Name: 병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 배우세요 인간 colonoid 단층 배양법을 통해 장 상피-병원균 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 점액 생물학 및 염증성 장질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI), 보조금과 K01 DK113043 (축구 협회)에 의해 지원 되었다. 우리가 제임스 Kaper (메릴랜드 대학, 볼티모어, 메릴랜드, 미국) 제공에 감사 대장균 HS와 EHEC 스트레인. 우리는 또한 통합 생리학과 홉킨스 콘 테 소화 질병 기본 들어가게 연구 핵심 센터 (P30 DK089502)와 존스 홉킨스 질량 분석 및 Proteomics 코어의 코어 이미지를 인정합니다.

이 프로토콜은 이전 저자 출판 연구를 기반으로 합니다. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 다음 단계 수행 되어야 합니다 밖으로 적절 한 무 균 기술을 사용 하 여 살 균 biosafety 내각에서. 인간 견본을 포함 하는 모든 메서드는 제도적 검토 보드의 존스 홉킨스 대학의과 대학 (IRB NA_00038329)에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 세포 외 매트릭스 셀 문화 삽입 코트
<ol><li>재고 콜라겐 IV 솔루션 (1 mg/mL) 100 mM 아세트산 5 mL를 준비 합니다. 서 4 ° C에서 약 4 시간 완전히 하이드 레이트/분해 하자.</li>
	<li>Aliquot 콜라겐 IV 솔루션을 재고 하 고 또는-20 ° C (> 1 개월) 4 ° C (≤ 1 개월)에 저장 합니다.</li>
	<li>코팅, 직전 무 균 조직 문화 학년 물 34 μ g/mL의 최종 농도에 콜라겐 IV 재고 솔루션을 희석. 24-잘 접시 세포 배양 삽입, 코트 각 10 μ g/c m2에 해당 솔루션의 100 μ로 삽입 합니다.</li>
	<li>표준 공동2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 ≥ 2 h, 접시를 품 어 또는 편의 위해 파라핀 영화와 접시 가장자리 물개 및 4 ° C 하룻밤 또는 최대 1 주에 품 어.</li>
</ol>2. 격리 3D 문화에서 enteroids/colonoids
참고: Enteroids 또는 colonoids는 기증자 biopsies에서 설립 및 이전에 설명한 표준 프로토콜에 따라 3D 문화에서 유지. 14 , 18 짧게, 지하실은 장 생 검 또는 절제 chelation와 기계적인 동요를 통해에서 수확 됩니다. 지하실 세척, 수확, 고 BMM에 도금. 확장 미디어 (4.2 단계에서 설명) 문화에 추가 하 고 2 일 마다 교체 됩니다. 3 차원 문화 형성 도금 후 시간 표시 됩니다.
<ol><li>24-잘 접시에서 배양을 발음 하 고 1 mL 얼음 수확 솔루션으로 대체 ( 재료의 표참조) 잘 당.</li>
	<li>미니 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 꺼내와 헤어 지하실 멤브레인 매트릭스 펠 릿, 어떤 자료 잘 가장자리 근처에 특별 한 관심을 지불.</li>
	<li>약 200 rpm, 4 ° C 30-45 분 동안 궤도 통에 접시를 교 반 하십시오.</li>
</ol>3. 해리 3D enteroids/colonoids
<ol><li>P200 단일 채널 피 펫 또는 다중 채널 피 펫 멸 균 필터 팁으로 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 triturate.</li>
	<li>15 mL 원뿔 유리병에 셀 suspension(s) 풀. 여러 개의 튜브를 사용 하 여 경우 총 정지 볼륨 > 6 mL.</li>
	<li>10 mM HEPES, L-alanyl-L-글루타민 dipeptide (1x), 그리고 페니실린-스 (1x) 고급 DMEM/F12 매체의 동일한 볼륨을 추가 (세척 매체). 반전 튜브 3-4 회를 섞어. G, 10 분, 4 ° C x 300에서 원심 분리기<ol>
<li>필요한 경우 세척 매체를 발음 하 고 0.5 mL/잘 trypsin 바꿉니다 ( 재료의 표참조). P200 피 펫으로 colonoids resuspend, 튜브 캡과 약 2 분 즉시 튜브를 제거, 10 mL의 최종 볼륨을 세척 매체를 추가 하 고 단계 3.3에서 원심 분리를 반복에 대 한 37 ° C 물 목욕에 놓습니다. 참고:이 단계는 경우 분쇄 하지 결과 균일 하 게 크기의 조각에 바람직 있을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 도금 enteroid/colonoid 서 스 펜 션
<ol><li>코팅된 삽입 4 ° C에서 저장, 셀 도금 전에 적어도 30 분 동안 37 °C/5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 equilibrate.</li>
	<li>각 삽입, 도금을 1 mL (25-37 ° C) 사이 따뜻한 확장 매체 (EM)을 준비 하 고 10 μ M Y-27632 및 10 μ M CHIR 99021 추가. 참고: 그들은 구성의 고급 DMEM/F12 B27 포함 (1x), 50 %WNT3A 조절 매체, 15 %RSPO1 조절 매체, 10% 머리 조절 매체, 50 ng/mL 인간 EGF, 500 nM A-83-01, 10 μ M SB 202190, 항생제/antimycotic 칵테일 (1x), 10 mM HEPES, L-alanyl-L-글루타민 dipeptide (1x), 그리고 페니실린-스 (1x) ( 재료의 표참조).</li>
	<li>셀 펠 릿을 포함 하는 관에서 세척 매체를 발음 하 고 적어도 100 μ/삽입을 충분 한 그들의 볼륨에 resuspend.</li>
	<li>각 삽입에서 콜라겐 IV 솔루션을 발음 하 고 삽입 당 세척 매체의 150 μ로 두 번 씻어.</li>
	<li>피펫으로 600 각 삽입 아래 공간으로 그들의 μ.</li>
	<li>피펫으로 100 각 삽입에 세포 현 탁 액의 μ.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에 접시를 반환 하 고 12 시간 이상 그대로 둡니다. 참고: 동요 하거나 크게 삽입 막에 colonoid 파편의 고르지 못한 배급을 방지 하기 위해 플레이트를 기울이기 하지 마십시오.</li>
	<li>셀 첨부 파일을 모니터링 하 고 2.5 아래 단계 대조 조명 현미경에 접시를 두어서 confluent 단층을 형성 확산 렌즈 x x-10.</li>
	<li>1-2 일 후, 대부분 파편 콜라겐 매트릭스를 준수 한다. 문화 매체를 새로 고침 하 고 Y-27632와 CHIR 99021 치료 중단. 매체를 합칠 때까지 2-3 일 마다 새로 고침을 계속 합니다. Confluency는 일반적으로 7-10 일에 도달 했습니다.</li>
</ol>5. 측정 transepithelial 전기 저항
<ol><li>전극 리드와 상피 voltohmmeter (EVOM)에 전원을 연결 합니다. 옴으로 측정 기능이 설정 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>짧게 70% 에탄올에에서 전극 팁와 실험실 휴지로 건조 닦아. 약 5 분 동안 세척 매체의 5 mL에 전극 equilibrate</li>
	<li>삽입 매체에 짧은 전극 팁을 담가 그리고 낮은 잘 접시에 긴 전극 팁의 방향을. 유지 전극 EVOM 읽기는 상대적으로 안정 될 때까지 전체 수직 방향에서 또는 60 보다는 더 이상에 대 한 s. 참고: 경우 전극 어셈블리를 수직 멀리 기울이면 또는 팁 높이 조정 잘못, 짧은 팁 수 접촉으로 서 셀 단층을 방해.</li>
	<li>EVOM 측정 셀 무료 삽입 confluency 또는 차별화 진행 상황을 평가 하는 문화 매체에 빠져들에서 얻은 값을 비교 합니다.</li>
</ol>6. confluent enteroid/colonoid monolayers의 차별화
<ol><li>차별 매체 (DM)에 대 한 그들을 교환 하 고 새로 미디어까지 하루 5 매 2 일 계속. DM은 부족 WNT3A, RSPO1, EM A-83-01, 및 SB 202190.</li>
	<li>TER 예상 대로 차별화 진행 되었는지 확인 하려면 모니터를 계속 합니다. TER는 차별화의 1-5 일 동안 계속 됩니다. Monolayers는 TER 증가 주 5-6을 넘어 생존을 유지 하지만 하루 5-6에서 사용 하는 경우 최대한 가장 재현성 결과 전시를 계속 수 있습니다.</li>
</ol>7. 세균 공생 또는 병원 성 대장균 감염
<ol><li>감염, 수행에 앞서 1 일 세척 하 고 항생제 없는 그들 또는 DM monolayers 피드.</li>
	<li>살 균 미생물 루프를 사용 하 여 부드럽게 냉동된 세균성 글리세롤 재고의 표면을 긁어 파운드 국물의 2 개 mL를 접종 하. 12-16 h 37 ° C에서 인큐베이터를 떨고 표준 튜브를 전송 합니다.</li>
	<li>5 mL 신선한 파운드 국물 (1: 100)로 선발 문화 50 μ를 희석 하 고 90 분 동안 흔들어 가진 외피를 계속 합니다. 이 로그 단계 문화 105-106 콜로 니 형성 단위 (cfu)의 밀도 얻을 것입니다 / mL.<ol>
<li>필요한 경우, 600에서 광학 밀도 측정에 의해 세균 농도 확인 한 분 광 광도 계에 nm (OD600).</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 분 동안 12000 x g에서 세균성 문화 아래로 회전 시키십시오, 상쾌한, 제거 하 고 박테리아 항생제 없는 그들 또는 DM 107 cfu/mL의 최종 농도에 resuspend.</li>
	<li>세균 현 탁 액의 10 μ 삽입 (최종 농도 106 cfu/mL)을 추가 합니다. 피펫으로 천천히 혼합 하 고 extracellular 점액 레이어를 방해 하지 마십시오.</li>
	<li>원하는 감염 기간에 대 한 조직 문화 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
</ol>8. 보존 및 immunostain 점액을 고정
<ol><li>세포 배양 24-잘 접시에서 삽입 리프트 꼭대기 매체를 제거 하 고 삽입에 기대 며 멀리 외부 액체를 닦아 실험실 휴지에 신중 하 게 반전.</li>
	<li>새로운 24-잘 접시에 빙 초 산에 절대 에탄올 (클라크의 솔루션) 실 온에서 10 분의 1:3 솔루션에 삽입을 담가.</li>
	<li>반전 하는 정착 액을 제거 하 고 10 분 진행 표준 immunostaining 프로토콜에 대 한 1 x PBS에 셀 rehydrate 하 삽입.</li>
	<li>면도날을 사용 하 여 삽입 막의 둘레의 주위에 잘라. 집게를 사용 하 여 유리 현미경 슬라이드를 막 전송 하 고 장착 매체 coverglass 부착.</li>
</ol>9입니다. immunoblotting 세포 lysates의 준비
참고: 다음 단계를 수행 하는 얼음 또는 차가운 방에.
<ol><li>Aspirate 매체와 세척 PBS와 한 번에 삽입합니다.</li>
	<li>150 μ 세포의 용 해 버퍼 포함 protease 억제제 (재료의 표 참조)는 삽입을 추가 하 고 5-10 분 스탠드 하자 세포의 용 해 버퍼 포함 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 0.1 %SDS, 1: 100 프로 테아 제 억제 물 칵테일.</li>
	<li>미니 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 삽입에서 셀을 제거 하려면 다음 P200 피 펫을 사용 하 여 간단히 펜션과 microcentrifuge 튜브에 triturate.</li>
	<li>5 x 1 정지 sonicate s 펄스는 microtip을 사용 하 여 20% 진폭에서 프로브 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>전기 이동 법, 또는 약 수를 즉시 수행 하는 경우 SDS 페이지 로딩 버퍼를 추가 하 고 저장 lysates-20 ° c.에</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Enteroid/colonoid monolayers의 성공적인 형성에 대 한 중요 한 매개 변수 1 포함) 건강, 확산 3D 문화로 시작 물자; 2) 단층 시드; 전에 인간의 콜라겐 IV 세포 문화 삽입 표면 코팅 3) 3D의 조각화 문화 기계적으로 또는 효소, 하지만 단일 셀 수준.
3D enteroids/colonoids의 격리, 동안 최적의 떨고 속도 주어진된 통 모델의 회전 직경에 따라 달라질 수 있습니다. 의도 뿐만 아니라 교 반 하십시오 접시는 효율적인 믹싱, 하지만 또한 세포 현 탁 액 또는 격판덮개 덮개에 splashing 피하기 위해 인접 한 우물에. < 30 분의 부 화 기간 잔여 BMM 셀, 첨부 파일 및 삽입에 도금 하는 경우 균일 한 셀 monolayers의 형성을 방해 할 수 있는 걷기를 얻을 수 있습니다. 광범위 한 외피 (≥ 1 h) 크게 감소 세포 생존 능력을 얻을 것입니다.
3D enteroids/colonoids를 분리 하는 데 필요한 분쇄의 범위는 피스톤 강성 및 사용자 손 재주와 달라질 수 있습니다. 단계 대조 조명 현미경에 잘 내용의 정기 검사 조각 당 약 30 셀의 목표와 함께 분쇄 동안 조각 균일성을 확인 하는 것이 좋습니다. 에 대신, 또는 분쇄, 현 탁 액 트립 신 작은 균일 한 조각을 얻을 수와 함께 짧게 소화 수 있습니다. 트립 신 다이제스트 바람직한 monolayers 3D-같은 구조는 다른 상피 층 가운데의 큰 비율을 포함 하는 경우 있을 수 있습니다. 그러나, 단일 셀에 분리 바람직하지 않다로이 크게 세포 생존 능력을 감소. Enteroids/colonoids는 35 μ BMM 물방울에 교양의 한 잘 일반적으로 충분 한 것입니다 2-3 삽입을 하지만이 요소 수 및 enteroids/colonoids의 평균 크기에 따라 다를 수 있습니다.
Colonoid monolayers 그들은 차별화로 꼭대기 매체의 상당한 볼륨을 흡수할 수 있습니다. 이 추가 DM 상단 삽입 챔버 (150-200 μ)을 적용 하 여 피할 수 상단 챔버의 부분적인 건조 단층 생존 또는 다운스트림 분석 실험에 기능 저하를 표시 되지 않습니다. 차별화의 약 4-5 일 후 colonoid monolayers 개발 extracellular 점액 DM의 주의 깊은 열망 후 세포 표면에 두께/젤라틴 자료로 볼 수 있습니다.
EHEC 외부 점액 레이어와 상호 작용, 우리는 정기적으로 세균 titer 및 부 화 기간 프로토콜에 지정 된 사용 합니다. 그러나, 독특한 세균성 긴장 처음 여러 농도 및 원하는 효과 대 한 적절 한 매개 변수를 결정 하기 위해 부 화 기간에 분석 한다.
점액 고정, 동안 꼭대기 중간 발음 extracellular 별도 점액 층의 가장 가능성이 제거 됩니다. 따라서, 그것은 신중 하 게 매체에 밖으로 부 어 하는 것이 중요입니다. 매체 표면 장력에 의해 삽입에 유지 하는 경우는 접힌된 연구소 조직의 모서리를 사용 하 여 표면 장력을 깰 매체의 대부분을 멀리 심지. 고정 후에 얼룩, 점액 레이어 수 실수로 제거 또는 삽입 필터에는 coverglass 장착 하는 동안 병합. 점액 높이 유지 하려면 필터 미디어를 장착 한 방울에 놓고 필터에는 coverglass를 신중 하 게 배치 합니다. 탭 하거나이 크게 점액 레이어를 평평 수로 coverglass 눌러 마십시오.
3D 문화에 셀에서 편광된 단층을 형성, 그것은 장 상피 세포의 basolateral 막 integrins 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 상호작용을 재현 하는 데 필요한. Laminin, 콜라겐 IV, fibronectin, proteoglycans 배열 구성 장 상피 ECM. 21 , 22 우리는 비교 인간의 세포 유래 laminin, fibronectin, 콜라겐 IV, 및 파생 murine BMM 삽입 코팅으로. 콜라겐 IV 지원 안정, 장기 (최대 4 주)의 대형만 confluent enteroid/colonoid monolayers (그림 1-2). 단층 처럼 성장의 작은 패치 다른 테스트 매트릭스의 각 가져온 하지만이 지역 confluency를 진행 하지 못했습니다. ECM 대리는 다양 한 장점으로 인간의 콜라겐 IV의 사용 합니다. BMM 파생에서 Engelbreth-Holm-떼 (EHS) murine 육 종 세포는 인간의 기원의 되지 않습니다 인간의 콜라겐 IV는 상업적으로 사용할 수 있으며 일반적으로 더 많은 비용. 또한,는 BMM 고유의 가변성, 단백질의 복잡 한 혼합물 이며 성장 인자는 육 종에 의해 분 비 유전자 발현에 영향을 주는 포함 될 수 있습니다. 23
장 상피 세포와 장 상피 배상에 기본 ECM 사이 상호 작용은 아직도 불완전 하 게 이해 된다. 인간 colonocytes24 및 장 토 굴 상피 세포 회복25 의 증강에 대 한 접착 ligand로 콜라겐 IV, 하지만 하지 laminin의 중요성 콜라겐 IV 첨부 파일에 대 한 항 체를 사용 하 여 제안 하고있다 . 상피 표현 β1 integrin β1 integrin에 대 한 특정 항 체는 크게 4 콜라겐 입력 colonocytes의 접착 차단 ECM 상호 작용에 대 한 중요 한 것 같다. 24 콜라겐 IV는 신뢰할 수 있는 ECM을 제공 한다 enteroid/colonoid 단층에 대 한 삽입, ECM의 개장 하는 시간이 지나면서 상피에 아직 평가 되지이 모델에도 더 복잡 하 고 정의 된 ECM 혼합물의 영향 콜라겐 IV, laminin, 그리고 fibronectin입니다.
(그림 1-4) 단층 형식에 인간 enteroids/colonoids 사용 조작 하 고 성가신 또는 3D 매트릭스에 포함 된 culture를 사용 하 여 불가능 한 것을 샘플링. 3D enteroids/colonoids 크기, 구조 복잡성 및 luminal 볼륨에서 변화 하 고 따라서 미생물 또는 작은 분자의 microinjection는 정확 하 게 quantitate 어렵다. 또한, monolayers (표 1), 달리 3D 문화 직접 액세스를 방지 이온, 양분, cytokines 또는 분 비 요인 생리 또는 pathophysiologic 프로세스와 관련 된 측정 하 고 basolateral luminal 표면 . Confluency (그림 1-2) 뿐만 아니라 영양소의 생리 그라디언트, 이온, 그리고 다른 고분자,16 을 설정 하지만 적절 한 장벽 만들기에 필요한 enteroid/colonoid 단층의 주요 속성 중 하나입니다. luminal microbiota 살 균 엽/면역 세포 채워집니다 serosal 환경 사이. 이러한 측면은 더 복잡 한 생리 적 모델 구축 하 엽, 면역, 또는 신경 세포 유형 enteroid/colonoid monolayers를 통합 하는 미래 연구에 대 한 고려 하는 중요 합니다.
여기에 설명 된 셀 문화 삽입 모델의 지적된 한계 유체 전단 응력 등의 기계적 스트레치/압축 (연동), 물리적 힘의 부족 등 혐 기성 꼭대기 환경 창 자에 의해 일반적으로 경험의 부재 epithelia vivo. 이러한 요소는 더 정교한 microphysiological 플랫폼,26 으로 해결 될 가능성이 그러나 또한 추가 비용, 장비, 및 구현 하는 전문 지식을 요구 한다. 이러한 구성 요소는 의도적으로 추가 하지 않으면 3D 및 단층 문화 상호 작용 또는 장내 미생물, stromal 세포 인구, 그리고 면역 시스템에서 기여 없이 있습니다.
콜라겐 4 코팅 셀 문화 삽입에 enteroid/colonoid 단층의 미래 응용 프로그램 병원 성 또는 공생 미생물 상호 작용, 약물 또는 양분 통풍 관, 독성, 신진 대사, 장벽 기능, 다른 연구에 포함 될 수 있습니다와 기능 향상 추가 장 셀 종류와 공동 문화 촉매. 평가 할 수 있다 유전자 변이 또는 창 자 장애를 가진 개인에서 뿐만 아니라 건강 한 기증자의 epithelia 내의 뿐만 아니라 vivo에서 고기는 ex vivo enteroid/colonoid 문화 보존을 설립 하는 제공.

장 organoids, enteroids, 및 colonoids 줄기 세포 행동, 장 개발, 배리어/전송 기능 및 세포 분화를 이해에 많은 발전을이 끌고있다. 그러나 1 , 3D 문화 제한 호스트 상피-병원 체 상호 작용의 연구 때문에 루멘은 세균에 직접 액세스할 수 없습니다 또는 독성 요인 닫힌된 구조는 microinjection에 복종 하지 않는 한. 2 , 3 또한, 작은 분자, 단백질, 등 자료를 분 비 또는 점액 다운스트림 분석에 대 한 3 차원 문화에서 쉽게 샘플링할 수 없습니다. 형광 염료를 사용 하 여 시간 경과 현미경, 3D 문화에서 상피 장벽 기능4 와 이온 수송5 에서 병원 성 대리인의 영향 평가 하지만 투과 조직 문화 지원에 성장 하는 monolayers는 의무가 TER 측정 및 Ussing 챔버/전압 클램프 녹음 등 추가 기술. 6 , 7
수많은 간행물의 enteroids/colonoids 2D 또는 단층 문화에 대 한 프로토콜을 설명 했습니다. 상피 세포 부착 홍보 자료 포함8,9 0.1% 젤라틴, 콜라겐 hydrogels10 얇은 레이어 murine 육 파생 지하실 멤브레인 매트릭스 (BMM),11,12, 13 과 인간의 콜라겐 IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 6,,1415 또는 트립 신,10,11 을 사용 하 여 세포 접착 요소의 분리를 pipetting으로 시드 접근 포함 기계적 조각 dispase,13 또는 EDTA입니다. 9 몇 가지 프로토콜, 시드의 비 다공성 조직 문화 plasticware 사용 하지만 이렇게 하면 제한 basolateral 액세스, 대부분의 응용 프로그램 삽입 침투성 조직 문화에 따라 달라 집니다. 안정적인 confluent 단층 형성 및 유지 보수 설명서는 간행물 중 넓게 변화 한다. 또한, 인간의 문화에 대 한 성장과 분화 미디어 작곡과 더 많은 연구자 채택 하 고 그들의 응용 프로그램 및 사용 가능한 리소스에 맞게 방법을 조정 진화를 계속 다양 한 그룹 사이 다.
3D 창 자 상피 문화 호스트 병원 체 상호 작용 연구에서의 한계를 해결 하기 위해 우리는 3 차원 인간 enteroids 또는 colonoids는 단층을 변환에 대 한 수정 된 프로토콜 제시. 토 굴 같은 미 숙 상태에서 confluency를 달성 한 후 성장 인자 WNT3A, RSPO1 및 A-83-01 및 SB 202190 억제제의 대표 작은 장 모 또는 표면 결 장 상피의 분화 이끌어 낸다. 이상적인 매트릭스, 인간의 콜라겐 유형 IV, 코트를 삽입 하 고 균일 한 enteroid 또는 colonoid 조각 도금을 설명 합니다. 시연이 프로토콜 TER. Colonoid monolayers 꼭대기 두꺼운 점액 층을 분 비 하는 높은 confluent 단층 생성 immunoblotting 또는 immunostaining를 통해 점액 병원 체 상호 작용의 ex vivo 연구에 대 한 허용 합니다. Immunostaining에 대 한 저 승 점액 레이어를 유지 하려면 수정된 고정 절차 또한 설명 되어 있습니다. 이 방법은 감염 시 초기 장 호스트 병원 체 상호 작용 연구를 세공 모델을 제공 하는 것을 목표로.

<table><tbody><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol</td><td>Sigma</td><td>T4661</td><td>Tris base, 용해 완충액</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>ALK4/5/7 억제제</td></tr><tr><td>아세트산, 빙하</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>성장 배지</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>의 구성 요소<td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>F-actin</td></tr><tr><td>항생제/항진균 칵테일</td>용 형광 프로브 <td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td>Primocin (100x)</td></tr><tr><td>B27, 50x</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>성장 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>세포 배양 인서트</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>Transwell, PET 멤브레인, 0.4 &mu; m pore, 24-well plate</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>GSK3&beta; 억제제</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 이미징 키트</td><td>Life Technologies</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV, 인간 태반에서 Sigma</td><td></td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td><td>Trevigen</td><td>3700-100-01</td><td>기저막 매트릭스</td></tr> <tr><td>해중합장출혈성 Escherichia coli (EHEC)</td><td>Kaper 연구실, 메릴랜드</td><td></td><td></td>대학교</tr><tr><td>상피 전압저항계</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>상피 전압저항계 전극</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX3</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli strain HS</td><td>Kaper lab, University of Maryland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 앱솔루트</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Fluor저장 장착 매체</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td>현미경 슬라이드에 삽입 멤브레인 장착용</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드, 200 mM</td></tr><tr><td>HEK293T/Noggin-Fc 세포주</td><td>van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research</td><td></td><td>생산을 위해 Noggin 조건 매체</td></tr><tr><td>HEK293T / RSPO1-Fc-HA 세포주</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-K</td><td>Rspondin-1 조건 매체</td></tr><tr><td>HEPES 생산, 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>성장 배지</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R 원심 분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004250</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>형광 핵 염료</td></tr><tr><td>인간 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-01M</td><td>성장 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>용해 완충액의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>역 세포 배양 광 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX51</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>L-WNT3A 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td>Wnt3a 조절 배지</td></tr><tr><td>Matrigel 생산, 성장 인자 감소</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>3D 배양을 위한 기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>미니 세포 스크레이퍼</td><td>United BioSystems</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>MUC2 항체, 마우스 단클론</td><td>Abcam</td><td>ab11197</td><td>면역염색을 위해 1:100, 면역 블로팅을 위해 1:500에 사용</td></tr><tr><td>MUC2 shRNA 렌티바이러스 입자</td><td>GE Dharmacon</td><td>RHS4531</td><td>GIPZ 렌티바이러스 shRNA, ID: 4583</td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>그랜트 인스트루먼트</td><td>PSU-10i</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>성장 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>21-031</td><td></td></tr><tr><td>마이크로팁이 있는 프로브 초음파 발생기</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>포유류 세포용 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>용해 버퍼의 구성 요소</td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>Tocris</td><td>1264</td><td>p38 MAPK 억제제</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>용해 완충액의 구성</td></tr><tr><td>요소 Sodium dexoycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>용해 완충액의 구성</td></tr><tr><td>요소 도데실황산나트륨</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>TrypLE Express, 1x</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>트립신, 장/콜로노이드 단편 소화용</td></tr><tr><td>Vinculin 항체, 토끼 단클론</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td>면역 블로팅을 위해 1:1000에서 사용</td></tr><tr><td>물, 조직 배양 등급, 멸균 여과</td><td>Corning</td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>RhoA/ROCK 억제제</td></tr></tbody></table>

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 colonoid monolayers

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

인간의 3 차원 (3D) enteroid 또는 colonoid 문화 토 굴 기본 줄기 세포에서 파생 된는 현재 장 상피의 가장 진보 된 비보 전 모델입니다. 그들의 닫힌된 구조 및 중요 한 지원 기질, 3D 문화 호스트 병원 체 연구에 이상적입니다. Enteroids 또는 colonoids 둘 다의 조작 luminal 있도록 세포 막 투과성 조직 문화에 상피 monolayers로 수 basolateral 셀 표면 및 동반 체액. 이 향상 된 luminal 표면 접근성 용이 enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC)에 결 장 상피의 점액 저하 등 세균성 호스트 상피 상호 작용을 모델링. 3D 문화 조각화, 단층 시드, 및 transepithelial 전기 저항 (TER) 측정 confluency와 차별화를 향해 진행 상황을 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. Colonoid 단층 차별화 면역 형광 또는 immunoblotting 기법에 의해 공부 될 수 있다 분 비 점액을 생성 합니다. 더 일반적으로, enteroid 또는 colonoid monolayers 병원 성 또는 공생 microbiota 대상이 될 수 있습니다 특정 세포 인구를 평가 하는 생리 적으로 관련 플랫폼을 사용 합니다.

인간 enteroid 및 colonoid 문화 3 차원 구조로 성장 다음 해리 고 인간의 콜라겐 4 코팅 셀 문화 삽입에 도금에 대 한 조각. 단층 형성의 진행 쉽게 반영 transepithelial 전기 저항 (TER) (그림 2), 밝은 분야 현미경 검사 법, 면역 형광 검사 (그림 1), 얼룩을 통해 그리고 꾸준한 증가 의해 매일 모니터링 이온을 단층 confluency와 관계가 긴밀 접합의 침투성. 빈 24 잘 삽입의 테는 약 50-100 Ω·cm2및 confluency에 도달 시 약 400-500 Ω·cm2증가. 모든 상피 세포 confluent monolayers 접합 단지 F 걸 링 셀 경계에 의해 감지에 의해 연결 되어 (그림 1). Monolayers 전체 증가율 미디어에서 대표 증식 토 굴 같은 상피 세포는 nucleoside을 통합 하는 적극적으로 나누어 주로 구성 되어 아날로그 듀 (그림 2). 성장 인자 WNT3A와 RSPO1의 증식 세포 부족 모 같은 문화를 선도 하는 차별화를 촉진 합니다. 차별화 된 monolayers enterocytes (enteroids) 또는 colonocytes (colonoids)를 포함 하 고 3 차원 문화,18 등 잔과 enteroendocrine 셀에에서 표시 된 것 처럼 전문된 장 상피 세포를 개발 합니다. 15 분화 된 monolayers 또한 TER (&gt; 1000 Ω·cm2)에 상당한 증가 보여 줍니다 (그림 2), 성숙 꽉 교차점을 나타내는.
정상적인 인간 생리학에서 장 상피 층 멸 균 serosal 환경에서 영양분과 미생물 농축 luminal 공간 분리합니다. 상피는 밀접 하 게이 2 개의 구획 사이 크로스 토크를 통제 한다. Enteroid 및 colonoid monolayers 보존이 중요 한 구획 속성에서 proteomic 분석에서와 같이 표 1. 단백질 구성 꼭대기에 상당한 차이가 있다 그리고 basolateral 조건 차별화 된 enteroid monolayers에서 수집 된 미디어. 혀끝과 basolateral 양쪽 모두에 대 한 액세스 cytokines, 발산 등 다른 분자의 차동 분 비의 측정 시간 종속 방식에서 모두 supernatants의 컬렉션에 대 한 수 있습니다. 15 , 17
Monolayers는 단백질 표정 immunoblotting 및 immunostaining를 사용 하 여 변경 내용을 감지 하 편리 하 고 매우 재현 모델입니다. 따라서, 변경 mucin 2 (MUC2)에서 식 shRNA 최저 (KD)에 의해 검출 될 수 있다 두 기법 (그림 3)를 사용 하 여. ShRNA 변환 3D colonoids에 수행 되었고 항생제 선택 미디어에서 유지. KD를 확인 한 후 colonoids 수 수 지속적으로 3D 문화 유지 및/또는 실험적인 목적을 위한 monolayers로 도금. 또한, MUC2 KD 단층 형성 야생 타입 부모의 colonoid 라인에 비해 효율을 미치지 않습니다. Immunoblotting에 대 한 monolayers의 컬렉션은 간단 하 고 인간 상피 선 암 파생 셀 라인에 대 한 설명 하는 프로토콜에 비슷합니다. 일반적으로, 전체 단백질의 약 50 µ g 이상의 단일 0.33 c m2 삽입 성장 단층에서 추출할 수 있습니다. 그림 3에서 보듯이 MUC2 undifferentiated (UD) WT colonoid monolayers에서 거의 감지 하지만 매우 차별화 된 (DF) WT monolayers에 표시 됩니다. MUC2는 MUC2 shRNA로 불리고 UD와 DF colonoid monolayers에서 수준입니다.
중요 한, monolayers는 epithelia의 꼭대기 표면에 호스트-미생물 상호작용 연구에 적합 한 모델입니다. 공생에 의해 쉽게 침투 하지는 차별화 시 두꺼운 첨부 MUC2 양성 점액 층을 형성 하는 Colonoid monolayers 대장균 HS 박테리아 (그림 4), 무슨 정상적인 인간의 콜론에 제안 되었습니다 비슷합니다. 그러나 19 enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC), 인간의 저 승 병원 체, 표시 되었습니다 (그림 4) 상피의 꼭대기 표면 도달 MUC2 농축 된 점액 레이어를 파괴 하는 능력을가지고. 14 , 20 나머지 MUC2은만 잔 셀 안에 존재 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig1.jpg"> 그림 1: 의 인간 enteroid/colonoid monolayers. (A) colonoid의 예 BMM과 분쇄의 해산 후 파편. Colonoid 조각 도금 후 즉시 삽입의 (B) 예. (A-B) 바 규모 200 μ m =. 대표 (C) 최대 강도 프로젝션 및 (D) 공초점 광학 Z-섹션 해당 직교 투영으로 보여 colonoid 조각 인간 콜라겐 4 코팅 필터 폼에 여러 개의 단층 제도 시드 2-4 일 후 시드입니다. 셀 자유로운 지역 (별표)는 둘 다 핵의 부재 (Hoechst 33342, 블루)에 의해 식별 꼭대기 F-말라 (phalloidin, 녹색) confocal C와 D. 대표 (E) 최대 강도 프로젝션 및 (F) 에 얼룩 및 광학 해당 직교 계획 섹션 F 걸 immunostaining 약 1 주일 후 시드 감지 연속 꼭대기 서피스와 confluent colonoid 단층을 표시 합니다. (G)는 대표적인 최대 강도 프로젝션 및 해당 직교 투영 (H) 공초점 광학 섹션의 높은 확대 표시 confluent colonoid monolayers 셀 F 걸 perijunctional 형성 반지 (흰색 화살표) 고 미 숙 꼭대기 브러시 테두리 (노란색 화살표 머리). (C-H) 바 규모 = 20 μ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig2.jpg"> 그림 2: enteroid/colonoid 단층 차별화의 평가. (A) 듀 (레드) 설립 jejunal 단층 차별화 중 확산의 진보적인 손실을 보여줍니다. 확장 또는 차별화 매체에 confluent jejunal monolayers에서 (B) 평균 TER 측량. 오차 막대를 나타내는 SEM. 총, undifferentiated; DF, 분화 지정된 된 조건;에서 일에 해당 하는 숫자 UD1은 confluency의 첫번째 날에 시드 후 약 1 주일 이었다. (C) 총 jejunal monolayers 있고, 짧은 셀 DF 5 일 jejunal monolayers 보다 덜 성숙 꼭대기 말라 기반 브러시 테두리. (A, C) 바 규모 50 μ m =. 모든 monolayers 했다 적어도 1 주 후 시드 묘사와 차별화 하기 confluent 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig3.jpg"> 그림 3: 야생 유형 colonoids 및 shRNA 불리고 최저 (KD) colonoids 각 양식 confluent monolayers. (A) 5 일 동안 야생 타입 (WT) 인간의 confluent colonoid 단층의 대표 이미지 차별화와 MUC2 KD colonoid 문화에서 파생 된 (B) 마찬가지로 monolayers를 성장. (A-B) 바 규모 = 50 μ m (C) 대표 immunoblot 스크램블된 shRNA 또는 MUC2 shRNA 불리고 colonoid 문화의 immunoblot에 의해 단백질 표정 KD 때문에 변화를 quantitated 수 있습니다 보여 줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59357/59357fig4.jpg"> 그림 4: Enteroid/colonoid monolayers luminal 미생물-호스트 상호 작용을 공부 하기 적합 한 모델입니다. (A) 대표 최대 강도 투영과 직교 광학 부분의 colonoid 단층 보여줍니다 대장균 HS (검은 화살표)에 융 화 되지 않는 두꺼운 꼭대기 MUC2 양성 점액 레이어 꼭대기 점액에 앉아 표면입니다. 단층 106 cfu/mL HS와 함께 6 시간에 대 한 감염 되었다. 제 (B) 호 apically (106 cfu/mL, 6 시간) EHEC 감염 인간 colonoid 단층 소자 대표 최대 강도 투영 (A-B) 바 규모 50 μ m =. (C) MUC2 면역 형광 강도 측정 EHEC 감염 colonoid monolayers 감염 되지 않은 컨트롤에 비해 MUC2에 상당한 감소를 보여줍니다. 오차 막대를 나타내는 SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59357/59357fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단백질</td>
			<td>승인 번호</td>
			<td>펩 티 드 풍부</td>
		</tr>
<tr>
<td>Basolateral 미디어</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>지방산 의무적인 단백질, 간 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_001434.1</td>
			<td>1299</td>
		</tr>
<tr>
<td>[호모 사피엔스] profilin-1</td>
			<td>NP_005013.1</td>
			<td>797</td>
		</tr>
<tr>
<td>apolipoprotein A 4 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_000473.2</td>
			<td>744</td>
		</tr>
<tr>
<td>ecto-ADP-ribosyltransferase 4 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_066549.2</td>
			<td>633</td>
		</tr>
<tr>
<td>glyceraldehyde-3-인산 효소 isoform 1 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_002037.2 (+ 1)</td>
			<td>616</td>
		</tr>
<tr>
<td>serotransferrin 선구자 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_001054.1 (+ 1)</td>
			<td>572</td>
		</tr>
<tr>
<td>비타민 D-바인딩 단백질 isoform 3 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_001191236.1 (+ 2)</td>
			<td>567</td>
		</tr>
<tr>
<td>카 탈 라 제 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_001743.1</td>
			<td>427</td>
		</tr>
<tr>
<td>agrin isoform 1 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_940978.2 (+ 1)</td>
			<td>377</td>
		</tr>
<tr>
<td>lactotransferrin isoform 1 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_002334.2 (+ 1)</td>
			<td>262</td>
		</tr>
<tr>
<td>꼭대기 미디어</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>개미 자리의 요소 3 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_003217.3</td>
			<td>326</td>
		</tr>
<tr>
<td>개미 자리의 요소 1 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_003216.1</td>
			<td>304</td>
		</tr>
<tr>
<td>지하실 멤브레인 관련 heparan 황산 proteoglycan 핵심 단백질 isoform 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_001278789.1 (+ 3)</td>
			<td>303</td>
		</tr>
<tr>
<td>filamin-B isoform 1 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_001157789.1 (+ 2)</td>
			<td>240</td>
		</tr>
<tr>
<td>개미 자리의 요소 2 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_005414.1</td>
			<td>182</td>
		</tr>
<tr>
<td>악성 뇌 종양 1 단백질 isoform b 전조 [호모 사피엔스]에서 삭제</td>
			<td>NP_015568.2 (+ 3)</td>
			<td>169</td>
		</tr>
<tr>
<td>각 질, 유형 II cytoskeletal 1 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_006112.3</td>
			<td>157</td>
		</tr>
<tr>
<td>myosin-9 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_002464.1</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>aminopeptidase N 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_001141.2 (+ 1)</td>
			<td>145</td>
		</tr>
<tr>
<td>agrin 전조 [호모 사피엔스]</td>
			<td>NP_940978.2 (+ 1)</td>
			<td>112</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 꼭대기에서 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석에 의해 확인 된 펩 티 드 그리고 basolateral 체액에서 샘플링의 일부 목록 구분 jejunal monolayers.

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

3D 장 가구 배양은 루멘이 박테리아 또는 독성 요인에 직접 접근할 수 없기 때문에 숙주 상피 병원체 상호 작용의 연구를 제한합니다. 추가적으로, 소분자, 단백질 또는 점액과 같은 분비된 물질은 다운스트림 분석을 위한 3D 배양에서 쉽게 샘플링될 수 없습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 3D 인간 엔테로이드 또는 콜로노이드를 단층으로 변환하기 위한 수정된 프로토콜을 제시합니다.콜로노이드 단층은 두꺼운, apical 점액 층을 분비, 병원체 점액 상호 작용의 전 생체 연구를 허용. 이 방법은 감염시 초기 장 숙주 병원균 상호 작용을 연구하는 기관 모델을 제공하는 것을 목표로합니다. 콜로노이드 단층은 숙주 병원체 상호 작용, 미생물군유전체 연구 및 염증성 장 질환에서 중요한 점액 생물학을 연구하는 새로운 방법을 허용할 것입니다.이 방법은 상부 기관, 호흡기 및 여성 생식 시스템과 같은 다른 점액 분비 기관에 적용 될 수있다. 시각 데모는 단층 성장 중 및 면역 염색을 위한 고정 도중 점액 보존을 가진 사용자를 도울 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 직원 과학자 인 카롤 도클라디 (Karol Dokladny)가 될 것입니다.코팅된 세포 배양을 배양한 후, 배양 배지를 24웰 플레이트로부터 흡인시키고 웰당 1밀리리터 얼음냉수확용액으로 대체한다. 미니 셀 스크레이퍼를 사용하여 지하 막 매트릭스 펠릿을 빼고 분해하십시오. 우물 가장자리 근처의 모든 재료에 특별한주의를 기울이는 다.그런 다음, 30 ~45 분 동안 섭씨 4도에서 분당 약 200 회전에서 궤도 셰이커에 플레이트를 교반합니다. 멸균 필터 팁이 장착된 P200 단일 채널 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 세트리트합니다. 15 밀리리터 원내 유리병에 세포 현탁액을 전달합니다.총 서스펜션 볼륨이 6밀리리터보다 큰 경우 여러 바이알을 사용합니다. 그 후, 바이알에 10 밀리머 HEPES, L-alanyl-L-글루타민 디펩티드 및 페니실린-연쇄 절제술을 함유한 고급 DMEM/F12 배지의 동일한 볼륨을 추가합니다. 이것은 세척 매체입니다.유리병을 3~4회 반전하여 섞어보냅니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 g의 원심분리기. 세포 도금 전에, 적어도 30 분 동안 조직 배양 인큐베이터에서 코팅 된 인서트를 평형.각 인서트가 도금될 때마다 섭씨 37도의 수조에서 팽창 매체 1밀리리터를 따뜻하게 하고 2개의 억제제가 추가됩니다. 그런 다음, 우물에 혼합물을 추가합니다. 세포 펠릿을 함유하는 튜브로부터 세척 매체를 흡인하고 삽입당 최소 100 마이크로리터를 산출하고 재중단하기에 충분한 부피로 팽창 매체로 대체한다.이어서, 각 인서드로부터 콜라겐 IV 용액을 흡인시키고 삽입당 세척 매체 150마이크로리터로 두 번 세척한다. 각 인서트 아래 공간으로 확장 매체의 파이펫 600 마이크로리터. 각 삽입에 유리병에서 세포 현탁액의 파이펫 100 마이크로 리터.접시를 조직 배양 인큐베이터로 되돌리고 적어도 12 시간 동안 방해받지 않고 둡니다. 접시가 흔들리거나 급격하게 기울어지 않도록 하십시오. 인큐베이팅 후, 플레이트를 2.5배에서 10배의 객관적렌즈로 위상 대비광 현미경에 놓습니다.억제제 없이 배양 배지로 리프레시하여 억제 처리를 중단합니다. 혼잡할 때까지 2~3일마다 미디어를 새로 고칩니다. 미세 한 팁 집게 또는 핀셋으로 24 웰 플레이트에서 세포 배양 삽입을 들어 올립니다.실험실 티슈 페이퍼를 조심스럽게 뒤집어 정압 매체를 제거하고 삽입물에 달라붙는 외부 액체를 닦아냅니다. 새로운 24웰 플레이트에서 빙하 아세트산과 절대 에탄올의 1~3가지 용액에 실온에서 10분 간 삽입을 담급합니다. 그런 다음, 벤치에, 고정을 제거하기 위해 티슈 페이퍼에 삽입을 반전.표준 면역 스테인닝 프로토콜을 진행하기 전에 세포를 재수화하기 위해 1X PBS로 채워진 플라스틱 용기에 인서트를 10 분 동안 배치합니다. 보존하려면 면도날을 사용하여 삽입 멤브레인의 둘레를 잘라냅니다. 집게를 사용하여 멤브레인을 유리 현미경 슬라이드로 옮킵니다.그런 다음 마운팅 매체를 추가하고 커버 글래스를 부착합니다. 이 실험에서 인간 장용 및 대장균 배양은 3D 구조로 재배된 다음 인간-콜라겐-IV 코팅 된 세포 배양 삽입에 도금하기 위해 해리되고 단편화됩니다. 단층 형성의 진행은 밝은 필드 현미경 검사법과 면역 형광 염색을 통해 매일 모니터링됩니다.인간 콜라겐-IV 코팅 필터에 시드된 콜로노이드 파편은 파종 후 2~4일 동안 여러 단층 섬을 형성합니다. 상응하는 직교 투영을 가진 최대 강도 투영 및 공초점 광학 Z 단면도 둘 다 핵및 apical F 액틴 얼룩의 부재에 의해 세포 없는 지역이 식별된다는 것을 보여줍니다. 연속 적색 표면을 가진 컨물류 콜로노이드 모노레이어는 F-actin 면역 스테인링에 의해 약 1주일 후 시드를 검출하였다.상응하는 직교 투영을 가진 대표적인 최대 강도 투영 및 공초점 광학 섹션의 높은 배율은 Confluent colonoid 단층의 세포가 F 액틴 perijunctional 링과 미성숙 한 정량 브러시 테두리를 형성한다는 것을 보여줍니다. EdU 법인은 제주 단일층 분화 시 확산의 점진적 손실을 보여줍니다. 미분화 된 제주 단층은 분화 5 일 후에 제주 단층과 비교하여 더 넓고, 짧은 세포 및 덜 성숙한 apical actin 기지를 둔 브러시 테두리를 갖는다.콜로노이드를 조각화하는 것은 매우 중요합니다. 조각이 너무 크면 코팅된 필터에 부착되지 않고 대신 3D 콜로노이드로 개혁합니다. 우리는 대장형 모노레이어에 점액 생물학을 공부하는 수정된 방법을 제시했습니다.그밖 숙주 병원체 연구 결과는 병원체와 장 정액 표면 사이 상호 작용을 보기 위하여 수행될 수 있습니다.

human-colonoid-monolayers-to-study-interactions-between-pathogens

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

출처: 인, J. G. 외. 병원체, 공존체, 숙주 장 상피 간 상호작용을 연구하기 위한 인간 대장장 단층. J. Vis. 경험 (2019).이 영상은 콜라겐 코팅된 Transwell 시스템에서 대장유래 상피세포를 배양하여 장벽을 모델링하고 숙주-병원체 상호작용 연구를 가능하게 하는 점액 생성 단일층을 생성하는 절차를 시연합니다.

숙주-병원체 상호작용을 연구하기 위한 장벽 기능을 가진 인간 대장층 단층 생성

생체 외 장기 배양은 온전한 조직 구조의 맥락에서 생물학적 과정을 조사할 수 있게 해줍니다. 여기에서는 장내 선천면역 및 항균 숙주 방어를 연구하는 데 사용할 수 있는 마우스 결장의 체외 배양 방법을 소개합니다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em항균 호스트 방어 연구에&gt; 콜론 오르간 문화와 그것의 사용

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

이 프로토콜에서, 우리는 장 지하실에서 직접 뮤린 기본 상피 결장 단층층을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 투과성 필터에 컨천단층을 생성하기 위한 실험적 접근법, 스크래치 상처 치유 및 생화학 연구를 위한 컨큐리 단층, 면역 형광 분석을 위한 희소및 응수 단층층을 제공합니다.

장 내 토굴에서 뮤린 기본 결장 상피 단층의 세대

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

우리는 3차원 결장류의 발달을 위한 쥐 결장 선와(miline colonic crypt)의 분리를 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다. 확립된 콜로노이드는 염증성 챌린지를 받거나 상피 단층을 형성하도록 지시되기 전에 숙주 상피의 세포 구성을 반영하도록 최종적으로 분화될 수 있습니다.

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

이 연구는 조직 줄기세포에서 유래한 장 오가노이드를 이용한 세균 감염의 시험관 내 조사 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 2차원에서 오가노이드를 배양하고 구분하는 방법, 침착성 대장균으로 감염시키는 방법, 그리고 상피 장벽 돌파, 감염 영상, 상피 RNA 반응 등 주요 측정값을 평가하는 방법을 설명합니다.

숙주-박테리아 상호작용을 연구하기 위한 침입 또는 저저막 추출물에 적용한 2차원 오가노이드 배양

배우세요 인간 colonoid 단층 배양법을 통해 장 상피-병원균 상호작용을 연구하는 방법을. 이 기술은 점액 생물학 및 염증성 장질환 연구에 활용됩니다.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

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