및 바이오볼륨과 같은 구조적 파라미터를 지속적으로 측정할 수 있게 해줍니다.형태학적 변화와 함께, 수로의 입구로부터의 거리의 함수로서 평균 생체볼륨이 현저히 감소하였다. OCT 스캔의 품질은 기준 암 길이와 초점 거리에 따라 크게 달라집니다. 실험 중에 이 매개 변수를 재조정해야 할 수 있습니다.포지셔닝 장치의 정확성을 보장하려면 정기적으로 호밍 작업을 수행해야 합니다. 이 자동화된 이미징 장치는 생물막의 기능적 특성화를 위한 마이크로센서 프로파일링과 쉽게 결합될 수 있습니다. OCT는 새로운 이미징 기술이며, 여기에 제시된 시스템이 생물막 구조에 대한 연구를 자극할 것으로 예상합니다.이는 식수 처리 또는 바이오 프로세싱과 같은 기술과 관련이 있을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

출처: Huang, Y. et. al., 광간섭 단층촬영을 사용한 3차원 종양 스페로이드의 종단적 형태학적 및 생리학적 모니터링. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 광간섭의 사용을 보여줍니다. 단층촬영(OCT)은 고해상도 단면 이미지를 캡처하여 멀티웰 플레이트에서 종양 스페로이드를 모니터링합니다. OCT는 세포 구조에서 반사되는 빛을 분석하여 3D 모델을 구축하여 크기 및 모양과 같은 형태학적 특징을 평가하는 동시에 시간 경과에 따른 광 산란 변화를 기반으로 생존 가능한 세포와 생존 불가능한 세포를 구별합니다.

Optical Coherence Tomography를 사용한 종양 스페로이드의 형태학적 및 생리학적 모니터링 

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

이 논문은 세균 바이오 필름과 현장에서 인터페이스에서 미생물에 의해 만들어진 복잡한 생활 소재의 로컬 기계적 특성을 측정 할 수있는 전용 자기 핀셋의 개발에 씨앗을 품고 자기 입자의 원격 작동에 따라 원래의 방법을 보여줍니다.

에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동<em&gt; 현장에서</em세균 바이오 필름 물성&gt; 3D 매핑

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

어셈블리, 동작, 설명 그리고 흐름에서 실시간으로에서 이미지 균 biofilm 형성 하도록 설계 흐름 기구의 청소. 우리는 또한 제공 하 고 인수 이미지에 사용할 수 양적 알고리즘 토론.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

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우리는 저간섭 홀로단층촬영을 사용하여 오가노이드의 고해상도, 무표지 및 3차원 이미징을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 이미징 획득 및 전산 이미지 분석을 자세히 설명하여 살아있는 오가노이드의 구조 역학 및 약물 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

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