생리 적 면역 원 성 수지상 세포 생성을 위한 새로운 프로토콜

생리성 수지상 항원 제시 세포, 라는 PhDC, 항 원 특이 적 T 세포 면역 및 허용 오차를 시작 하는 면역 마스터 스위치. 이 논문은 PhDC의 생산을 위한 효율적인 방법을 설명합니다. 수지상 세포의 임상 사용은 이를 생산하는 데 사용되는 비생리적 사이토카인 방법에 의해 방해된다.

우리의 방법은 인간과 마우스에서 단핵구-DC 변환의 효율적인 혈소판 신호를 통해 그 문제를 극복합니다. 이 PhDC는 생체 내에서 사용할 수 없는 사이토카인 조건에 의존하지 않으므로 확립된 암을 가진 인간과 마우스 모두에서 강력한 임상 항종양 T 세포 반응을 생성할 수 있습니다. 단세포-PhDC 성숙의 종 독립적 혈소판 개시는 광범위한 실험 적 적용성을 가지고 있습니다.

PhDC는 수지상 세포 생리학의 해부를 허용하고, 면역원암에 대한 치료 항암 면역의 유도를 용이하게 하며, 개인화된 항균 예방 접종에 대한 약속을 제공합니다. 이러한 실험 시스템은 새로운, 플라스틱 챔버의 코팅, 8-MOP/UVA를 가진 종양 세포 치료, 유량 조건 및 단핵구의 방출과 같은 그것의 다중 양상은 시각적으로 표현되는 것이 가장 좋습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 이브 로빈슨 (Eve Robinson)이 될 것입니다.

말초 혈액 단핵 세포를 수집하기 위하여는, 먼저 5 10 마우스 의 4밀리리터 임피티드 격리 매체를 가진 15 밀리리터 관을 설치했습니다. 그런 다음 종양을 베어링 마우스에서 수집한 혈액을 배지 위에 천천히 층으로 넣습니다. 세포를 1, 000-1, 500회-G에서 20분 동안 회전하여 PBMC를 적혈구로부터 분리한다.

원심 분리가 끝나면 상단 플라즈마 층을 수집하여 버피 코트 위에 0.5 밀리리터를 남기고 나중에 사용하기 위해 섭씨 4도에 보관하십시오. 다음으로, 15 밀리리터에 PBS로 채워진 깨끗한 15 밀리리터 튜브로 버피 코트 층을 수집하고, 표준 조직 배양 원심분리기에서 250배-G에서 10분 간 회전하여 PBMC를 수집합니다. 원심 분리의 끝에서, 신중하게 상체에서 파이펫과 펠릿을 다시 중단 튜브를 플릭.

그런 다음 PBMC에서 남아있는 적혈구를 제거하기 위해 튜브에 ACK 적혈구 리시스 버퍼 2 밀리리터를 추가합니다. 10 분 동안 얼음에 PBMC를 인큐베이션. 15 밀리리터에 PBS로 튜브를 채우고, PBMC를 수집하기 위해 10 분 동안 표준 조직 배양 원심분리기에서 250 배-G에서 아래로 회전.

조심스럽게 상체에서 파이펫과 펠릿을 느슨하게 튜브를 플릭. FBS의 300 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단. 치료군당 YUMM1.7 종양 세포를 준비하기 위해, 먼저 300마이크로리터당 250만 개의 세포에서 FBS의 종양 세포 펠릿을 재중단한다.

조직 배양 후드 조명을 끄면 YUMM1.7 종양 세포 현탁액에 밀리리터 당 100 나노그램의 최종 농도를 위해 8-메톡시포랄렌을 추가하십시오. 다음으로 세포를 섞고 셀 용기를 호일로 감싸고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 12웰 조직 배양 판을 미리 코팅하려면 5마리의 마우스의 모든 치료 그룹에 대해 1밀리리터의 FBS를 1밀리리터에 넣고 20분 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 냉장 보관하십시오.

20 분 후, 조직 배양 후드에서, 우물에서 FBS를 제거하고, 잘 당 메톡시프소랄렌 노출 종양 세포의 300 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 세포 함유 플레이트를 미리 따뜻힌 자외선에 노출하면 평방 센티미터당 4개의 줄의 총 조사를 위한 광원. 각 우물에서 8-메톡시포넨/UVA 처리종양 세포를 수집하려면 플레이트와 파이펫을 조심스럽게 소용돌이쳐 완전한 세포 회복을 보장합니다.

5개의 마우스의 각 처리 단에 대한 환화 플레이트 통로를 수행하기 위하여는, 1.5 밀리리터 원추형 관에 있는 8-메톡시프스포랄렌/UVA 처리한 종양 세포의 300마이크로리터 및 300마이크로리터를 결합하고 세포를 혼합한다. 다음으로 TI 플레이트의 입구 및 출구 튜브 클램프를 엽니다. 10밀리리터 주사기를 사용하여 TI 튜브를 FBS로 채우고 튜브 내부의 FBS를 유지하기 위해 튜브가 채워지면서 클램프를 닫습니다.

주사기를 분리합니다. P1000 파이펫 팁을 TI 플레이트 섭취량에 단단히 넣습니다. 접시를 45도 각도로 잡고 PBMC 및 종양 세포 혼합물로 플레이트를 천천히 채우고 거품을 피하십시오.

파이펫 플런저를 해제하기 전에 섭취에서 파이펫 팁을 제거합니다. 나머지 세포를 1.5 밀리리터 원내 튜브로 되돌려 보냅니다. FBS 채워진 튜브, 세포 채워진 TI 플레이트 및 1.5 밀리리터 원뿔관을 조직 배양 배양기에서 나머지 세포를 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다.

인큐베이션 후 클램프를 해제하고 중력에 의해 TI 튜브를 비웁니다. 그런 다음 플런저와 P1000 파이펫 팁을 삽입하여 플레이트 포트에 우울하여 TI 플레이트에서 세포를 제거합니다. 플레이트를 45도 각도로 잡고 P1000 파이펫 팁을 채웁니다.

세포를 원래 1.5 밀리리터 원추형 튜브에 다시 넣습니다. TI 플레이트를 실행하려면 출구 튜브를 플레이트에 연결하고 TI 플레이트를 플레이트 실행 시스템에 고정합니다. 다음으로, 1밀리리터 주사기를 사용하여, 1.5 밀리리터 원뿔관에서 PBMC 및 종양 세포 믹스의 그 600 마이크로리터를 그립니다.

클램프가 열리면 주사기를 입구 튜브에 부착하고 유체가 튜브 끝에 도달할 때까지 천천히 채웁니다. 입구 튜브의 자유 끝을 TI 플레이트에 부착하고 나머지 볼륨을 부드럽게 적재합니다. 완료되면 입구 클램프를 닫습니다.

1밀리리터 주사기를 분리하고 입구 튜빙을 주사기 펌프에 연결합니다. 출구 튜브를 세포 수집을 위한 깨끗한 1.5 밀리리터 원추형 튜브로 고정하십시오. 주사기 펌프 유량을 분당 0.09 밀리리터로 조정합니다.

TI 플레이트 러닝 플랫폼을 사용하여 TI 플레이트를 주사기 펌프 측쪽으로 약 30도 기울입니다. 입구 튜브에 클램프를 조심스럽게 놓습니다. TI 플레이트가 어떻게 채워지는지 주의 깊게 관찰하면서 주사기 펌프를 시작합니다.

TI 플레이트가 완전히 채워지면 비우면서 반대 방향으로 약 30도 기울입니다. 액체의 모든 세포가 1.5 밀리리터 원추형 수집 튜브에 있을 때 펌프를 중지하십시오. TI 플레이트를 세척하려면 주사기 펌프에서 입구 튜브를 분리하고 FBS 600 마이크로리터로 채워진 1 밀리리터 주사기에 연결합니다.

FBS가 완전히 로드될 때까지 채웁니다. 그런 다음 주사기를 분리하고 튜빙을 주사기 펌프에 부착합니다. 주사기 펌프 유량을 분당 0.49 밀리리터로 조정합니다.

입구 클램프를 해제하고 TI 플레이트를 실행하여 동일한 1.5 밀리리터 원추형 튜브에서 세척을 수집합니다. TI 플레이트를 가볍게 누르거나 전체 시간을 가볍게 탭하여 플레이트가 비워짐에 따라 부착 된 세포를 분리하고 용해하는 데 도움을 주십시오. TI 플레이트 설정에서 컬렉션 1.5 밀리리터 원추형 튜브를 분리합니다.

8 분 동안 250 회-G에서 벤치 탑 마이크로 퍼지에서 수집 튜브를 회전하고 상퍼를 폐기하십시오. 항원으로 PBMC의 하룻밤 공동 인큐베이션을 수행하기 위해 먼저 15 %의 자가 마우스 혈청으로 보충 된 명확한 RPMI의 2 밀리리터에서 PBMC 및 종양 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음 35밀리미터 비조직 배양처리멸식 접시에 세포를 플레이트하고 표준 조직 배양 조건하에서 하룻밤 동안 배양한다.

다음 날, 조심스럽게 조직 배양 스크레이퍼와 접시의 바닥에서 모든 부착 세포를 분리. 스크래핑하는 동안 접시를 회전하여 셀 수집도 보장합니다. 15 밀리리터 튜브에서 세포를 수집합니다.

접시에 PBS의 두 밀리리터를 추가하고, 동일한 튜브에 세포를 수집, 긁는 단계를 반복합니다. PBS의 1 밀리리터로 35밀리미터 접시를 헹구고 헹구기를 같은 튜브에 넣습니다. 표준 조직 배양 원심분리기에서 250회-G에서 세포를 수집하려면 10분 간 회전합니다.

조심스럽게 상체에서 피펫, 다음 펠릿을 다시 중단 튜브를 플릭. 치료는 2년 동안 실시된 9개의 독립적인 실험의 누적 종양 성장 데이터에서 관찰된 바와 같이, 대조마우스 대 100개 이상의 종양 성장의 감소를 보였다. 한 실험 내의 개별 동물에 대한 대표적인 종양 성장 곡선은 시스템의 가변성을 제공한다.

단핵구 또는 혈소판이 PBMC 분획에서 고갈되거나 플레이트 통로가 생략될 때 치료 효과가 더 이상 관찰되지 않습니다. 이 치료법은 면역 세포 또는 항원 공급원이 없거나 MC38 결장 암세포를 사용하여 치료된 YUMM1.7 종양과 같은 일치하지 않는 항원의 존재하에서 효과가 없다. 예방 접종 결과에 대 한, 그것은 또한 8-메톡시포렌에 PBMC 노출을 방지 하는 것이 중요 하다.

FACS 분석은 새로 절연된 PBMC, TI 처리 PBMC, 플레이트 통로 없이 TI 처리된 PBMC, 플레이트 통로 의 고갈된 혈소판, 또는 위의 둘 다 중 인간 CD11c+세포에서 대응하는 IgG 컨트롤에서 표시된 마커의 변화에 대한 해석으로, DC 활성화는 PBMC내의 혈소판의 존재에 달려 있음을 보여주었으며, TI 판도 통로에. TI 활성화 인간 DC는 TI 및 혈소판 의존적 방식으로 체외 내의 인간 항원 특이적 T 세포주를 활성화하기 위해 전체 8-메톡시포랄렌-노출된 인간 종양 세포로부터 펩티드 항원 또는 항원을 효과적으로 처리하고 교차존재할 수 있다. T 세포 반응의 특이성은 처리된 항원의 근원에 의존한다.

항암 면역을 유도할 때, 면역원성을 최대화하기 위하여 각 암 세포주의의 세포증은 적정되어야 합니다. 유도된 면역은 항원 면역에 특이적이기 때문에 각 시스템의 상세한 해부가 가능할 것이다. 각 실험 또는 임상 암, 그리고 각 항균 반응은 유일하게 유익할 것입니다.

각 개별적인 인간적인 암에는 종양 특정 항원의 그것의 자신의 배열이 있습니다. PhDC는 이전 실험실 식별을 요구하지 않고 종양 항원의 필요한 선별 및 프리젠 테이션을 수행합니다. 8-MOP와 UVA 빛은 발암 물질임을 유의하시기 바랍니다.

적절한 보호 장비를 사용하고 8-MOP를 취급할 때와 UVA 광원으로 작업할 때 안전 절차를 따르십시오.