Name: 간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 학습하세요 간섬유증 기법을 이용한 간세포암 정위 종양 마우스 모델 개발 방법을. 비장내 주사와 C57BL/6 마우스를 활용하여 종양 유도 면역내성을 연구하고 치료 반응을 분석하는 유용한 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NIH / NCI R01 CA16435-01A1 (K. F. 스타벨리 - 오 캐롤, PI) 및 NIH / NCI R01CA208396 (마크 케스터, 광푸 리, 케빈 F. 스타벨리 - 오 캐롤)에 의해 지원됩니다.

참고: 동물 과목을 포함한 모든 절차는 미주리 대학의 IACUC에 의해 승인되었습니다. 모든 마우스는 "실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드"에 설명 된 기준에 따라 인도적 치료를 받았다. 세포 격리 및 예방 접종에 대한 다음 절차는 후드에서 수행해야합니다. 모든 연주자는 마우스와 조직을 처리하기 위한 표준 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.
1. 탄소 사염화물의 IP 주입으로 간 섬유증 과 간경변의 유도 (CCl4)
참고: 그림 1을 참조하십시오. (CCl4는 매우 위험한 시약이며, 내화학성 장갑을 착용하여 신중하게 취급해야 합니다.)
<ol><li>6~8주 된 수컷 C57BL/6J 마우스를 구하십시오(재료 표참조).</li>
	<li>원심분리기 튜브에 옥수수 오일에 10% CCl4 (v/v) 용액을 준비합니다. 주입할 마우스의 수를 기준으로 총 부피를 결정합니다(단계 1.6 참조).</li>
	<li>적절한 마우스 처리 기술을 사용하여 주사를 위해 하나의 마우스를 선택합니다.</li>
	<li>등쪽(복부) 측면을 위로 올려 마우스를 수동으로 제지합니다.</li>
	<li>70 % 알코올로 문질러 마우스의 복벽에 주사 부위를 청소합니다.</li>
	<li>25 게이지 일회용 바늘을 사용하여 복강 내 (IP) 주입으로 10 % CCl4 용액의 160 μL로 남성 C57BL / 6J 마우스를 주입하십시오.</li>
	<li>바늘이 경사면을 위로 올리고 15-20도에서 약간 기울어진 복벽 (약 4-5mm)을 통해 침투하도록하십시오.</li>
	<li>총 4주 동안 일주일에 두 번 마우스를 주사-각 마우스는 총 8회 주사를 받게 된다. 참고: 마지막 주사 후 2주, 처리된 마우스는 MTD2 마우스로부터의 종인 성 간세포의 ISPL 접종을 위해 준비되었다.</li>
</ol>2. 라인 MTD2 마우스에서 태그 형질 전환 간세포 분리
참고: 솔루션 레시피는 표 1을 참조하십시오.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Ca 또는 Mg가 없는 10x 얼의 균형 잡힌 소금 용액(Ca 또는 Mg이 없는 EBSS)</td>
			<td>KCl 4 g 68 g 나클 1.4 g NaH2PO4· 물 덱스트로스 10 g 1리터, pH에 4.32에 물을 추가 필터 통과</td>
		</tr>
<tr>
<td>솔루션 1</td>
			<td>Ca 또는 Mg가 없는 20 mL 10x EBSS 44 g 나코3 1.33 mL 1.5M 헤페 10 mL 의 10 mL EGTA 200 mL에 물을 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td>솔루션 2</td>
			<td>100 mL 10x EBSS 2.2 g NaHCO3 6.67 mL 1.5 M 헤페 1리터에 물을 추가합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.75% 콜라게나아제 용액</td>
			<td>콜라게나아제 15 mg 용액 20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>전체 매체</td>
			<td>2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x 페니실린-스트렙토마이신</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 솔루션 레시피.
<ol><li>종인 성 간세포의 공급원으로 작용하기 위해 라인 MTD2마우스(38)를 구한다.</li>
	<li>2.5% 이소플루란을 사용하여 5주령 MTD2 마우스를 마취시. 참고 : 적절한 마취는 발가락 핀치 방법으로 검사됩니다. 간단히 말해서, 두 손가락을 사용하여 마우스 발가락 / 발을 잘 짜내줍니다. 철수 반응이 없는 경우, 동물은 수술을 시작할 만큼 충분히 깊은 것으로 판단됩니다.</li>
	<li>적당히 진정되면 마우스를 척추 위치에 놓고 복부 표면의 적절한 노출을 제공하기 위해 테이프로 사지를 고정하십시오.</li>
	<li>간장의 적절한 노출을 제공하기에 충분히 큰 리냐 알바의 길이를 따라 가위를 사용하여 중간 선 개복절을 수행합니다.</li>
	<li>간과 포털 트라이어드의 더 나은 노출을 제공하기 위해 왼쪽으로 내장을 대체합니다.</li>
	<li>열등한 정맥카바(IVC)를 노출시키기 위해 간 위를 해부한다.</li>
	<li>동맥 클램프를 사용하여 간 위의 IVC를 리게이트합니다.</li>
	<li>간 경계의 열등한 국경으로 돌아가서 나비 바늘 (자료 참조)을 사용하여 포털 정맥에 IV 액세스 권한을 얻습니다. 손으로 카테터를 고정하십시오.</li>
	<li>연속적으로 8.9 mL /min에서 주사 주사기를 사용하여 마우스 간을 침전시키고 15 mL의 용액 1, 0.75 % 콜라게 나아제 용액 2 의 15 mL, 카테터를 통해 용액 2의 15 mL.</li>
	<li>PBS의 10-15 mL를 가진 50 mL 원추형 관에 MTD2 마우스에서 종양 질량을 절단하고 취하여 관류간을 수확하십시오.</li>
	<li>PBS를 제거하고 PBS로 추가 시간을 세척; 이 단계에서 원심분리기를 사용하지 마십시오.</li>
	<li>가위를 사용하여 작은 조각으로 간을 잘라 다음 남은 혈액을 제거하기 위해 PBS 2x로 다시 씻어.</li>
	<li>원뿔형 튜브에 5 mL의 완전한 RPMI 배지를 추가하고 가위로 간을 작은 조각 (&3 mm)에 지속적으로 다진 - 조직은 5 mL 파이펫을 원활하게 통과해야합니다.</li>
	<li>최종 부피에 완전한 RPMI를 추가하고 5 mL 파이펫을 사용하여 간을 일시 중단하십시오.</li>
	<li>혼합 용액을 70 μm 스트레이너로 50 mL 원엽 튜브로 필터링합니다.</li>
	<li>완전한 RPMI로 스트레이너를 여러 번 세척하고 RPMI 배지를 추가하여 최종 부피를 50 mL로 조정합니다.</li>
	<li>원심분리기로 서스펜션을 최대 500rpm까지 빠르게 회전시다. 속도가 50 x g로가속되면 원심 분리기를 중지해야합니다.</li>
	<li>PBS의 20 mL에서 상류및 펠릿을 중단한다.</li>
	<li>Trypan 청색 배제 및 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트한 다음, 다음세포 접종을 위해 세포 농도를 2.5 x 10 6/mL로 조정한다. 참고 : 종양 조직의 5 그램에서 예상 수율은 생존율 >95 %를 가진 8천만 개의 간세포입니다.</li>
</ol>3. ISPL 주입에 의하여 야생 형 C57BL/6J 마우스의 간으로 MTD2 마우스에서 간세포를 접종
<ol><li>무균 기술은 모든 절차에 사용되어야한다</li>
	<li>CCl 4-처리된수컷 C57BL/6J 마우스를 2.5% 이소플루란으로 마취시키고, 마우스는 눈이 마르지 않도록 눈윤을 치료해야 한다.</li>
	<li>주사를 위해 간세포의 200 μL로 주사기를 준비하십시오.</li>
	<li>적당히 진정되면 마우스를 왼쪽 위로 배치합니다.</li>
	<li>마우스의 왼쪽 측면 전체를 면도한 다음 70% 알코올과 베타딘을 세 번 번 갈아입어 부위를 문질러 냅니다.</li>
	<li>관리 5 카프로펜의 mg/kg 의 피하 수술 절개 전에.</li>
	<li>왼쪽 측면에 1cm 절개를 하여 척추 근육 바로 아래에서 등쪽 의 극단적 인 시작에서 13번째 갈비뼈와 평행하게 합니다.</li>
	<li>비장을 식별한 다음 무딘 뾰족한 집게를 사용하여 외부로 바뚝을 바타게 합니다.</li>
	<li>중간 크기의 티타늄 클립 두 개로 비장을 잘라냅니다. 비장 동맥과 정맥 사이에 두 클립을 놓고 접종 후 나중에 자르기 위해 클립 사이에 공간을 둡니다. 참고: 목표는 비장의 열등한 기둥을 분리하여 시드 위험을 줄이는 것입니다.</li>
	<li>27 G 바늘을 사용하여 비장의 열등한 기둥에 제조된 간세포의 200 μL(0.5백만)을 주입한다.</li>
	<li>페디클의 열등한 가지(열등한 비장 극 혈관)를 중간 크기의 클립 하나로 잘라냅니다.</li>
	<li>처음에 배치된 두 클립 사이에 비장을 잘라냅니다.</li>
	<li>종양 세포로 직접 주입한 비장의 열등한 기둥을 제거합니다.</li>
	<li>3-0 폴리글락틴(910)을 사용하여 내부 근육층을 닫아 개질을 방해하였다.</li>
	<li>멸균 된 강철 상처 클립을 사용하여 외부 피부 층을 닫습니다. 참고: 스틸 클립은 동물이 봉합사를 피하고 갈라진 상처를 남기지 않도록 봉합사보다 선호됩니다.</li>
	<li>관리 5 카프로펜의 mg/kg 의 피하 봉합사 후.</li>
	<li>모든 회복 동물을 온도 제어 가열 패드에 놓고 마취에서 완전히 회복될 때까지 면밀히 모니터링하십시오.</li>
	<li>수술 후 마우스에게 물을 무료로 이용할 수 있도록 하십시오. 마우스가 수술 중에 탈수되면 피하 유체 (&1 mL)를 투여하십시오.</li>
	<li>수술 후 7-10일 동안 피부 클립을 제거하십시오.</li>
</ol>

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<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliposome+C6-ceramide+increases+the+anti-tumor+immune+response+and+slows+growth+of+liver+tumors+in+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice.</a> Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).</li>
<li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein%2FSV40+T+antigen+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li>
<li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
</ol>

선언할 것이 없습니다.

이 프로토콜을 통해 우리는 인간 HCC 개시 및 진행을 모방하는 HCC의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 뮤린 모델을 확립했습니다. 임상적으로, 많은 위험 요소는 연속적으로 간 손상을 유도, 간 섬유증, 간경변과 HCC의 최종 단계. 우리의 프로토콜에서, CCl4의 IP 주입은 먼저 야생 형 마우스에서 간 섬유증을 생산하는 데 사용되며, 이는 후속 종양 발생 간 세포가 간 섬유증의 설정에서 종양을 형성 할 수 있게합니다. 우리는 종양 대형이 CCl4 처리 후에 2 주 후에 간세포 접종을 수신한 마우스에서 가장 성공적으로 일어났다는 것을 것을을 발견했습니다, 그밖 시간 점에 주사를 수신하는 마우스에 비해. 또한, 우리는 간 섬유증이 CCl4 주입 후에 4 달까지 검출될 수 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 접근은 CCl 4에 노출 없이 마우스에 비교된 HCC 종양을 개발하는 마우스의 90% 이상 에서유래합니다. 우리의 모형에서, 간세포는 C57BL/6J...

간세포암(HCC)은 미국에서 가장 빠르게 증가하는 유형의 암(미국)1,2,3. 매년 약 850,000개의 새로운 사례가4,5 및 700,000명의 환자가 이 치명적인질병으로6, 7,8,9,10으로 진단됩니다. 전 세계적으로 암 관련 사망의 두 번째로 높은 원인입니다. HCC의 관리는 외과적 절제술, 이식, 절제, 화학색전증, 또는소라페닙(sorafenib) 과같은 전신 요법을 포함한다. 외과 절제술 또는 이식으로 조기 진단 및 관리는 전체 생존 율이 가장 높은4. 불행하게도, 환자의 대다수는 나중 단계에서 나타나고 절제, 화학색전증 또는 sorafenib12를가진 관리를 요구합니다. 소라페닙, 수용 체 티로신 키 나 제 억제제 (RTKI), 에 식품 의약품 안전 청에 의해 승인 되었다 2008 절제 할 수 없는 HCC 치료에 사용할 수 있는 유일한 전신 약물 치료로. 약물은 전체 생존율이 7.9개월에서10.7개월13개월로소폭 증가하지만, HCC 관리에 활용될 수 있는 새로운 치료 전략을 제공했다.
확립된 암을 제거하기 위해 면역체계를 조작하는 것은 암 연구에서 급속히 성장하고 있는 분야이다14. 면역 검사점 연구는 암 치료15,16에서면역 치료 약물 개발을 상당히 진전하였다. FDA는 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4), 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 흑색종, 폐암, 두경부암 및 방광암 치료를 위한 리간드 PD-L1에 대한 항체(Abs) 사용을승인했다. 18세 , 19세 , 20.진행 중인 HCC의 치료를 위해 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4에 대하여 하나 또는 다중 항체를 이용한 단독요법 또는 병용 요법의 임상 시험이 진행 중이다21,22,23,일부 시험은 유리한 결과를 보여 주었다. 2017년, FDA는 소아페닙에 대한 내성이 있는 HCC 환자를 치료하기 위해 항 PD-1 항체에 대한 조기 승인을 승인했지만, 이 치료법의 전반적인 반응률은 14.3%에 불과합니다. 다른 전략은 이 때 임상 실습으로 번역되지 않았습니다24,25. 면역체크체크치료개선을위한종양유발심오한면역내성을극복26; 면역 체크포인트 치료의 효능을 예측; 면역 관련 부작용 방지; 최적화 관리 경로, 복용량, 그리고 주파수; 그리고 치료의 효과적인 조합을 찾는27,28,29 모두 매우 어려운 작업 남아있다.
현재 마우스 모델에서 HCC를 유도하는 데 사용되는 몇 가지 통상적인 접근법이 있으며, 조사자의 특정 연구 질문30에따라 활용되고 있다. 화학적으로 유도된 HCC 마우스 모델은 유해성 화합물을 가지고 상해 유발 악성을 모방한다. HCC 세포주의 자궁외 또는 직교 이식을 통한 이종이식 모델은 약물 스크리닝에 적합합니다. 많은 유전자 변형 마우스가 HCC의 병리생리학을 조사하도록 설계되었습니다. 바이러스 성 유전자를 발현 하는 형질 전환 마우스, 종양 유전자 및 성장 인자 간 암 선 에서 관련 된 경로의 식별을 허용. 본래의 한계로 인해, 이러한 모델은 인간 HCC에서 볼 수 있는 전형적인 면역 특성을 되풀이하지 않으며, 이는 근본적인 메커니즘의 해명과 혁신적인 면역 치료 전략의 개발을 크게 저해했습니다14 ,15. 우리는 최근에 임상적으로 관련있는 뮤린 모형을 만들었습니다. 이 새로운 모델은 인간 HCC 개시 및 진행을 모방할 뿐만 아니라 면역 기능 장애를 포함한 인간 질병의 가장 전형적인 특징을 반영합니다. 우리는 그것의 생물학적 및 면역학적 특성을 특징으로 합니다. 이 새로운 모델을 활용하여 HCC31, 32,33,34,35,36을치료하기 위한 다양한 면역 치료 전략을 탐구했습니다. 37. 이 독특한 플랫폼은 종양 유발 면역 내성의 메커니즘을 연구하고 최종 임상 번역을 향한 HCC에 대한 개념 증명 치료 전략을 개발할 수 있게 합니다.

<table><tbody><tr><td>마취 기계</td><td>VETEQUIP</td><td>IMPAC6</td><td>수술용 마취기</td></tr><tr><td>나비 바늘</td><td>BD</td><td>8122963</td><td>간 관류에 사용되는 바늘</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Jackson Lab</td><td>000664&nbsp;</td><td>Prototol에 사용된 마우스</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>CRESCENT CHEMICAL</td><td>20402</td><td>통증 방출용 Carprofen</td></tr><tr><td>Cell Strainer&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>REF 431751</td><td>셀 스트레이너, 70&micro; m, 간세포 격리용</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td>세포 격리용 원심분리기</td></tr><tr><td>클립&nbsp;</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 523700</td><td>티타늄 클립, 비장</td></tr><tr><td>현미경</td>용 <td>Zeiss</td><td>Primovert&nbsp;</td><td>세포 관찰을 위한 현미경</td></tr><tr><td>Mtd2 마우스</td><td>N/A</td><td></td><td>2002년 로스웰 파크 암 연구소에서 개최된 윌리엄 A 박사의 선물, 우리 실험실에서 유지</td></tr><tr><td>바늘</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td>BD precisionglide 바늘, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)</td></tr><tr><td>봉합</td>사 <td>ETHICON</td><td>J303H</td><td>코팅 VICRYL 봉합사</td></tr><tr><td>SV40 T Ag 항체</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>IHC 주사기 BD용 항-SV40 T-항원 항체</td></tr><tr><td></td><td></td><td>REF 309626</td><td>세포 주입용 1mL TB 주사기</td></tr><tr><td>Trypan blue SIGMA</td><td></td><td>T 8154</td><td>세포 생존율 테스트용 Trypan blue 용액</td></tr><tr><td>상처 클립</td><td>Reflex</td><td>reflex9, 부품 번호 201-1000</td><td>상처 닫힘용 스테인리스 스틸 상처 클립</td></tr></tbody></table>

간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

간세포암(HCC)의 전형적인 면역 특성을 다루는 임상적으로 관련된 동물 모델의 부재는 근본적인 메커니즘의 해명과 혁신적인 면역 치료 전략의 개발을 크게 저해했습니다. 인간 HCC를 재량화하는 이상적인 동물 모델을 개발하기 위해, 면역 적격 남성 C57BL/6J 마우스는 먼저 간 섬유증을 유도하기 위해 탄소 사염화물 (CCl4)주사를 받은 다음 젊은 남성으로부터 조직학적으로 정상 인간 세포체를 받습니다. SV40 T 항원 (TAg)-형질전환 마우스 (MTD2) 인트라 비장 (ISPL) 접종에 의해. 사춘기에 수용자 남성 마우스에서 생성 된 안 드로 겐 간 특이적 프로모터의 제어 하에 TAg 발현을 시작. 결과적으로, 전송된 간세포는 암세포가 되고 간 섬유증/간경변의 조정에 있는 종양 질량을 형성합니다. 이 새로운 모델은 간 섬유증/간경변의 맥락에서 인간 HCC 개시 및 진행을 모방하고 면역 기능 장애를 포함하여 인간 HCC의 가장 전형적인 특징을 반영합니다.

TAg-형질전환 마우스로부터 분리된 종인성 간세포(도2)를비장 내 주사에 의해 야생형 마우스의 간에서 파종하였다(도3). 이식된 간세포는 종양 특이적 항원 SV40 TAg(도 5)와 함께 정형암 HCC 종양을 성공적으로 안정적으로 성장시키고 간염증 및 섬유증의 설정에서 성장하였다(도1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59368/59368fig1.jpg"> 그림 1: HCC의 마우스 모델을 준비하기 위한 회로도. HCC의 혁신적인 뮤린 모델을 확립하기 위한 실험적인 디자인. C57BL/6J 마우스는 간 섬유증을 유도하기 위하여 4 주 동안 매주 두 번 CCl<su...

여기서, 간세포암(HCC)의 전형적인 면역 특징을 재기하는 간암의 임상적으로 관련 있는 뮤린 모델의 개발을 설명한다.

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

간세포암 질량 모델을 개발하기 위해 단지 모델을 사용하면 사람들이 종양으로 유도된 면역 편성 및 특정 치료 유도, 종양 면역 반응을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 간 섬유증 기술로 발전하는 치열토성 종양은 인간 간암의 임상 적 특징을 모방합니다. 이 방법은 간 세포암 면역학 연구에서 유용한 도구를 제공 할 수 있습니다.이 방법의 시각적 데모는 이 프로토콜의 성공적인 실행에 필수적인 내장 주입과 같은 기술적으로 어려운 단계를 설명할 수 있습니다. 다음으로, 수동으로 남성, 6 ~ 8 주 된 C57 블랙 6 마우스 등쪽 업을 억제합니다. 대체 70%에탄올과 베타딘 스크럽을 사용하여 주사 부위를 세 번 청소하십시오.그런 다음 관면 주사로 160 마이크로 리터의 탄소 테트라 클로리드를 마우스에 전달하고 동물을 홈 케이지로 돌려줍니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 5 개월 된 simian 바이러스 40 T 항원 형질 성 마우스에서, supine 위치에 마우스를 배치하고 테이프로 사지를 고정. 리나 알바의 길이를 따라 중간 라인 복강경 절개를 만들고, 간을 적절하게 노출시킬 수 있을 만큼 크고, 창자를 왼쪽으로 대체합니다.열등한 베나 카바를 노출하기 위해 간 위로 해부하십시오. 동맥 클램프를 유도하여 선박을 리디게이트합니다. 나비 바늘을 사용하여 포털 정맥에 정맥에 대한 정맥 내 액세스를 얻고 카테터를 수동으로 고정하십시오.각 솔루션에 대해 주사기를 신중하게 전환하여 15밀리리터 15밀리리터, 0.75%의 콜라게나아제 용액 2개, 카테터를 통한 콜라게나아제 없이 2밀리리터 15밀리리터를 분당 약 8.9밀리리터의 솔루션으로 성공적으로 제공합니다. 관류의 끝에서, PBS의 10 15 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원추형 관으로 종양 질량을 수확합니다. 방금 입증 된 대로 다음 MTD2 마우스에서 종양을 소비합니다.가위를 사용하여 간을 작은 조각으로 자릅니다. 조직을 신선한 PBS의 새로운 용기로 옮기고 조직으로부터 나머지 혈액을 제거한 후 조직 조각을 5밀리리터 원칼 튜브로 이송하여 완전한 RPMI 배지의 5밀리리터를 함유한다. 조각이 5 밀리리터 파이펫의 끝을 통해 쉽게 들어갈 수 때까지 세척 된 간 샘플을 다진다.튜브에 충분한 매체를 추가하여 30 밀리리터의 최종 볼륨에 도달합니다. 5밀리리터 파이펫을 사용하여 조직 조각을 세절화한 후 70마이크로미터 스트레이너를 통해 새로운 50밀리리터 튜브로 용액을 필터링합니다. 완벽한 매체로 여과기를 여러 번 씻으세요.최종 볼륨을 50밀리리터로 조정하여 추가로 완전한 배지를 추가로 조정합니다. 원심분리기를 멈추고 상체를 탈착하기 전에 원심분리를 최대 50배까지 빠르게 회전시합니다. 그런 다음 계산을 위해 PBS의 20 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.MTD2 간세포의 내장 주입을 위해 마우스 당 220 마이크로 리터의 간세포와 각 받는 동물 당 27 게이지 바늘을 장착 한 밀리리터 주사기를로드합니다. 마취, 탄소 테트라 클로라이드 처리 동물에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 척추 근육 바로 아래에서 시작하여 왼쪽 측면에 1센티미터 절개를 하여 등기둥 익스트림에서 13번째 갈비뼈와 평행하게 만들고 무딘 뾰족한 포셉을 사용하여 비장을 외장화합니다.비장 동맥과 정맥 사이에 두 개의 중간 크기의 티타늄 클립으로 비장을 잘라 비장의 열등한 극으로 200 마이크로 리터를 전달합니다. 페디클의 열등한 분기를 하나의 중간 크기의 클립으로 클립하고 처음에 배치된 두 클립 사이에 비장을 잘라냅니다. 종양 세포로 직접 주입된 비장의 열등한 극을 제거하고 3-0 폴리글락틴(910)을 사용하여 내근육층을 닫기 위해 봉합을 중단하였다.그런 다음 멸균 된 강철 상처 클립을 사용하여 외부 피부 층을 닫고 1킬로그램당 5 밀리그램을 피하시 투여합니다. 입증된 바와 같이 T 항원 형질성 마우스로부터 의 절연 후, 간세포와 종양 침투 세포 모두 관찰될 수 있다. 세포는 전형적으로 처리 후에 거의 100% 생존성을 보여줍니다.야생형 탄소 테트라클로리드 처리 동물로 내장 접종 후 이식된 간세포는 종양 특이적 시미안 바이러스 40 T 항원인정형세포암 종양을 성공적으로 안정적으로 성장시키고 안정적으로 성장한다. MTD2 질량에서 간세포의 실행 가능하고 순수한 인구의 준비와 내장 주사의 정확한 관리는 절차의 성공에 중요합니다. 우리 팀은 자궁 내 및 관면 주사를 통해 받는 쥐로 간세포 접종을 테스트했지만, 이러한 다른 방법은 정형 외 간 세포 암을 유도 할 수 없었다.이 모델은 면역 감시및 종양 진행의 초기 및 후기 단계에서 내성을 위한 조사를 가능하게 하는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 탄소 테트라클로리드를 사용할 때는 독성이 있으므로 주의하십시오.

an-oncogenic-hepatocyte-induced-orthotopic-mouse-model-hepatocellular

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

주요 인간 autoantigen을 표현 아데노 바이러스와 생쥐의 감염은 CYP2D6의 광범 간염, 섬유증 및 생성을 특징으로 면역 - 매개 간 질환의 영구적인 형태로 제 2 형자가 면역 간염 결과에서 고통받는 환자 세라 인정 P450 2D6 (hCYP2D6)를 시토크롬 특정 면역 반응.

CYP2D6 동물 모델 : 마우스에 면역 간염을 유발하는 방법

면역 결핍 쥐에서 인간 종양 이종 이식은 암 생물학을 연구하는 중요한 도구입니다. 인간의 간세포 암 세포 또는 종양 파편에서 피하 및 간내 이종 이식을 생성하는 특정 프로토콜이 설명되어 있습니다. 받는 사람 생쥐의 부분 간 절제술에 의해 유도 된 간 재생은 간내 생착을 촉진하기위한 전략으로 제시된다.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

담즙 흐름의 중단은 형태학적 변화의 특징적인 시간 의존적 순서와 함께 심각한 염증성 담즙 유발성 간 손상을 초래합니다. 여기에서는 21일에서 28일 후에 강한 섬유화 반응을 유도할 수 있는 마우스의 총담관 수술 결찰에 대한 프로토콜을 제시합니다.

마우스의 담관 결찰 : 폐쇄성 담즙에 의한 염증성 간 손상과 섬유화의 유도

암의 전이 확산 암 관련 사망의 주요 원인이다. 우리는 고형 장기의 종양에서 전이의 메커니즘을 연구하기위한 "환자와 같은"동 소성 동계 마우스 모델 시스템 구축을위한 우리의 생존 수술 방법에 대한 심층적 인 설명을 제공한다.

&quot;환자와 같은&quot;동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

이 프로토콜은 섬유성 기질 구획을 동반한 3D 생체 모방 모델을 제공합니다. 생리학적으로 관련된 하이드로겔을 사용하여 기질 세포 외 매트릭스의 생체 물성 특성, 세포 상호 작용, 종양 성장 및 전이의 활성 중재자를 모방합니다.

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

결장직장암(CRC) 오가노이드의 포털 정맥 주사는 스트로마가 풍부한 간 전이를 일으킨다. CRC 간 전이의 이러한 마우스 모델은 종양-스트로마 상호작용을 연구하고 아데노-관련 바이러스-매개 유전자 요법과 같은 신규한 스트로마-지시 치료제를 개발하는데 유용한 도구를 나타낸다.

간 전이 스트로마를 연구하기 위해 대장암 오가노이드의 포털 정맥 주사

여기에서 우리는 간동맥 결찰을 포함하거나 포함하지 않는 동소 간세포 암종 이종이식편을 만들고 [18 F]플루오로미소니다졸([18 F]FMISO) 및 [18F]플루오로데옥시글루코스([18F]FDG).

간세포 암종의 동소 마우스 모델에서 비침습적 PET/MR 이미징

환자 종양에서 생성된 오가노이드를 생쥐 간에 항소적으로 주입합니다. 종양이 없는 간 조직의 절제는 종양이 위치한 간 조직에 재생 환경을 조성합니다.

간 재생이 종양 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 간세포 암 환자 유래 오가노이드 이종이식 모델

부분 2/3(66%) 간절제술의 마우스 모델은 문헌에 잘 설명되어 있지만, 간 이식 후 소형 증후군을 모방한 더 확장된 간절제술은 거의 사용되지 않았습니다. 우리는 건강한 마우스에서 약 50%의 수술 후 치사율을 초래하는 마우스 모델에서 확장된 78% 간 절제술 절차에 대해 설명합니다.

마우스 수술 모델에서 확장된 78% 간절제술

이 프로토콜은 간별 세포 형태를 온전한 간 조직에서 시각화하고 모델링하기 위한 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 이 접근법은 마우스 유전학을 이용한 형광 표 지, 현장 간 관류 기반 조직 준비, 그리고 광학 투명성을 달성하기 위한 수정된 iDISCO 조직 클리어링 방법을 결합합니다.

간 섬유증 마우스 모델에서 간 별형 세포 형태 매핑

학습하세요 간섬유증 기법을 이용한 간세포암 정위 종양 마우스 모델 개발 방법을. 비장내 주사와 C57BL/6 마우스를 활용하여 종양 유도 면역내성을 연구하고 치료 반응을 분석하는 유용한 도구를 제공합니다.

간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델

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