Name: 다른 식물 종에서 촬영 정점 Meristems의 confocal 라이브 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 배우세요 레이저 공초점 현미경을 이용한 다양한 식물 종의 촬생 정점 분생조직 라이브 영상법을. Arabidopsis, 토마토, 대두에서 고해상도 세포 구조를 고정 없이 관찰하여 식물 생장과 발달 연구에 효율적인 프로토콜을 제공합니다.

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레이저 confocal 현미경 검사에 액세스 하기 위한 그리고 기술 지원에 대 한 저자 퍼듀 Bindley 생명과학 센터 이미징 시설을 인정 하 고 저자 앤디 Schaber 퍼듀 Bindley 이미징 시설에서에서 도움을 주셔서 감사 합니다. 이 활동은 Purdue 대학 인디애나의 농업 및 농촌 개발을 지원 하기 위해 자금 AgSEED 교차로의 한 부분으로에 의해 투자 되었다.

1. 미디어와 이미징 요리 준비
<ol><li>MS 판: 이온된 물으로 重 & Skoog MS 중간, 1% 천 x 0.5를 추가 하 고 다음 pH 5.8 수산화 칼륨 솔루션을 사용 하 여를 조정 (선택 사항: 장기 식물 성장에 대 한 1% 자당을 추가). 오토 클레이 브 및 부 접시입니다.</li>
	<li>요리를 이미징: 0.5-0.8을 플라스틱 페 트리 접시 (6 c m, 깊이 1.5 c m)를 채우기 1.5% 녹은 agarose와 cm.</li>
</ol>2. 식물 성장
<ol><li>
애기 성장<ol>
<li>MS 판에 소독된 씨앗을 뿌리 다 고 2 일에 대 한 접시 4 ° C이 하를 배치 합니다. 그런 다음 짧은 데 MS 판 이동 (8 h 빛 / 어둠 16 h), 2 주 동안 22 ° C에서.</li>
		<li>토양에 모 종을 이식 하 고 짧은 하루에 그들을 성장 (8 h 빛 / 어둠 16 h) 4 주 동안 22 ° C에서.</li>
		<li>식물 생식 단계 및 꽃이 핌 SAMs 이미징는 식물에서 전환 유도에 22 ° C에서 연속 빛을 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>토마토와 콩 성장<ol>
<li>그들은 발 아까지 젖은 필터 종이 28 ° C 미만으로 덮여 씨앗을 품 어.</li>
		<li>토양에 모 종을 이식 하 고 긴 하루에 그들을 성장 (16 h 빛 / 8 h 어두운) 식물 SAMs 이미징에 대 한 1 주일 이상 25 ° C에서.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 촬영 꼭대기의 해 부
<ol><li>화 서 촬영 꼭대기의 해 부<ol>
<li>면도날으로 볼트 애기 식물에서 1-2 cm 주요 줄기와 함께 꽃이 핌 촬영 꼭대기를 잘라. 주요 줄기의 기저 부분 누른 보석 집게와는 peduncles 개 해 부에 의해 주요 줄기에서 가능한 많은 더 오래 된 꽃 장기를 제거 합니다. 주의: 면도날을 사용 하 여 절단 손가락을 피하십시오. 적절 한 sharps의 컨테이너를 사용된 하는 면도날의 처분.</li>
		<li>보석 포 셉 또는 분야는 stereomicroscope의 손가락 촬영 꼭대기의 연결 된 줄기를 잡고, 꽃의 나머지 부분을 제거 하는 거의 전체 SAM는 접 안경에서 볼 수 있습니다 때까지 계속. 주요 줄기의 교차점에서 명확 하 게 peduncles 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>식물 촬영 꼭대기의 해 부<ol>
<li>토마토 또는 콩 식물 SAMs를 보려면 cotyledons, 밖으로 해 부, 및 식물에서 뿌리.</li>
		<li>아래는 stereomicroscope 식물의 hypocotyls 고 추가 취재 보석 집게를 사용 하 여 식물 SAMs 잎 primordia 밖으로 해 부.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 얼룩
<ol><li>SAMs에 세포를 직접 시각화 하려면 갓된 propidium 요오드 화물 (PI) 솔루션을 사용 하 여 세포 벽 얼룩. 살 균 이온에 PI 분말 분해, 1 mL PI 얼룩 솔루션 1 mg/mL의 농도에서 만들고 알루미늄 호 일로 덮여 microcentrifuge 관에서 PI 솔루션을 저장.</li>
	<li>50 µ L PI 솔루션에서 깨끗 한 플라스틱 하 고 빈 페 트리 접시와 딥 전체 해 부 촬영 정점 2 분 린스에 대 한 염료로 얼룩진된 촬영 정점 살 균, 이온을 제거 된 물에 두 번. 착 색 과정은 전체 화 서 샘 또는 식물 샘 균일 한 얼룩을 달성 하기 위해 PI 솔루션에 젖어.</li>
</ol>5. 이미지 모음
물 담그고 렌즈 x 20는 SAMs는 똑바로 confocal 현미경을 사용 하 여 몇 군데는 모두이 방법에 대 한 참고:와. 다른 프로토콜9,12,,1315에 설명 된 대로 그것은 또한 가능한 이미지 SAMs는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여. 또한, 라이브 영상 같은 샘플 준비 단계 confocal 현미경의 다른 브랜드를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 이 연구에서 이미징 단계 예를 들어 자세히 설명 합니다.
<ol><li>집게를 사용 하 여 이미징 접시의 중앙에 구멍을 뚫 고 매체에 얼룩진된 촬영 꼭대기를 직 립 스틱.</li>
	<li>샘플을 완전히 몰입할 수 살 균, 이온을 제거 된 물으로 이미징 접시를 채우십시오. 스테레오 현미경에서 보기, 피 펫 여기저기 기포를 제거 하는 분열 조직 주위 갇혀. 그런 다음, 샘 바로 위에 완벽 하 게 볼 수 있는지 확인 한 천에서 줄기의 각도 조정 합니다.</li>
	<li>공초점 현미경의 샘플 단계에 이미징 접시를 놓습니다. 낮은 물 찍기 렌즈 하며 현미경 샘플 단 물으로 렌즈 딥의 팁을 하도록 합니다.</li>
	<li>공초점 현미경 소프트웨어 열고는 접 안경에 명시에는 샘을 찾습니다. XY 컨트롤러 조정 통해 대물 렌즈 아래 샘 샘플 오른쪽 이동 후 Z 컨트롤러를 조심 스럽게 조정 통해 접 안경에서 샘에 초점.</li>
	<li>공초점 현미경 소프트웨어에 인수 함수 작동는 라이브 모드 컴퓨터 화면에서 샘플을 확인 하 고 실험을 스캔 하는 레이저에 대 한 모든 매개 변수를 설정 하는 ( 테이블의 자료참조) 시작.<ol>
<li>매개 변수를 조정할 때는 범위 표시기 기능을 사용 하 여 신호 포화 여부를 정의 하.</li>
		<li>필요에 따라 선택한 confocal 파일에서 모든 매개 변수 설정을 다시 로드 하려면 다시 사용할 함수를 적용 합니다. 참고: 매개 변수를 이미징 제안: 선 (여기) 레이저: 515 nm 또는 561 nm; 방출 570-650 nm; 홀: 1 공기 단위 (AU); 이득: 600-750, 스캔 모드: 프레임; 프레임 크기: 512 X 512 또는 1024 X 1024; 스캔 속도: 최대; 7 검색 방향: 양방향-방향; 평균 번호: 2-4; 평균 방법: 의미; 비트 깊이: 16 비트; 스캔 간격: 0.5-1 µ M. 또한, 다른 식물 샘플 및 특정 이미징 요구의 성격에 따라 이러한 모든 매개이 변수를 최적화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 이미지 처리
<ol><li>광학 직교 및 가로 섹션 보기 시각화, 영상 획득에 대 한 같은 상용 소프트웨어를 사용 합니다. 원래 confocal 파일을 열고, 수직 메뉴 클릭, 직교 선택. 다음 선택 중 하나 x 위치, y 위치 및 z 이미지의 위치 이미지를 tiff 파일로 저장.<ol>
<li>3D 거리 함수 스택에서 공초점 이미지의 선정 된 두 점 사이의 실제 거리를 정의를 선택 합니다.</li>
		<li>또는 피지/이미지 J, 직교 및 가로 섹션 보기를 시각화 하기 위해 오픈 리소스 이미지 처리 패키지를 사용 하 여.</li>
		<li>피지와 원래 confocal 파일을 열고, 이미지 메뉴를 클릭, 스택 선택한 다음 직교 보기를 선택 하십시오.</li>
		<li>중간 위치에 XY, YZ, 및 XZ 평면을 선택 하 고 이미지를 Tiff 형식으로 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D 투명 한 투영을 시각화에 대 한 동일한 소프트웨어를 사용 합니다.<ol>
<li>원래 confocal 파일, 3D 메뉴를 클릭 열고 선택 투명 3D 투영 뷰를 생성 하.</li>
		<li>필요에 따라 3D 메뉴를 클릭, 모양을 선택한 후 투명도 임계값, 램프 및 최대 를 포함 하 여 3D의 투명성에 대 한 투영의 3 개의 매개 변수를 조정 이미지입니다.</li>
		<li>3D 메뉴 모양, 선택한 빛 3D 이미지의 밝기를 조정 하려면 선택 합니다.</li>
		<li>영사 된 이미지를 내보내고 Tiff 파일로 그들을 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 차원 최대 강도 프로젝션, 시각화에 대 한 동일한 소프트웨어와 함께 confocal 파일을 열고 3D 메뉴를 클릭 합니다.<ol>
<li>3D 메뉴 를 선택 하 고 최대선택 하십시오.</li>
		<li>또는 피지/이미지 J를 사용 하 여 3D 최대 강도 투영을 시각화.</li>
		<li>피지와 원래 confocal 파일을 열고, 이미지 메뉴 를 클릭 하 고 스택을 선택 합니다.</li>
		<li>3D 프로젝트 를 선택 하 고 이미지를 Tiff 형식으로 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D 이미지의 보기를 코딩 하는 깊이 시각화에 대 한 동일한 소프트웨어를 사용 합니다.<ol>
<li>3D 메뉴 를 클릭 하 고 선택 하는 모습.</li>
		<li>특별 한 선택 하 고 깊이 코딩.</li>
		<li>또는 피지/이미지 J을 사용 하 여 보기를 코딩 하는 깊이 시각화.</li>
		<li>오픈 confocal 파일, 클릭 이미지 메뉴 Hyperstack선택합니다.</li>
		<li>측 색 코드 를 선택 하 고 이미지를 Tiff 형식으로 저장. 참고: 깊이 코딩 z-스택 또한 얻을 수 있습니다 플러그인 Z 코드 스택 피지를 통해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D 시각화 표시 (영화 1 및 영화 2), 회전 보기 동일한 소프트웨어를 사용 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>Confocal 파일을 열고, 3D 메뉴를 클릭 하 고 시리즈를 선택 합니다.</li>
		<li>렌더링 시리즈를선택 하 고 x, y를 돌아서, 시작과 끝, 그리고 돌아서 위치 목록을 포함 하 여 4 개의 옵션 중 하나를 선택 합니다.</li>
		<li>AVI 파일로 렌더링 시리즈를 저장 합니다.</li>
		<li>또는 피지/이미지 J를 사용 하 여 3D 회전 보기 시각화.</li>
		<li>피지와 원래 confocal 파일을 열고, 이미지 메뉴를 클릭 하 고 스택을 선택 합니다.</li>
		<li>3D 프로젝트 를 선택 하 고 AVI 포맷 비디오로 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+cell+division+patterns+in+developing+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of cell division patterns in developing plants.</a> Cell. 88 (3), 299-308 (1997).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+arabinosyltransferases+controls+shoot+meristem+size+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.</a> Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).</li>
<li>Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+in+maize+kernel+row+number+is+controlled+by+the+FASCIATED+EAR2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus.</a> Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).</li>
<li>Je, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+maize+organ+primordia+via+FASCIATED+EAR3+regulates+stem+cell+proliferation+and+yield+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits.</a> Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).</li>
<li>Ping, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dt2+is+a+gain-of-function+MADS-domain+factor+gene+that+specifies+semideterminacy+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean.</a> Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. G., Jones, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+angiosperm+inflorescence+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the angiosperm inflorescence apex.</a> Nature. 171, 751(1953).</li>
<li>Sijacic, P., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+from+live-imaging+in+shoot+meristem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel insights from live-imaging in shoot meristem development.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).</li>
<li>Tax, F. E., Durbak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristems+in+the+movies%3A+live+imaging+as+a+tool+for+decoding+intercellular+signaling+in+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems.</a> Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).</li>
<li>Grandjean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+cell+division%2C+cell+growth%2C+and+differentiation+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+to+study+cell+division+orientation+in+the+Arabidopsis+shoot+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+Imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).</li>
<li>Prunet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131, 4225-4237 (2004).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Shoot+Meristems+on+an+Inverted+Confocal+Microscope+Using+an+Objective+Lens+Inverter+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAIRY+MERISTEM+with+WUSCHEL+confines+CLAVATA3+expression+to+the+outer+apical+meristem+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers.</a> Science. 361 (6401), 502-506 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stem+cell+maintenance+by+transcriptional+cross-regulation+of+related+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases.</a> Development. 142 (6), 1043(2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEAFY+Controls+Auxin+Response+Pathways+in+Floral+Primordium+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation.</a> Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리가 설명 사소한 수정, 다른 식물에서 촬영 정점 meristems의 연구에 적용할 수 있는 간단한 이미징 방법 모델 식물에서 식물 및 생식 단계에서 분열 조직 규칙을 공부 하는 새로운 길을 열기와 작물입니다. 현미경 및 조직학 얼룩 방법을 달리이 프로토콜 표면 보기와 노동 집약적인 샘플 고정 및/또는 단계를 구분 하는 조직에 대 한 필요 없이 SAMs의 내부 세포 구조를 공개 도울 수 있다. 이 프로토콜은 또한 잠재적으로 제공 하는 주요 유전자와 SAM16에서에서 단백질의 표정 패턴의 3 차원 보기를 얻을 수 있는 좋은 셀룰러 해상도 SAMs에 기반으로 하는 형광 기자에 대 한 설립된 이미징 방법에 호환 ,17,,1819. 또한, 여기에 설명 된 절차를 처리 하는 관련된 이미지 크게 도움이...

식물 분열 조직 미 분화 줄기 세포의 수영장을 포함 하 고 지속적으로 격려 하 고 식물의 기관 성장과 개발1. Postembryonic 개발 하는 동안 식물의 거의 모든 지상 직물은 싹 정점 분열 조직 (SAM)에서 파생 됩니다. 작물, 활동 및 SAM과 그 파생된 꽃 meristems의 크기는 촬영 아키텍처, 과일 생산, 씨 수확량 등 많은 농경 특성 밀접 하 게 연관 된다. 예를 들어 토마토, 확대 샘 하면 촬영 및 꽃이 핌 분기, 증가 하 고 따라서 여분의 꽃 및 과일 장기2생성 결과. 옥수수에서 SAM 크기 증가 더 높은 씨 수 및 총 수익률3,4이끌어 낸다. 콩, 분열 조직 불확정성 촬영 아키텍처에 밀접 하 게 연관 이며 또한5항복.
형태학 및 SAMs의 여러 가지 방법으로, 조직학 단면/얼룩 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM)6를 포함 하 여 둘 다 크게 제공을 통해 분열 조직 연구 고급 나타낼 수 있다 중 단면 보기 또는 SAMs의 3 차원 (3D) 표면 보기. 그러나, 두 방법 모두 시간이 걸리고, 데이터 수집, 샘플 준비에서 몇 가지 실험 단계를 포함 되며 이러한 메서드는 주로 고정된 샘플에 따라 달라 집니다. 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 기술에서에서의 최근 발전 이러한 한계를 극복 하 고 세포의 구조 및 식물 조직 및 장기7,8의 발달 과정을 조사 하는 강력한 도구를 제공. 통해 물리적 조직 보다 광 단면, confocal 현미경 검사 법 수 수 일련의 z-스택 이미지 및 이미지 분석 소프트웨어를 통해 샘플의 후속 3D 재구성의 컬렉션.
여기, 우리 둘 다 내부 조사에 대 한 효율적인 절차에 설명 하 고 다른 생활 SAMs의 표면 구조 식물 종 레이저 confocal 현미경 검사 법, 잠재적으로 모든 실험을 수행 하는 연구를 수 있는 스캔을 사용 하 여 프로세스 내에서 20 분으로 짧은. 애기 꽃이 핌 SAMs9,10,11,12,,1314의 라이브 confocal 영상에 대 한 다른 게시 된 방법에서 다른 15 와 애기 꽃12,13, 여기이 프로토콜은 매우 효율적인 모델 종 뿐만 아니라 식물 촬영의 꽃이 핌 meristems 뿐만 아니라 공부에 대 한 설명 토마토, 콩 등 다른 작물에서 정점 meristems. 이 방법은 유전자 변형 형광 표식에 의존 하지 않는 하 고 잠재적으로 많은 다른 종 및 재배 품 정에서 촬영 meristems 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 또한 간단한 이미지 보기 및 3D 뷰에서 다른 SAMs를 분석 하기 위한 단계를 처리 소개 합니다. 함께 찍은,이 간단한 방법을 더 나은 구조와 모형 유기 체 및 작물에서 meristems의 발달 과정을 이해 하는 연구를 촉진 한다.

<table><tbody><tr><td>한천 Phyto</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSA20300-1000</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>도트 사이언티픽 Inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4955</td><td>Dumont #5SF 초미세 집게 Inox 팁 크기 .025 x .005mm, 새싹 apices 해부용.</td></tr><tr><td>LSM 880 정립 컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>자이스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>무라시게 & Skoog MS 미디엄</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSM10200-50</td><td></td></tr><tr><td>Plan APO 20x/1.1 수침 렌즈</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시 100 mm X 15 mm</td><td>CELLTREAT Scientific 제품</td><td>229694</td><td>MS 플레이트를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시60 mm X 15</td><td>CELLTREAT Scientific 제품</td><td>229665</td><td>이미징 접시로 사용</td></tr><tr><td>번식 믹스</td><td>Sungro 원예</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Acros Organics</td><td>는</td><td>세포벽을 염색하기 위해 물에 1 mg / mL 용액</td>을 440300250</tr> 면<tr><td>도날</td><td>PERSONNA</td><td>62-0179</td><td>식물에서 싹 정점을 절단하기 위해</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Zen black</td><td>Zeiss</td><td></td><td>이미지 수집 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

다른 식물 종에서 촬영 정점 meristems의 confocal 라이브 영상

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

줄기 세포 보존된 저수지와 그것으로 촬영 정점 분열 조직 (SAM) 함수 postembryonic 개발 하는 동안 거의 모든 지상 직물을 생성 합니다. 활동 및 SAMs의 형태학 생식 기관, 그리고 가장 중요 한 것은, 곡물 수확량의 촬영 아키텍처, 크기와 같은 중요 한 농경 특성을 결정합니다. 여기, 우리는 레이저 confocal 현미경 검사를 통해 표면 형태와 다른 종에서 살아있는 SAMs의 내부 세포의 구조를 분석 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 내에서 높은 해상도의 3 차원 (3D) 이미지 수집 샘플 준비에서 모든 절차를 수행할 수 있습니다 짧은 20 분. 이 프로토콜은 고효율 화 서 조직과의 개발을 공부 하는 간단 하지만 강력한 도구를 제공 하는 모델 종 뿐만 아니라 다른 작물에서 식물 meristems의 SAMs 뿐만 아니라 공부에 대 한 설명 다른 식물 종에 걸쳐 meristems입니다.

우리의 프로토콜의 효율성을 평가 하 고 하 여는 meristems의 형태를 다른 종, 우리 애기 에서 화 서 분열 조직에서 식물 meristems에 confocal 라이브 이미징 실험을 수행 했습니다. 둘 다 토마토와 콩입니다. 이 연구, 애기 ecotype 란 츠 베르크 erecta, 토마토 품종 마이크로 톰, 콩 품종에서 윌리엄스 82 예제로 사용 되었습니다.
애기 샘의 중간을 통해 직교 섹션에서 볼 때, 그것은 분명 PI 여러 세포 층 (그림 1A)에서 거의 모든 세포에서 가로 벽 얼룩 수 있었습니다.  화 서 샘의 모음을 통해 한 횡 근 섹션에서 XY 평면에서 셀은 또한 명확 하 게 몇 군데 (그림 1B...

이 프로토콜 라이브 이미지 촬영 정점 meristems 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다른 식물 종에서 분석 하는 방법을 제공 합니다.

다른 식물 종에서 촬영 정점 Meristems의 confocal 라이브 영상

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

apical 메리스템 제어 식물의 성장과 번식을 촬영합니다. 이 방법은 우리가 모델 종뿐만 아니라 다른 작물에서 뿐만 아니라 촬영 apical 메리스템의 형태와 내부 구조를 조사하는 데 도움이됩니다. 이 기술은 매우 효율적인 절차입니다.촬영 apical 메리스템은 노동 집약적 인 샘플 고정 및 조직 단면 단계없이 높은 세포 해상도로 직접 시각화 할 수 있습니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 애비독증, 토마토 및 대두 식물을 성장시려면. 볼트 아라비도시스 식물에서 꽃발광 촬영 정점을 잘라.주요 줄기의 기저 부위를 잡고, 주 줄기에서 가능한 한 많은 오래된 꽃 장기를 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 촬영 apical 메리스템이 안구에서 볼 수 있을 때까지 스테레오 현미경의 필드에 있는 꽃의 나머지 부분을 계속 제거합니다. 토마토 나 대두에서 식물 촬영 정액 메리스템을 보려면 식물의 코틸레톤, 잎 및 뿌리를 해부하십시오.스테레오 현미경 아래 식물의 저혈압을 잡고, 더 식물 촬영 apical 메리 스템을 덮고 잎과 잎 원시를 해부하는 집게를 사용합니다. 깨끗하고 빈 페트리 접시에 프로피듐 요오드 용액의 파이펫 50 마이크로 리터. 해부된 촬영 정점을 2분간 염료에 담급다.염색 과정에서 전체 플로럴레스세니언 촬영 에액칼 메리스템 또는 식물 성 메리스템을 프로디움 요오드 용액에 몰입하여 균일한 염색을 달성하십시오. 멸균, 탈온 물에 두 번 스테인드 촬영 정점을 헹구. 이제, 포셉을 사용하여 준비된 이미징 접시의 중앙에 구멍을 뚫고, 스테인드 촬영 정점을 매체에 똑바로 붙입니다.이미징 접시를 멸균된 탈온된 물로 채우면 시료를 완전히 담급니다. 스테레오 현미경을 통해 샘플을 볼 수 있습니다. 피펫을 위아래로 움직여 메리스템 주변에 갇힌 기포를 제거합니다.그런 다음, 화고에서 줄기의 각도를 조정하여 촬영 에피칼 메리스템이 바로 위에서 완전히 볼 수 있는지 확인합니다. 지금, 공초점 현미경의 견본 단계에 화상 진찰 접시를 놓습니다. 수질 담그렌즈를 낮추고 현미경 샘플 스테이지를 올려 렌즈 의 끝이 물에 담그도록 합니다.공초점 현미경 소프트웨어를 열고, 찾고 밝은 필드에서 촬영 apical 메리 스템에 초점을 안구를 사용합니다. 공초점 현미경 소프트웨어에서 획득 기능을 운영합니다. 라이브 모드를 시작하여 컴퓨터 화면에서 샘플을 보고 레이저 스캐닝 실험의 모든 매개 변수를 설정합니다.매개 변수를 조정할 때 범위 표시기 함수를 사용하여 신호가 포화 상태인지 여부를 정의합니다. 이미징 수집에 사용된 동일한 소프트웨어를 사용하여 3차원 투명 프로젝션을 시각화할 수 있습니다. 원래 공초점 파일을 열고 3D 메뉴를 클릭하고 투명을 선택하여 3D 프로젝션 뷰를 생성합니다.선택적으로 투명도를 선택하여 3D 이미지의 투명도에 대한 임계값, 램프 및 최대값을 포함하여 투영의 세 가지 매개 변수를 조정합니다. 이제 라이트를 선택하여 3D 이미지의 밝기를 조정합니다. 투영된 이미지를 내보내고 TIFF 파일로 저장합니다.3D 이미지의 깊이 코딩 뷰를 시각화하기 위해 동일한 소프트웨어를 사용합니다. 다시 3D 메뉴를 클릭하고 모양을 선택합니다. 특수를 선택하고 깊이 코딩을 선택합니다.투영된 이미지를 내보내고 TIFF 파일로 저장합니다. 아라비도시스 의 중간을 통해 직교 섹션에서이 이미지는 수평 벽이 여러 세포 층에서 거의 모든 세포에서 프로피듐 요오드로 얼룩진 것을 보여줍니다. 꽃무성의 코퍼스를 통과하는 하나의 횡단 구간의 뷰는 정량적 메리스템의 세포도 명확하게 이미지된다는 것을 보여줍니다.3D 프로젝션 뷰는 꽃무늬 메리스템이 돔과 같은 구조를 형성하고 개발 중인 꽃 원시에 둘러싸여 있음을 보여줍니다. 토마토 촬영의 중간을 통해 직교 섹션에서 이 이미지는 또한 깊은 내부 영역에서 프로피듐 요오드 신호가 약간 낮지만, 여러 세포 층에서 프로피듐 요오드로 염색되는 수평 벽이 있음을 보여줍니다. 식물 촬영 의 깊은 층을 통해 하나의 횡단 섹션에서 이미지는 XY 평면과 식물성 메리 스템과 잎 원시 사이에 형성 된 경계에서 세포를 드러낸다.3D 프로젝션 뷰는 토마토에서 식물성 메리스템의 모양과 조직에 대한 포괄적인 뷰를 더욱 제공할 수 있습니다. 여기에 표시된 대두 촬영 의 중간을 통해 직교 보기 apical 메리 스템과 동일한 촬영 apical 메리 스템의 3D 프로젝션. 돔 같은 식물성 메리스템과 유래된 새로운 잎 프리모르디아도 관찰할 수 있습니다.프로피듐 요오드쉽게 손상 되 거나 죽은 세포를 얼룩 수 있습니다., 크게 이미지의 품질에 영향을 미칠 것입니다., 그래서 촬영 apical 메리 스템 샘플을 준비 하는 동안 어떤 물리적 손상을 방지 하는 것이 중요 하다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 stomatal 차별화를 문서화, 개발 며칠 동안 표피의 공 촛점 이미징을위한 식물 cotyledons를 고정하기 위해 챔버 슬라이드 및 미디어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 형광 태그 단백질은 세포 분열과 세포 형 차별화 중에 가능한 역할의 이해를 증가 표현과 subcellular 지방화에 의해 동적으로 추적 할 수 있습니다.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

라이브 공 촛점 이미징 개발을 연구하는 강력한 도구로 생물 학자를 제공합니다. 여기, 우리 애기 꽃을 개발하는 라이브 공 촛점 이미징에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

여기에는 높은 수치의 조리개 목적과 침지 매질로서의 퍼플 루오로 데칼린을 사용하여 최대 3 일 동안 뿌리 및 배축 발달의 고해상도 공 초점 저속 이미징을위한 간단한 기술이 제시됩니다.

뿌리와 배설물 개발의 장기 공 촛점 이미징을위한 단순한 챔버

우리는 시간의 연장된 기간 동안 형광 라이브 이미징 애기 thaliana 잎을 수행 하기 위한 간단 하 고 다재 다능 한 방법 보고. 우리는 식물 면역 반응의 spatiotemporal 이해에 대 한 예를 들어 면역 관련 발기인의 통제 형광 성 취재 원 유전자를 표현 하는 유전자 변형 애기 식물을 사용 합니다.

Intravital 시간 경과 영상에 대 한 애기 를 장착 하는 다양 한 방법을 나뭇잎합니다

여기, 우리 세대를 설명 하 고 유전자 변형 애기 thaliana 의 집합의 응용 프로그램 세 가지 주요 meristems, 싹 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에는 레이어의 활성화 유도할 수 있는, 조직 관련 식 라인.

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

여기서 우리는 촬영 에 피질 미세 투하 세포 골격의 살아있는 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명하고 물리적 인 힘의 변화에 대한 반응을 모니터링.

미생물의 미세 관 세포 골격및 아라비도시스 촬영 Apical 메리스템의 미세 기계적 조작의 라이브 세포 이미징

이 원고는 살아있는 이끼 조직의 3D 세포벽 역학을 이미지화하는 상세한 프로토콜을 제시하여 장기간에 걸쳐 발달하는 동안 ggb 돌연변이에서 세포벽의 분리와 야생형의 세포벽 패턴을 두껍게 시각화할 수 있습니다.

이끼 피스코미트리움 파텐스에서 칼코플루오르를 사용한 세포벽 역학의 3D 타임랩스 이미징

옥수수 잎 primordia는 깊숙이 찢어지고 구겨져 연구하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 형광 및 공초점 이미징을 위해 옥수수 잎 원시의 횡단면과 펼쳐진 전체 마운트를 준비하는 방법을 제시합니다.

형광 및 공초점 이미징을 위해 횡단면을 준비하고 옥수수 잎 원시의 전체 마운트를 펼치기 위한 개선된 방법

감수 분열 전기 동안의 염색체 이동은 포자 형성의 기본이 되는 잘 이해되지 않는 현상입니다. 이 프로토콜은 애기장대 탈리아나 수컷 감수 모수세포에서 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임을 획득, 분석 및 정량화하는 방법을 설명합니다.

애기장대 의 수컷 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임의 라이브 이미징 특성화

이 과정은 공초점 현미경과 형광 표지된 핵 및 염색질 마커 라인을 결합하여 애 기장대 뿌리의 핵과 염색질 역학을 동시에 기록하고, 발달 및 환경 신호에 반응하여 이러한 역학 변화를 조사  합니다.

애기장대 뿌리의 핵 형태와 염색질 역학의 정량적 생세포 영상화 및 발달 및 환경 스트레스 중

배우세요 레이저 공초점 현미경을 이용한 다양한 식물 종의 촬생 정점 분생조직 라이브 영상법을. Arabidopsis, 토마토, 대두에서 고해상도 세포 구조를 고정 없이 관찰하여 식물 생장과 발달 연구에 효율적인 프로토콜을 제공합니다.

다른 식물 종에서 촬영 정점 Meristems의 confocal 라이브 영상

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