Name: 높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 학습하세요 단일 분자 이미징을 위한 HIST 현미경 구축 방법을. 이 기술은 기존 방식보다 40배 넓은 시야와 낮은 배경 잡음을 제공하며, 상용 현미경 시스템과 호환됩니다.

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이 작품은 방위 고 등 연구 프로젝트 기구 (DARPA) (HR00111720066) 및 국립 과학 재단 (NSF) (1805200)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 마이클 방탄복 Andor 기술에 아낌없이 sCMOS 카메라를 임대.

1. 현미경, 레이저 및 정렬 도구 설정
<ol><li>구축 하기 전에 현미경, 광학, 전자 재료의 테이블에에서 나열 된, optomechanics 등 모든 필요한 구성 요소를 준비 합니다.</li>
	<li>두 부분 주로 구성 된 현미경 몸 준비: RMS 스레드 포트와 피 단 객관적인 홀더 알루미늄 블록 (그림 1A)에 장착. 참고: 맞춤 현미경 몸 편의 계측12의 유연성을 위해 사용 됩니다. 어떤 상용 현미경 몸 HIST 현미경 검사 법에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>여러 레이저 라인을 결합 하 고 단일 모드 섬유에 결합<ol>
<li>설치 405, 561, 638 nm 레이저 광에 표 및 그림 1B와 같이 편광 빔 스플리터와 긴 패스 dichroic 거울을 통해 광선을 결합. 모든 레이저 빔 정렬 도구에 핀 홀을 통과 것 다는 것을 확인 하십시오. 전원 조정 위한 반 파 격판덮개를 삽입 합니다. 참고: 눈 보호를 위한 안전 고글을 착용 하 고 빔-블록을 사용 하 여 원치 않는 레이저 광선 흡수.</li>
		<li>섬유 커플링 렌즈 설치 (f = 4.5 m m)를 광섬유 어댑터 z 축 번역기에서 케이지 시스템.</li>
		<li>(MMF, Ø 62.5 μ m) 다중 모드 광섬유 광섬유 어댑터에 연결 합니다. 각 레이저의 커플링 효율은 95% 보다 높은 때까지 스티어링 거울과 z-번역기의 각 쌍을 조정. 출력 빔 얼룩 패턴 근처 가우스 모양 프로필이 있다.</li>
		<li>다중 모드 광섬유 려 고 단일 모드 광섬유 (SMF)를 연결 합니다. MMF, 유사한 세밀 하 고 3 개의 레이저의 커플링 효율을 극대화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조립 조명을된 광원 구동 및 검출 경로에서 빔 정렬에 사용 됩니다. 이 장치는 일시적으로 일관 된 광원의 구성 (561 nm) SMF, 광섬유 어댑터, achromatic 렌즈에 연결 (f = 60 m m), 아이리스와 Ø1 "케이지 시스템 (그림 1C)에서 스페이서 튜브. 광섬유 어댑터 사용 하 여 전단 간섭계는 준 렌즈 사이의 거리를 조정 합니다.</li>
	<li>빔 정렬 도구 (그림 1D)를 준비 합니다. 이것은 알루미늄 게시물 pinholes 2 "는 신속 하 고 정확한 빔 정렬 광학 테이블의 표면에서 높이에 한 쌍 이다.</li>
	<li>2 Ø1의 구성 된 더블 핀 홀 시스템 조립 "각 끝에 지상 유리 맞춤 디스크 및 2 개의 Ø1" 그림 1E(하단 하나 이룰) 튜브 렌즈.</li>
</ol>2. 검색 경로 설정
<ol><li>목표를 꺼내와 조명을된 광원을 설치. 현미경에서 출력 빔 이며 대략 높이 광학 테이블에 평행 하 게 정렬 테이블에 뚫린된 구멍으로 되도록 객관적인 홀더 아래 거울 (M1)의 손잡이 조정 합니다. 각 광 부품의 상세한 위치 그림 2 를 참조 하십시오.</li>
	<li>멀티 밴드 dichroic 거울 (DM)을 삽입 하 고 90도 광선을 반영. 조리개의 최대 크기를 사용 하 고 빔 클리핑 없이 dichroic 거울의 센터를 통과 다는 것을 확인 한다.</li>
	<li>새 빔 dichroic 거울 통과 사용 하 여 검색 경로 맞춤 안내. 광속으로 sCMOS 카메라를 놓고 빔을 2 개의 거울 (m 2와 M3)를 사용 하 여 카메라 칩의 센터 조회 수 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>삽입 튜브 렌즈 (TL; f = 300 m m) 카메라에서 약 300 m m.</li>
	<li>조명을된 광원을 제거 하 고 천장에 패턴은 명확 하 게 카메라에 의해 해결 될 때까지 튜브 렌즈와 카메라 사이의 상대 거리를 조정 합니다.</li>
	<li>다 색 형광 이미징 튜브 렌즈 앞 멀티 밴드 패스 필터 (BF)를 삽입 합니다.</li>
</ol>3. 여기 경로 설정
<ol><li>객관적인 홀더에 조명을된 광원을 다시 설치 합니다. 90도 현미경에서 배 거울 (M4) 빔 출력을 놓습니다. Dichroic 거울과 배-거울의 손잡이 빔 빔 정렬 도구에 핀 홀을 통해 전달 될 때까지 반복적으로 조정 합니다.</li>
	<li>조명을된 광원을 분리 하 고 있는 빔 현미경 몸으로 점 테이블에 그것을 설치. 빔 빔 정렬 도구와 더블 핀 홀 시스템을 사용 하 여 맞춥니다.</li>
	<li>삽입 한 렌즈 L4 (f = 400 m m; Ø = 2") 객관적인 홀더에서 약 400 m m 광학 경로를. 대물 렌즈를 설치 하 고 완벽 한 통풍 디스크 패턴은 천장에 형성 될 때까지 광학 축 따라 L4의 위치를 조정 합니다. 참고: 렌즈를 삽입할 때 렌즈를 통과 하는 광속 위치 유지 되어야 한다 변경 되지 않은. 렌즈 L4 SM2 스레드를 쉽게 연결/60 m m SM2 스레드 케이지 접시에서에서 분리 될 수 있다.</li>
	<li>목적은 나사 고 오픈 창포와 조명을된 광원을 설치 하십시오. 비즈니스 카드와 함께 현미경에서 광선 출력 아래로 추적. 광속의 크기는 작은 장소에서 활용된 이미지 평면 (cIP)은 L4 거리 약 400 m m M5 거울을 탑재 합니다.</li>
	<li>M6 거울을 설치 하 고 90도 광선을 반영. 빔 정렬 도구와 M5와 M6 반복적으로 조정 합니다.</li>
	<li>L3 렌즈 삽입 (f = 150mm) M5에서 약 150 m m. 깎는 간섭계를 사용 하 여 출력 광속의 준을 보장 하기 위해.</li>
	<li>일시적으로 빼앗 L4와 L3의 초점 위치를 찾을 수 빔 아래로 추적. 이 시점에서 단일 축 galvo 거울을 넣어, 활용된 다시 초점 비행기 (cBFP)입니다. Galvo 거울에 0 볼트를 공급 하 고 90도 광속 반영 galvo 거울의 회전.</li>
	<li>장소 배 거울 M7입니다. 제대로 L2 장소 (f = 100 m m) 단계 3.6으로 같은 방식으로.</li>
	<li>개체 소유자에서 조명을된 광원을 제거 합니다. 준 렌즈 L1 설치 (f = 100 m m), 어댑터와 아이리스. 단일 모드 광섬유 어댑터에 연결 하 고 이미징 시스템을 통해 광속을 보낼.</li>
	<li>L4 다시 삽입 하 고 완벽 한 통풍 디스크 패턴 천장에 나타날 때까지 시스템을 미세 조정.</li>
</ol>4. 원통형 렌즈를 설정
<ol><li>원통형 렌즈 삽입 (CL1, f = 400 m m) L1 후 원통형 렌즈 x 축 따라 빔을 초점을 맞추고 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>또 다른 원통 모양 렌즈를 삽입 (CL2, f = 50mm) 빔 경로에. 깎는 간섭계를 사용 하 여 출력 빔 조명을 위해. 참고: 두 개의 원통형 렌즈 사이의 거리는 450 m m. 출력 빔 8의 압축률 있으며 천장에는 길쭉한 타원형 모양의 공기 디스크 패턴 형성 된다.</li>
</ol>5. 타일 이미지 테스트
<ol><li>3D 하이드로 겔 샘플을 준비 합니다. 혼합 20 nm 크림슨 12 %acrylamide:bisacrylamide (29: 1), 0.2% (v/v) TEMED 및 0.75 x TAE 버퍼에 0.2% (w/v) 암모늄 persulfate 이루어져 히드로 솔루션 비즈. 11설명 되어 있는 대로 흐름 챔버로 혼합된 솔루션의 50 µ L를 주사. 10 분 후 3D 하이드로 겔 샘플 영상에 대 한 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>샘플 홀더에 샘플을 넣어. 638 nm 레이저를 켜고 전원을 조정 < 1 샘플 여기 mW.</li>
	<li>카메라 제어 소프트웨어를 실행 합니다. 카메라 수집 설정 패널에 트리거 모드에서 내부 를 선택 하 고 비디오 무료 모드 실행을 클릭 합니다.</li>
	<li>이미지는 카메라의 중심에 0 볼트 galvo 거울에 적용 되 면 되도록 카메라의 위치를 약간 조정 합니다.</li>
	<li>M5 달성 높은 경사 조명 거울의 수평 손잡이 회전 합니다. 참고: 조명 각도의 증가, 히드로 이미지 피 이미지 보다 명확 하 게 빔을 얇은 되 면 된다. 그러나, 이미지는 거의 동일한 위치를 유지합니다.</li>
	<li>타일 이미지를 기록 합니다. 효과적인 조명 폭11계산 합니다. 예를 들어 그림 3 12 µ m의 효과적인 조명 폭을 보여준다.</li>
</ol>6. HIST 이미징
<ol><li>터미널 블록에 연결 된 데이터 수집 보드를 준비 합니다. 전기 와이어를 통해 P0.0와 사용자 1 BNC 커넥터를 연결 합니다. SCMOS 카메라의 외부 트리거링을 위한 사용자 1 디지털 출력으로 사용 합니다. 아날로그 연결 galvo 미러 드라이버를 AO0를 출력.</li>
	<li>맞춤 프로그램(그림 4)를사용 하 여 P0.0에서 TTL 펄스 트레인을 생성 하 고 설정 기간 시간 400 ms 및 t_ON = 2 = 양 디지털 오실로스코프에 의해 사용자 1 BNC 터미널에서 생성 된 펄스를 확인 하 고 카메라에 BNC 케이블 연결 외부 트리거 포트입니다. 참고:이 문서에 사용 된 제어 소프트웨어는 요청 시 이용 가능. 다른 카메라 프레임 속도로 이미징, 기간에 따라 조정 한다.</li>
	<li>맞춤 프로그램을 통해 galvo 거울을 청소를 시작 합니다. V분 -500 mV 및 V최대 500 조정 전체 FOV 이미징에 대 한 mV. Note는이 작업에서 3D 하이드로 겔 샘플 여전히 보여 높은 배경 Epi 조명 비슷합니다.</li>
	<li>카메라 수집 설정을 변경합니다.<ol>
<li>외부 트리거 모드에서 (순차) 아래 에서 선택 LightScan 플러스 드롭-다운 메뉴 그림 4B와 같이 합니다. 참고:이 설정에서 카메라 받지 않는다 이미지 트리거 신호 설정 하지 않는 한.</li>
		<li>창 높이 선 노출 시간 제어를 위한 스캔 속도 제어 를 클릭 하 고 설정 값을 180 행 과 28 ms, 각각. 참고: 때 타일 너비 (Weff) 180 행 (12 µ m) 이며 줄 (intT) 통합 시간 28 ms, 줄 (TD) 사이의 지연 시간으로 결정 됩니다 TD Tint/Weff = = 2, 048 x 이미징을 위한 0.156 양 2, 048 픽셀, 총 수집 시간은 TD + Tint x 2048 = 346 ms, ~2.9 fps에 해당.</li>
	</ol>
</li>
	<li>약간 V최대 및 V분 명확 하 게 이미지를 조정 합니다.</li>
	<li>3D 스택에 전환 하 고 스택 및 스텝 크기의 수를 지정 하 여 주문 품 프로그램을 사용 하 여 3D 스택 이미지를 얻을.</li>
</ol>

<ol><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361, 880-887 (2018).</li>
<li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+structural+biology%3A+Two+decades+of+single-molecule+Forster+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer.</a> Science. 359, (2018).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Approaches+to+Stochastic+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).</li>
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<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Tang, J., Han, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+field-of-view+single-molecule+imaging+by+highly+inclined+swept+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination.</a> Optica. 5, 1063-1069 (2018).</li>
<li>Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Dark+States+Enable+Ground+State+Depletion+Microscopy+of+Nitrogen+Vacancy+Centers+in+Diamond+with+Diffraction-Unlimited+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution.</a> Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).</li>
<li>Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ray+tracing+analysis+of+inclined+illumination+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ray tracing analysis of inclined illumination techniques.</a> Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).</li>
</ol>

센트럴 플로리다 대학이이 문서에 설명 된 작업을 다루는 특허 출원을 제기 했다.

이 프로토콜에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫 번째 단계 3.3, 입사 빔 렌즈의 센터를 통해 전달 하 고 완벽 한 통풍 디스크 패턴은 천장에 형성에서 L4의 적절 한 배치 이다. L4의 위치 모든에서 다른 광학 부품, M5, L3, GM과 2를 포함 하 여 배치를 결정 합니다. 두 번째 중요 한 단계는 동기화 프로세스. 거부 하려면 초점 배경 밖으로, 액티브 픽셀의 효과적인 탐지 폭 타일 너비는 빔 연소와 동기화 해야 합니다. 따라서, 그것은 타일 빔 (5.6 단계)의 효과적인 조명 폭을 측정 하는 데 필요한 하 고 설정된 카메라 매개 변수 따라 단계에서 6.4.
매우 큰 FOV와 이미징, 제시 방법 증가 배경 다른 쪽에 비해 한 쪽에 표시 됩니다. 이것은 조명의 다른 영상 위치에서 약간 변경된 각도에 기인 합니다. 같이 하기 전에 스캔 각도11와 동기적으로 조정 하 여이 문제를 완화 한다 M5 대신 두 번째 galvo 미러를 구현. 상용 무색 남자 대신 트릭 스캔 렌즈도 도움이 될. 그러나, 이미징의 영역에 대 한 < 8,080 µ m2, 단일 galvo 거울 청소 충분 했다. 그러나 HIST 현미경 이미징 깊이의 한계는,, 그것은 12 µ m 타일 빔과 없음 1.45 기름 침수 렌즈11~ 15 µ m 이미징 때 좋은 SBR를 얻을 수 있습니다.
이 프로토콜에서 우리 사용 8의 빔 압축 비율 타일 빔. 얇은 조명 HIST 현미경에 단일 분자 조직11이미징에 대 한 강력한 될 수 있는 높은 SBR을 달성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나,이 경우에, photobleaching 효과 고려 되어야 한다 증가 자극 강도 의해 현재 빔 압축 비율에 피11에 비해 3D 이미징에서 감소 photobleaching 보였다 동안. 2 기가 배치 목표 빛 시트 현미경에 비해, HIST 현미경 검사 법은 간단 구현 하 고 기존의 샘플 준비와 호환. 향상 된 SBR 및 큰 FOV HIST 현미경 검사 법의 상호 작용의 여러 셀에 단일 생체 역학 공부에 적합 및 더 사용할 수 있습니다 슈퍼 해상도 이미징 및 단일 분자 추적.

단일 분자 형광 이미징 ultrastructures, 역학 및 생체1,2,3의 수량을 공개 하는 많은 생물학 연구에서 중요 한 역할을 한다. 그러나, 그것은 세포 또는 조직 내 단일 분자를 공부 하 도전 하고있다. Confocal 현미경 검사 법에는 높은 단면 기능4제공 한다, 때문에 높은 자극 강도 또는 이미징 저속에 의해 심각한 photobleaching 단일-분자 이미징 적당 하다. Widefield 현미경 약한 조명 사용 하지만 배경 비율 (SBR)5가난한 신호에서 겪고 있다. 좋은 단면화 및 낮은 photobleaching6; 빛 시트 현미경 검사 법, 다른 한편으로, 보여줄 수 있는 그러나, 사용할 수 있는 수 가늠 구멍 (NA) 기가 배치 목표7의 요구에 의해 크게 제한 됩니다. 또는, 특별 한 조명 기 및 샘플 챔버8,9필요합니다.
이러한 이유로, 매우 경사 하 고 적 층 광학 시트 (힐로) 현미경은 3D 단일 분자 이미징10널리 사용 되었습니다. 경사 빔 (유리 및 예 물) 두 미디어의 인터페이스를 발견 하면 빔 Snell의 법률에 따라 굴절 이다. 중요 한 것은, 굴절된 빔 얇은, 도착 하 고 두께 dz로 설명 = R/tan(θ) R은 경사 빔 직경 및 θ 전송된 광선의 굴절 각도입니다. 이 간단한 구현 좋은 단면 기능에서 결과. 그럼에도 불구 하 고,이 관계는 얇은 조명 (즉, 높은 단면 기능) 필요한 작은 R 또는 큰 θ 나타냅니다. 예를 들어, R = 20 µ m와 θ = 72도, 하나 dz를 얻을 수 있습니다 6.5 µ m =. 깊은 셀 안에 이미지 하 고 총 내부 반사를 피하기 위해 굴절 각도 증가 하는 실제적인 제한 때문에, 조명 직경 및 빔 두께의 강한 커플링이 있다. 이러한 이유로 힐로 이미징은 상대적으로 작은-의-시야 (FOV) 크게 다세포 이미징에서 응용 프로그램을 제한 하는 표시 됩니다.
최근에, 우리는 FOV는 매우 간단한 방법11빔 두께에서 분리는 매우 경사 스윕된 타일 (HIST) 현미경으로이 문제를 극복 했다. 첫째, 한 방향으로 길쭉한 빔 원통형 렌즈의 쌍을 통해 생성 됩니다. 타일로 불리는이 빔 생성 dz와 얇은 조명 ~ 4 µ m의 FOV는 130 x 12 µ m2. 다음, 타일은 회전 galvo 거울을 사용 하 여 샘플 전역 휩 쓸. 한편, 형광 이미지 롤링 셔터 모드 가변 confocal 슬릿 탐지 역할에서 작동 하 여 효율적으로 밖으로의 초점 배경 필터 과학적 상보성 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라에 기록 됩니다. 이 방법에서는, HIST 현미경 단일 분자 이미징을 큰 필드의 보기 (~ 130 x 130 µ m2)와 힐로 영상 보다 얇은 조명 수 있습니다. 우리는이 새로운 이미징 유전자 발현을 연구 하 고 질병에 대 한 상당한 잠재력을가지고 있는 셀에 단일 프로브 또는 마우스 뇌 조직에 몇 가지 프로브 RNA 사본을 감지 기술 적용. 다른 접근 달리 HIST 추가 조명 없이 단일 높은 수 가늠 구멍 목표 또는 원격 탐지 목표를 사용 하 여 그리고 거꾸로 현미경와 완벽 하 게 호환 됩니다. 이러한 장점은 큰 FOV와 고대비 HIST를 만들 것 이다 현미경 검사 법 생물학과 약에서 눈에 띄는 도구. 선물이 HIST 현미경 및 테스트 하 고 아래에로 그 성능을 교정 방법의 계측에 관한 자세한 내용은.

<table><tbody><tr><td>1" 무채색 더블릿</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A-ML</td><td>콜리메이터&nbsp;</td></tr><tr><td>1" 무채색 이중선</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L1,L2</td></tr><tr><td>1" 무채색 이중선</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td>TL</td></tr><tr><td>1" 광대역 유전체 미러</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02-10</td><td>M1~M7</td></tr><tr><td>1" 원통형 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1363RM-A</td><td>CL1</td></tr><tr><td>1" 원통형 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM-A</td><td>CL2</td></tr><tr><td>1" 스퀘어 키네마틱 마운트</td><td>Edmund Optics</td><td>58-857</td><td>이색성 미러 장착용</td></tr><tr><td>1" 나사산 케이지 플레이트</td><td>Thorlabs</td><td>CP02</td><td>다른 렌즈 고정용</td></tr><tr><td>2" 무채색 이중</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-150-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>2" 무채색 이중</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-400-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>2" 나사산 케이지 플레이트</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>L4</td></tr><tr><td>2" 나사산 케이지 플레이트</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01T</td><td>L3</td></tr><tr><td>2% Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>64085292</td><td>하이드로겔 구성 요소</td></tr><tr><td>20nm 형광 비드</td> 유지용 <td>Thermo Fisher</td><td>F8782</td><td>이미징 테스트용</td></tr><tr><td>30mm 케이지 직각 키네마틱 미러 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>목적 및 카메라 장착</td></tr><tr><td>30mm 케이지 시스템 Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CP20S</td><td></td></tr><tr><td>3축 NanoMax Stage</td><td>Thorlabs</td><td>MAX311D</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드 용액</td><td>Bio Rad</td><td>64148001</td><td>하이드로겔 성분</td></tr><tr><td>405nm 레이저</td><td>코</td><td>볼트 Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0743</td><td>하이드로겔 성분</td></tr><tr><td>561nm 레이저</td><td>코볼트</td><td>코볼트 06-DPL</td><td></td></tr><tr><td>638nm 레이저</td><td>코볼트</td><td>코볼트 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모</td>늄 <td>시그마</td><td>A3678-25G</td><td>하이드로겔 구성 요소</td></tr><tr><td>빔 정렬 도구</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC 단자대</td><td>Natural Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>케이지 플레이트(M9 x 0.5 내부 나사</td><td>포함) Thorlabs</td><td>CP1TM09</td><td>비구면 렌즈 고정용</td></tr><tr><td>케이지 시스템 로드</td><td>Thorlabs</td><td>SR 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 및 smFISH</td><td></td><td></td><td>참조 참조 [11]</td></tr><tr><td>양면 테이프&nbsp;</td><td>스카치</td><td>515182</td><td>플로우 챔버</td></tr><tr><td>에폭시&nbsp;</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td>플로우 챔버</td></tr><tr><td>Galvo 미러</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211</td><td>GM</td></tr><tr><td>Galvo 시스템 선형 전원 공급 장치</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td></td></tr><tr><td>반파 플레이트</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-405 / 561 / 633</td><td>전원 조정</td></tr><tr><td>장역 통과 이색성 미러</td><td>Chroma</td><td>T550lpxr</td><td>레이저 결합 용</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12549-3</td><td>플로우 챔버</td></tr><tr><td>Mikroskopische Deckglaser</td><td>Hecht Assistent</td><td>990/5024</td><td>플로우 챔버</td></tr><tr><td>장착 젖빛 유리 정렬 디스크</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td><td>이중 핀홀 시스템용</td></tr> 장착 <tr><td>로체스터 비구면 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>A230TM-A</td><td></td></tr><tr><td>다중 대역 이색성 미러</td><td>Semrock</td><td>Di03-R405/488/561/635- t3</td><td>DM; 3 mm 두께</td></tr>의 <tr><td>다중 대역 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/523/600/677-25</td><td>BF</td></tr><tr><td>다중 모드 섬유</td><td>Thorlabs</td><td>M31L02</td><td>MMF</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라메틸 에틸렌디아민</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ML</td><td>하이드로겔 구성 요소</td></tr><tr><td>NI-DAQ 보드</td><td>Natural Instruments</td><td>PCI-6733</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; 1 "Kinematic Mirror Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>거울 고정</td></tr><tr><td>용 대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>PLANAPO N 60X</td><td>60X 1.45NA 오일</td></tr><tr><td>받침대 베이스 클램핑 포크</td><td>Newport</td><td>9916</td><td></td></tr><tr><td>받침대 기둥 기둥</td><td>Thorlabs</td><td>RS1P8E</td><td></td></tr><tr><td>피에조 컨트롤러</td><td>Thorlabs</td><td>BPC303</td><td></td></tr><tr><td>편광 빔 스플리터</td><td>Thorlabs</td><td>PBS251</td><td>레이저</td></tr><tr><td>RMS-SM1 어댑터</td><td>결합용 Thorlabs</td><td>SM1A3TS</td><td>대물 렌즈</td></tr><tr><td>로드 홀더</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전 케이지 마운트용&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/CRM1/CRM1P</td><td>HWP 및 원통형 렌즈 장착</td></tr><tr><td>sCMOS 카메라</td><td>Andor</td><td>Zyla-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>전단 간섭계</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td>빔 시준 테스트</td></tr><tr><td>단일 모드 광섬유</td><td>Thorlabs</td><td>P5-405BPM-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>SMF SM1 렌즈 튜브</td><td>Thorlabs</td><td>SM1S25</td><td>이중 핀홀 시스템용</td></tr><tr><td>SM1 슬롯 렌즈 튜브</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L30C</td><td>더블 핀홀 시스템 용</td></tr><tr><td>무대 마운트</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나사산 광섬유 어댑터</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FC</td><td></td></tr><tr><td>Z 축 변환 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>파이버 커플 링</td></tr></tbody></table>

높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

단일 분자 이미징 크게 생물 학적 연구에 분자 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 전진 했다. 그러나, 그것은 두꺼운 세포와 조직에 큰 보기의 필드, 높은 콘트라스트 이미지를 얻기 위해 도전 하고있다. 이 문제를 극복 하는 매우 경사 스윕된 타일 (HIST) 현미경 검사 법을 소개 합니다. 한 쌍의 원통형 렌즈 빠른 galvo 거울을 통해 큰 이미징 영역 검색 길쭉한 여기 빔을 생성 하기 구현 되었습니다. 4f 구성 광학 부품 위치 사용 되었다. 과학적인 보완 금속-산화물 반도체 카메라 형광 신호를 감지 하 고 동적 confocal 슬릿 빔 연소와 함께 동기화와 함께 밖으로의 초점 배경 차단. 우리는 모든 기본 구성 요소와 HIST 현미경 건물에 단계별로 지침 제시.

예를 들어, 단일 가닥 DNA Atto647N으로 표시 했다 638의 여기 파장 몇 군데 3D 히드로에 nm. DNA는 젤 합 동안 acrydite moiety 통해 히드로 네트워크에 정박 했다. 이미지 에서처럼 그림 5는표면 위의 5 µ m에서 찍은 사진. HIST 이미지에서 신호 대 배경 비는 계산 단일 분자 관광 명소의 대부분 HIST 이미지 1.9 ± 0.7 겨우 피에 의해 검출 될 수 피 이미지에 비해 훨씬 적은 배경으로 나타났다.
단일 분자 RNA 형광 제자리 교 잡 (smFISH) 4 수행한 물고기 프로브. 그림 5 이미지 버퍼에 A549 세포에 AlexaFluor 647 표시 EEF2 (진 핵 번역 신장 요인 2)의 smFISH 이미지를 표시 하는 b (샘플 준비11에 대 한 우리의 이전 작업 참조). 최대 강도 프로젝션 20 z-스택 해당 5 µ m 두께 하에서 수행 되었다. HIST 이미지 많이 개선된 SBR 뿐만 아니라 또한 더 획 일 한 조명 피 이미지에 비해 했다. 피 이미징에 대 한 노출 시간 동안 HIST 통합 이미징에 대 한 줄 시간 둘 다 했다 7.5의 동일한 조명 전원 32 ms 400 ms을 했다 mW 목표 전에 측정. 피와 HIST 이미징 속도 2.5 프레임 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig1.jpg"> 그림 1 . 현미경 몸, 레이저 및 정렬 도구. (A) 목표 및 샘플 홀더. 레이저 시스템의 (B) 사진. LP, 긴 패스 dichroic 거울; Λ/2, 하프-파 판; PBS, 편광 beamsplitter (C) Collimated 광원. (D)와 2 개의 플러그 pinholes 빔 정렬 도구. (E) 더블 홀 시스템입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig2.jpg"> 그림 2 . 높은 경사 스윕된 타일 (HIST) 현미경 검사 법에 대 한 자세한 설정. 사진 (A) 그리고 HIST 현미경 시스템의 개략도 (B). BF, 멀티 밴드 패스 필터; CL1-2, 원통형 렌즈; DM, dichroic 거울; GM, galvo 거울; BF, 대역 통과 필터; M1-7, 거울; L1-4, 렌즈; SMF, 단일 모드 섬유; TL, 튜브 렌즈; cIP, 활용된 이미지 평면; cBFP, 다시 초점 평면 활용. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig3.jpg"> 그림 3 . 8의 압축 비율 조명 타일. (A) 3 차원 하이드로 겔에 20 nm 구슬의 형광 이미지. 스케일 바, 20 µ m. (B) 표준 편차 프로젝션 A, 부드럽게 10 데이터 포인트의 y 방향 따라. 빨간색 화살표 표시는 효과적인 조명 폭 12 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2.jpg"> 그림 4 . 제어 및 이미징 소프트웨어 전면 패널. (A) A 맞춤 LabView 프로그램 동기적 galvo 거울, sCMOS 카메라의 시작 수집 및 압 전 무대의 움직임의 스캔 제어. (B) 카메라 수집 설정 제어판. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig5.jpg"> 그림 5. (A) 피와 HIST 조명 3D 하이드로 겔에서 DNA를 이미지의 Atto647N 표시 된. (B) smFISH 이미지 EEF2 4를 사용 하 여 물고기 피와 HIST 현미경 검사 법에 의해 A549 세포에 프로브 합니다. DAPI 얼룩은 파란색으로 표시 됩니다. 스케일 바, 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

상세한 지시는 타일 (HIST) 현미경 및 단일 분자 이미징에 대 한 용법을 휩 쓸 높은 경사를 구축 하는 방법에 설명 되어 있습니다.

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

우리의 방법을 사용하면 기존의 방법보다 40 배 더 큰 이미지 영역으로 단일 분자를 시각화 할 수 있으며 배경 신호가 크게 감소했습니다. 다른 기술과 는 달리 우리의 접근 방식은 단일 객관적인 렌즈를 사용하고 특수 샘플 챔버가 필요하지 않으며 상용 현미경 시스템과 쉽게 호환됩니다. 필요한 구성 요소를 수집한 후 시스템 빌드를 시작합니다.여기에, 몇 가지 요소는 벤치에 이미 위치에 있습니다. 알루미늄 블록에 장착된 것은 피에조 스테이지와 샘플 홀더가 있는 현미경 본체입니다. 또한 벤치에는 빔을 결합하는 세 가지 레이저와 광학 요소가 있습니다.결합된 빔은 가능한 한 효율적으로 단일 모드 섬유에 결합됩니다. 마지막 예비 단계로, 케이지 시스템에 충돌광원을 조립합니다. 단일 모드 섬유, 섬유 어댑터, 색채 렌즈 및 홍채에 연결된 임시 일관된 광원이 있습니다.검색 경로로 작업을 시작합니다. 첫째, 현미경 신체의 객관적인 포트에 충돌광원을 배치합니다. 출력 빔이 대략 수평이고 벤치의 구멍과 정렬되도록 목표 아래에 미러를 조정합니다.빔 경로에 이색 거울을 삽입하고 빔을 90도 반사합니다. 미러를 추가하여 전송된 빔의 경로를 sCMOS 카메라에 조정할 수 있습니다. 미러를 사용하여 빔이 칩 의 중앙에 닿는지 확인합니다.다음으로 카메라의 초점 길이에 대해 300 밀리리터 초점 길이 튜브 렌즈를 삽입합니다. 현미경 본체에서 충돌광원을 제거합니다. 그런 다음 튜브 렌즈의 위치를 조정하여 초점 평면을 설정합니다.카메라가 천장의 패턴을 명확하게 해결할 때 조정을 중지합니다. 검출 경로는 이 회로도에 묘사됩니다. 멀티 컬러 형광 이미징을 위해 튜브 렌즈 앞에 멀티 밴드 패스 필터를 추가합니다.현미경 본체로 돌아갑니다. 거기, 목표 홀더에 정렬 된 광원을 다시 설치합니다. 이색 거울 후, 반사 된 빔의 경로에 접이식 거울을 배치하여 90도 로 리디렉션합니다.현미경 본체에서 충돌광원을 제거하고 근처에 배치합니다. 다음으로, 거울에서 초점 길이에 약 400밀리미터 초점 길이 렌즈를 삽입합니다. 현미경 본체에서 객관적인 렌즈를 설치합니다.그런 다음 광학 축을 따라 미러의 위치를 조정합니다. 목표 위의 천장을 관찰하고 완벽한 Airy 디스크 패턴이 형성되면 중지합니다. 이제 목표를 제거하고 열린 홍채로 정렬된 광원을 다시 설치합니다.빔 경로를 따라 빔이 미러에서 약 400밀리미터 떨어진 곳에서 가장 작은 위치를 결정합니다. 점이 확인되면, 거기에 거울, 컨쥬게이트 이미지 평면을 마운트합니다. 이 시점에서 설정된 상태는 이 회로도에 나타납니다.방금 추가된 미러는 M5로 표시됩니다. 빔을 90도 반사하기 위해 다른 거울을 삽입하고 그 너머에 150mm 초점 길이 렌즈를 장착합니다. 렌즈는 컨쥬게이트 된 이미지 평면에서 150 밀리미터여야합니다. 다음으로, 일시적으로 여기 빔 경로에서 첫 번째 렌즈를 빼앗는다.이 구성으로 두 번째 렌즈의 초점 위치를 찾습니다. 이 초점에 단일 축 갈보 미러를 공액 된 다시 초점 평면으로 놓습니다. 갈보 미러에 0볼트를 공급하고 홀더를 회전하여 빔을 90도 반사합니다.빔 경로를 따라 빔을 90도 반사하는 접이식 미러를 놓습니다. 렌즈를 공주 된 다시 초점 평면에서 빔 경로를 따라 100 밀리미터를 놓습니다. 다시 한번, 현미경 마운트에서 정렬 된 광원을 제거합니다.아이리스와 함께 섬유 어댑터와 단일 모드 섬유를 갖춘 100mm 콜리메이션 렌즈를 추가합니다. 그런 다음 홍채, 섬유 및 렌즈를 사용하여 이미징 시스템을 통해 충돌빔을 보냅니다. 다음으로, 빔 경로에 마지막 콜리메이션 렌즈 바로 앞에 초점 길이 400밀리미터의 원통형 렌즈를 삽입합니다.빔에 초점을 맞추는 데 사용합니다. 50mm 원통형 렌즈를 최초 앞으로 450밀리미터 에 삽입합니다. 이것은 검출 및 여기 경로 모두와 최종 설정의 회로도 표현이다.세 레이저의 출력은 단일 모드 섬유에 의해 경로에 결합된다. 테스트를 위해 3D 하이드로겔 샘플을 준비하십시오. 이 하나는 하이드로겔과 혼합 20 나노 미터 진홍색 구슬로 구성되어 있습니다.설정시 하이드로겔 샘플을 샘플 홀더에 배치합니다. 638 나노미터 레이저를 시료 흥분의 경우 1밀리와트 미만으로 전력을 조절합니다. 내부 트리거 모드에서 카메라 제어 소프트웨어를 설정하고 비디오를 캡처합니다.이 시점에서 갈보 모터는 0 볼트가 적용됩니다. 이미지가 렌즈의 중앙에 있도록 카메라를 배치합니다. 다음으로, 컨쥬게이트 이미지 평면인 미러를 조정합니다.고도로 기울어진 조명을 얻기 위해 거울에 수평 노브를 회전합니다. 20나노미터 구슬을 사용하여 3D 하이드로겔의 샘플 형광 이미지에서와 같이 타일 이미지를 기록합니다. 스케일 바는 20 마이크로미터입니다.갈보 미러를 청소하기 위해 하드웨어와 소프트웨어를 설정 한 후 진행합니다. 이것은 설치를위한 갈보 미러 스윕 소프트웨어입니다. Vmin을 마이너스 500 밀리볼트로 설정하여 전체 시야 이미징을 준비합니다.그런 다음 Vmax를 500 밀리볼트로 설정합니다. 다음으로 카메라 수집 소프트웨어로 전환합니다. 트리거 모드에서 외부를 선택합니다.LightScan PLUS 드롭다운 메뉴에서 다음 아래로 선택하려면 스캔 속도 제어를 클릭합니다. 이제 특정 제어 매개 변수를 설정할 수 있습니다. 창 높이 아래 180개의 행을 입력합니다.노출 하에서 28 밀리초가 입력됩니다. 완료되면 미러 컨트롤 소프트웨어로 돌아갑니다. 3D 스택 ON의 미러 컨트롤 소프트웨어 스위치에서. 스택 수와 단계 크기를 지정합니다.동영상 녹화를 시작하려면 동영상을 클릭합니다. 이것은 단 하나 가닥 표지된 DNA의 Epi 화상 진찰의 보기입니다. 대조적으로, 고도로 기울어진 스윕 타일 기술은이 이미지를 생산했다.HIST 이미지는 Epi 이미지에 비해 배경이 적습니다. DNA는 3D 하이드로겔에 있고, 외신 파장은 638 나노미터이다. 다음은 표기된 진핵 번역 신장 계수 2의 에피 이미지입니다.HIST 이미지는 신호 대 배경 비율을 향상시켰습니다. 또한 더 균일 한 조명이 있습니다. 둘 다 7.5 밀리와트의 동일한 조명 능력을 가지고 있습니다.이미징 속도는 모두 초당 2.5 프레임이었습니다. 지속적으로 높은 경사 각도를 유지하고 카메라 판독과 스위핑 미러를 동기화하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 이미지 수집 시 신호 대 배경 비율이 높습니다.우리는 HIST 현미경 검사가 두꺼운 조직 조각에 있는 더 깊은 화상 진찰 심층 및 높은 처리량 유전자 발현 프로파일링에 초해상도 화상 진찰을 포함하여 몇몇 응용에 유익할 것이라는 점을 기대합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

단일 평면 조명 현미경 용 모듈 (SPIM)이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양을 위해 최적화되어 설명된다. 샘플은 직사각형 모세관 내에 위치되며, 마이크로 유체 시스템 형광 염료로, 약제 또는 약물은 소량으로 적용 할 수있다.

단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행...

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

칩 기반 의 초고해상도 광학 현미경 검사법은 형광 현미경 검사법에 대한 새로운 접근법이며 비용 효율성과 처리량에 이점을 제공합니다. 여기에서, 칩 준비 및 화상 진찰을 위한 프로토콜은 TIRF 현미경 검사법 및 현지화 기지를 둔 초고해상도 현미경 검사법을 위해 도시됩니다.

포토닉 칩을 사용한 고처리량 총 내부 반사 형광 및 직접 적층 광학 재건 현미경

이 프로토콜은 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하는 방법과 세포골격 네트워크 시각화를 위한 사용법에 대해 자세히 설명합니다.

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

MIBI(Multiplexed Ion Beam Imaging)는 조직 마이크로어레이와 바둑판식으로 배열된 인접 조직 영역을 이미징하는 데 자주 사용되지만, 이러한 실험을 설정하기 위한 현재 소프트웨어는 번거롭습니다. 타일/SED/어레이 인터페이스는 MIBI 실행 설정을 획기적으로 단순화하고 가속화하기 위해 개발된 직관적인 대화형 그래픽 도구입니다.

Tile/SED/Array 인터페이스를 사용하여 Multiplexed Ion Beam Imaging Microscope에서 조직 마이크로어레이 및 Tiled Area Imaging의 신속한 설정 

이 워크플로우는 극저온 삼중 일치 이미징 플랫폼을 사용하여 작고(축 범위 &lt;1μm) 희귀한(세포당 1개 사본) 형광 표지된 생물학적 구조를 표적으로 하는 라멜라 생산을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 형광 현미경, 집중 이온 빔 밀링 및 스캐닝 전자 현미경을 단일 초점 위치에 통합하고 밀링 중 동시 형광 현미경을 가능하게합니다.

세포의 표적 밀링을 위한 극저온 일치 형광, 전자 및 이온빔 현미경을 사용한 워크플로

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

학습하세요 단일 분자 이미징을 위한 HIST 현미경 구축 방법을. 이 기술은 기존 방식보다 40배 넓은 시야와 낮은 배경 잡음을 제공하며, 상용 현미경 시스템과 호환됩니다.

높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸

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