Name: 형광 활성 세포 선별에의 한 인간의 피부에서 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 학습하세요 인간 피부에서 형광 활성 세포 선별(FACS)을 이용하여 유두 및 망상 섬유아세포를 직접 분리하는 방법을. 이 기술은 체외 배양 없이 기능적으로 구별되는 섬유아세포 하위집단을 연구하여 피부 병리학 연구를 발전시킵니다.

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우리는 Bärbel 라인하르트와 볼프강 바 우 어에의 한 FACS의 도움을 기꺼이 인정 합니다. 이 사업은 오스트리아 과학 기금 (FWF: V 525-B28)과 유럽 생화학 사회의 연맹 (FEBS, 후속 연구 기금)에서 b. m. l.에 게 보조금을 지원 했습니다. S. f. 오스트리아 과학 아카데미 (OeAW)의 DOC 원정대의 수혜자입니다. 우리는 비엔나의과 대학의 핵심 시설에서 우수한 지원을 감사 하 게 인정 합니다. 우리는 인간 피부 재료를 제공 하기 위한 Bernhard Gesslbauer, 크리스틴 Radtke 및 마틴에 르 합 퍼 감사 합니다.

인간의 피부는 26 ~ 61 세의 백인 남성과 여성에서 수 득 되었다 (햇볕에 보호 된 피부; 복 부 교정, 유 방 감소). 작성 된 정보에 입각 한 환자 동의는 헬싱키 선언에 따라 조직 수집 전에 얻어 졌으 며, 빈의과 대학 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 우리는 전체 두께 진 피에서 기능적으로 뚜렷한 섬유 아 세포 집단을 분리 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다 (섹션 1 참조) 또는 인간의 피부 진 피를 다른 층으로 절편 한 후 (섹션 1을 건너 뛰고 2 절을 직접 참조 하십시오) .
1. 전체 두께의 진 피 제조
<ol><li>표 피를 두꺼운 여과 지에서 아래쪽으로 향하게 하 여 10cm x 10cm 인간의 피부 부분 (예: 복 부 교정 또는 유 방 감소)을 배치 하십시오.</li>
	<li>집게와 가장자리에 단단히 표 피를 잡고 메스와 피하 지방 층을 긁어. 그런 다음 페 트리 접시에 넣어 전에 5mm 폭 스트립으로 조직을 슬라이스. 참고: 이것은 디 카 제 II (이제 부터는 해리 효소 라고 함)의 침투를 용이 하 게 하 고, 표 피를 전체 진 피 로부터 분리 시켜야 하는 경우에 사용 된다. 이를 위해 섹션 2를 건너뛰고 섹션 3을 직접 참조 하십시오. 오염을 방지 하기 위해, 외과 적 제거 후에 조직을 멸 균 상태로 유지 하거나 에탄올 또는 요오드 용액으로 철저히 청소 하십시오. 전혀, 피부 표면의 에탄올 처리는 경미한 세포 사 멸을 야기 한다. 조직 배양 흐름 후드에서 무 균 상태에서 작업.</li>
</ol>2. 인간의 피부 진 피를 피부 분절와 망상 층으로 절편
<ol><li>표 피를 위쪽으로 향하게 하 여 두꺼운 여과 지에서 10 cm x 10cm의 피부 조각 (예: 복 부 교정 또는 유 방 감소)을 놓습니다. 집게와 가장자리에 단단히 피부를 잡아.</li>
	<li>칼 날이 피부 표면과 관련 하 여 90 ° 각도로 피부 분절, 피부 분절의 머리를 자신 으로부터 멀리 슬라이딩 하 여 절단 두께/깊이 300 µm으로 조정 된 전기으로 피부를 슬라이스 하십시오.</li>
	<li>표 피 및 유 두 진 피 (300 µm 두께, ' 진 피 층 1 ', 도 1 및 도 2)로 구성 된 제 1 층을 취하고 페 트리 디쉬에 넣는다. 섹션 3으로 즉시 진행 하거나 조직을 건조 하 게 유지 하기 위해 1x PBS를 추가 하십시오. 참고: 오염을 방지 하기 위해, 외과 적 제거 후 티슈를 멸 균 상태로 유지 하거나 에탄올 또는 요오드 용액으로 철저히 청소 하십시오. 조직 배양 흐름 후드에서 무 균 상태에서 작업. 주의: 칼 날이 매우 날 카 롭 기 때문에 조심 스럽게 피부 분절을 다루십시오.</li>
	<li>2.2 단계를 반복 하 여 피부 분절를 700 µm의 절단 두께로 조정 하 고 나머지 진 피를 슬라이스 한다. 상부 망상 진 피 ("피부 층 2", 도 2)로 정의 되는 상부 슬라이스를 별도의 페 트리 디쉬에 넣습니다. 즉시 섹션 4로 진행 하거나 조직을 건조 하 게 유지 하기 위해 1x PBS를 추가 하십시오.</li>
	<li>잔류 하 부 망상 진 피 층 (> 1000 µm) 으로부터 메스로 피하 지방 층을 긁어 버리고 폐기 한다. 다른 페 트리 접시에 하 부 망상 진 피 ("피부 층 3", 그림 2)를 모으십시오. 즉시 섹션 4로 진행 하거나 조직을 건조 하 게 유지 하기 위해 1x PBS를 추가 하십시오. 참고: 양자 택일로, 대신에 메스로 지방을 긁어,가 위로 지방 층을 제거. 그것은 멀리 지방을 긁어 전에 얼음에 망상 진 피를 넣어 하는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. 표 피와 진 피의 분리
<ol><li>
멸 균 1x PBS에서 3 U/m l 해리 효소 (즉, 디 스퍼 제 II) 용액을 제조 하였다. 5mm 피부 줄무늬 (제 1 항에서) 또는 표 피/유 두 진 (2.2 단계에서)을, 표 피와 함께 10cm 페 트리 디쉬에서 위쪽으로 향하게 하 여 10ml의 3U/mL 해리 효소 용액을 넣습니다. 1 시간 동안 37 ° c에서 배양 접시를 배양 하였다.
	<ol>
<li>프로토콜은 여기서 일시 중지할 수 있습니다. 대신에 4 ° c에서 냉장고에 있는 프로 테아 제에서 표 피/유 두 진을 배양 한다. 필요에 따라 다른 층 (진 피 층 1, 2 및 3)을 4°c에서 50 mL 튜브에 1x PBS에 담가 밤새 보관 한다. 주의: 프로 테아 제를 사용 하 여 신중 하 게 작업 하면 접촉 시 피부와 눈이 자극 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인큐베이션 후에, 표 피/유 두와 진 피를 페 트리 디쉬의 건식 뚜껑으로 전달 하 고, 표 피 또는 진 피의 가장자리를 각각 잡고 있는 2 개의 집게와 함께 상부 진 피 (피부 층 1) 로부터 표 피를 분리 한다.</li>
</ol>4. 피부 조직의 효소 적 소화
<ol><li>각 진 피 층 (진 피 층 1, 2 및 3)을 가능한 한가 위/메스와 별도로 분리 한다. 조각이 작을수록 조직 소화가 좋아집니다. 참고: 진 피의 인 성은 그것이 유래 하는 신체 부위 (예: 복 부 또는 팔 뚝 피부)에 따라 변할 수 있습니다.</li>
	<li>1.25 mg/ml 콜라 게 나아 제 i, 0.5 mg/ml 콜라 0.1 게 니 아 II, 0.5 mg/ml 콜라겐을 사용 하 여 변성 된이 글의 배지 (DMEM)에서 히 알루로 니다 제의 제조 방법 (재료 표 참조), 10% 태아 송아지 세럼 ( 1% 페니실린/streptomycin). 주의: 접촉 시 피부와 눈을 자극할 수 있으므로 collagenases으로 조심 스럽게 작업 하십시오.</li>
	<li>준비 된 소화 혼합물 10ml를 50 mL 튜브에 넣고 1 시간 동안 37 ° c 온수 조에서 배양 하 여 각 다진 조직을 영구 교 반 하에 넣는다. 소화 하는 동안 튜브를 여러 번 반전. 참고: 하나는 다진 된 피부 조각의 크기에 따라 소화 볼륨을 조정 고려해 야 합니다. 그렇지 않으면 세포 수율은 최소화 될 것입니다 너무 많은 조직과 10 mL 소화 믹스를 과부하 하지 마십시오. 총 부피 내 조직의 1/3 미만 (1:2)을 권장 합니다.</li>
</ol>5. 단일 세포 현 탁 액 및 적혈구 용 해의 제조
<ol><li>소화 된 조직에 10 mL 섬유 아 세포 배지 (DMEM, 10% FCS 및 1P/s)를 추가 하 여 효소 조직 소화를 중단 하십시오. 여기에서 얼음에 대 한 작업.</li>
	<li>정기적으로 멸 균 스테인리스 차 여과기를 통해 각 튜브의 내용물을 붓고 깨끗 한 페 트리 접시에 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 주사기-플런저의 가장자리와 중간 및 매쉬 소화 되지 않은 조직 조각으로 여과기를 씻으십시오.</li>
	<li>이후, 피 펫은 50 mL 튜브에 70 µm 세포 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 수집 하였다. 배지로 세포 여과기를 헹 구 고 동일한 튜브를 통해 흐름을 수집 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 4 ° c에서 500 x g 의 원심 분리기 튜브. 상층 액을 제거 하 고 버리고 5 mL 섬유 아 세포 배지로 세포 펠 렛을 세척 한다. 원심 분리 단계를 반복 한다.</li>
	<li>상기 상층 액을 제거 하 고 폐기 하 고 1 mL에 상기 펠 렛을 소생 하 여 자체 제작 된 난 모 세포용 해 완충 액 (0.15 M, 10MMKHCO3, 0.1 mmn2 EDTA, pH 7.2 \\ 20127.4). 주위 온도에서 약 1 분 동안 용 해 완충 액에 세포를 남겨 주세요 (20 \\ u201222 ° c).</li>
	<li>10% FCS를 사용 하 여 9 mL의 PBS를 추가 하 여 용 해를 중지 하 고 4 ° c에서 500 x g 에서 튜브를 5 분간 원심 분리기. 상층 액을 버리십시오. 주의: 적혈구 용 해에서의 인큐베이션 시간은 세포가 불완전 하 게 보일 경우 (적색 펠 렛) 조정 될 수 있다. 그러나, 세포가 섬유 아 세포와 면역 세포의 용 해를 피하기 위해 너무 오랫동안 적혈구 용 해 완충 액에 방치 하지 마십시오.</li>
</ol>6. FACS에 대 한 섬유 아 세포를 차단 및 염색
<ol><li>인간 Fc 차단제의 100 µ L에서 10% FCS 및 소생 세포를 가진 1x PBS의 100 µ L에서 5 µ L의 인간 Fc 수용 체 차단 용액을 준비 하십시오. 10 분간 얼음을 배양 합니다.</li>
	<li>인간 피부 섬유 아 세포에 얼룩을 FACS 염색 패널을 디자인 한다. 반대로 인간적 인 FAP APC (1:20), 반대로 인간적 인 CD90 1:30 AF700 (1:20), 반대로 인간적 인 CD31 FITC (1:30), 반대로 인간 CD45 태평양 블루 (1:20), 반대로 인간적 인 ITGA6 pe (1:20)를 혼합 하 고 반대로 인간적 인 CD235ab 하는 태평양 10% FCS를 가진 1x PBS에서 블루 (1:100)</li>
	<li>
Fc 수용 체 차단 후, 4 ° c에서 500 x g 의 세포를 3 분 동안 스핀 다운 한다. 100 µ l의 항 체 혼합에서 상층 액 및 소생 세포를 제거 하 고 폐기 한다. 4 ° c에서 20 분간 어둠 속에서 세포를 배양 한다.
	<ol>
<li>염색 하기 전에, 미 염색 및 단일 얼룩 FACS 컨트롤을 위한 높은 세포 수와 샘플의 20 µ L을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스테인드 셀과 FACS 컨트롤을 10% FCS와 500 µ L 1x PBS로 두 번 세척 하 고 4°c에서 3 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기를 사용 합니다. 그 동안에는 1µ의 최종 농도를 만들기 위해 10% FCS를 가진 1 개의 PBS로 4 ', 6-디 아미노 디 이노 2 페니 린 돌 (DAPI)을 추가 합니다.</li>
	<li>200 µ L DAPI 용액에서 상층 액을 제거 하 고, 소생 시킨 세포를 버리고 70 µm 세포 스 트레이너를 통해 각 세포 현 탁 액을 5 mL FACS 튜브로 걸러 냅니다. 참고: FACS가 지연으로 수행 되는 경우, 녹화 직전에 DAPI와 필터를 추가 합니다.</li>
</ol>7. 인간 진 피 섬유 아 세포 서브 세트 분리 및 FACS에 대 한 게이팅 전략
<ol><li>유량 분석 제어를 기록 하 고 올바른 전압 설정을 설정 하 고 적절 한 보정을 수행 합니다. 단일 세포 및 라이브 (DAPI-), 태평양 블루, PE 및 fitc 음극 세포 (CD45, CD31 CD235ab, CD106, ITGA6 및 전자 카 데인)는 3 개의 섬유 아 세포 집단을얻을 수 있습니다: FAP+ CD90 + CD90 +및 fap CD90+ 세포 그림 3을 참조 하십시오.</li>
	<li>3 개의 섬유 아 세포를 분리 된 1.5 mL 스크류 캡 마이크로 원심 분리기 튜브로 분류 하 여 RNA 분리를 위한 350 µ L 용 해 완충 액 또는 350 µ L 섬유 아 세포 성장 배지 ( 물질 표참조)로 채워 세포 배양 용으로 채워 넣습니다. 정렬 직후 튜브를 반전 하 고 스냅 동결 또는 얼음에 중간 튜브를 넣어 액체 질소에 용 해 완충 튜브를 넣어. 주의: 흄 후드에 0.1% 진단을의 용 해 완충 액을 준비 하 고 흡입을 피하십시오.</li>
</ol>8. 섬유 아 세포 및 지방 형성 분석의 배양
<ol><li>다음 FACS, 4°c에서 3 분 동안 500 x g 에서 세포를 스핀 하 고, 48-웰 세포 배양 접시에 섬유 아 세포 성장 배지 ( 재료 표참조)에서 동등한 세포 수 (5000 \\ u201210, 000 셀/우물)를 플레이트. 그들은 70%의 유창에 도달 할 때까지 성장 하는 세포를 남겨 주세요.</li>
	<li>5 µ의 인슐린, 5 µ M troglitazone, 0.5 mM 3-이 소부 틸 1) 및 섬유 아 세포 성장 배지에 1 µ M dexametasone을 첨가 하 여 지방 세포 분화 배지를 제조 하였다.</li>
	<li>배양 된 세포의 배지를 지방 세포 분화 배지로 대체 하 고 세포를 14 일 동안 분화 시켜 준다. 2 일째에 µ 인슐린과 5 µ M troglitazone를 함유 하는 지방 생성 배지를 감소 시켰다. 매 3rd 또는 4 일 마다 배지를 보충 합니다.</li>
	<li>분화 일 14 일째에 주위 온도 (20 u201222 ° c)에서 20 분간 PFA로 세포를 고정 한다. 60%의이 소 프로 판 올로 우물을 씻고 완전히 증발 시켜 주세요. 5mm 오일 레드 O (사용 전 필터)로 세포 얼룩을 20 분간 염색 한 후 증류수로 4 회 세척 합니다. 현미경 검사를 수행 하십시오. 주의: PFA는 독성이 있고 유해 하다. 조심 스럽게 다루십시오. 참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 고정 된 세포는 오일 적색 O 염색이 수행 될 때까지 4°c에서 1x PBS에 저장 될 수 있다. 증발을 피하기 위해 보관 전에 파라핀 막으로 뚜껑을 덮습니다.</li>
	<li>이미지 셀은 투과 된 빛으로 10 배 배율로 거꾸로 된 현미경으로 물에 침 지 합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 기사에서는 인간의 피부에서 유 두와 망상 섬유 아 세포를 분리 하는 방법을 설명 합니다. CD90는 진 피 섬유 아 세포의 동정 또는 분리에 널리사용 되 고 있으며,20,21이다. 그러나, 우리는 CD90 + 섬유 아 세포 외에, 인간 진 피는 또한 활성 섬유 아 세포 및 암 관련 섬유 아 세포에 대 한 마커로 서 확립 된 FAP (16)를 발현 하는 CD90 섬유 모 세포 집단을 항구 ( 22, 23,25. 중요 한 것은, 우리는 모든 건강 한 인간적 인 기증자에 게 서 피부생검에 있는 3개의 섬유 아 세포 부 인구 fap+CD90 + CD90+ 및 fap CD90+ 를 찾아낼 수 있었습니다. 따라서 우리는 FAP가 활성화 된 섬유 아 세포 또는 카페 뿐만 아니라 정상 조직 섬유 아 세포에 대 한 마커로도 결론을 내릴 것입니다.
참고로, 상기한 배제및 게이팅 전략의 적용 후에 잔존 하는 CD90 세포 집단은 섬유 아 세포를 함유 하지 않으며, 이들 세포는 시험관 내에서 섬유 모 세포 배양 배지에 증식 하지 않기 때문에, 대부분 아마 다른 사람의 사이에서 림프 세포 및 심 낭을 포함 하 여 혼합 된 세포 집단16.
상술 한 프로토콜의 사용에 의해 얻어진 세포 수율은 신체-분리에 사용 되는 피부 조각이 유래 하는 부분에 따라 달라질 수 있다. 다른 신체 부위의 진 피는 구조, 두께 및 콜라겐 성분에 따라 다릅니다. 예를 들어, 얼굴이 나 팔 뚝에서 피부는 배 또는 허벅지 로부터 피부 보다 훨씬 얇 아,이는 또한 종종 두꺼운 피하 지방 층을 표시 한다. 부가적으로, 연령 및 피부 기증자의 성별은 조직 해리 효율에만 영향을 미칠 뿐만 아니라, 전체 두께의 피부 로부터 분리 되는 경우에도 3 개의 섬유 아 세포 하위 집단 (도 3)의 분포에 영향을 줄 수 있다. 이것은 유 두 진 피가 축소 되 고 총 섬유 아 세포 수가11세,26,28로 감소 한다는 사실에서 발생 합니다. 더욱이, 유 두 진 피 로부터의 세포 펠 렛은 아마도 망상 진 피 로부터 보다 더 커질 것 이며, 상층 진 피는 망상 진 피 보다 섬유 아 세포에 의해 더 조밀 하 게 채워져 있기 때문 이다. 게다가, 하 부 진 피는 또한 더 강하고 조밀 하 게 콜라겐으로 포장 되어, 조직을 해리 하 고 섬유 아 세포를 방출 하기 어렵게 합니다. 주의, 세포 펠 릿은 매우 빨간색 나타날 수 있습니다., 왜 적혈구 세포 용 해 권장.
온전한 인간 피부에서 3 개의 하위 집단을 동정 하는 것 외에도, 우리는 또한 dermatomed 피부에서 각 섬유 아 세포 서브셋이 유 두 또는 망상 진 피 (16)에서 농축 되는 것을 보여준다. 피부 분절로 피부를 정밀 하 게 슬라이스 하는 것은 서로 다른 진 피 층에서 각 부 모집단을 적절 하 게 농축 하는 데 중요 합니다. 유 두 진 피가 매우 얇기 때문에, 그것을 나타내는 dermatomed 슬라이스는 300 µm의 두께를 초과 하지 않아야 한다. 상부 망상 및 하 부 망상 섬유 아 세포 모두 망상 혈통을 나타내고 유사한 기능 및 유전자 서명을 표시, 따라서이를 분리 하지 않는 것도 고려할 수 있습니다.
중요 하 게는, 모든 3 개의 섬유 아 세포 집단은 진 피 전반에 걸쳐 발견 되 고 독점적으로 한 층에 존재 하지 않으며,이는 유 두 또는 망상 진 피에서의 외식 배양이 혼합 섬유 아 세포 배양을 초래 하는 이유 이다. 그러나 FAP +CD90- 유 두 섬유 아 세포는 유 두 진 피 층에서 가장 풍부 하 고, fap+CD90+ 및 fap-CD90+ 섬유 모 세포가 있는 동안 표면에서 하 부 피부에 그라데이션을 따라 아래에서 표면 층으로의 역 구배16. 더욱이, 유 두 진 피의 대다수의 CD90+ 섬유 아 세포는 거의 독점적으로 혈관 주위에 발견 되 고 혈관 주위 섬유 아 세포 마커 CD14629를 발현 하며, 따라서 아마 보다 다른 기능을 나타낼 남은 CD146- 망상 섬유 아 세포16. CD146는이 채우기를 제외 하기 위한 게이팅 전략의 추가 마커로 사용 될 수 있습니다.
진 피 층의 해리에 따라, 분리 된 세포는 면역 세포의 배제에 대 한 다양 한 항 체를 포함 하는 특수 설계 된 항 체 칵테일로 염색, 내 피의 및 림프 세포, 상피 세포, 적혈구 및 MSCs 순수한 섬유 아 세포 인구를 얻습니다. 참고로, MSCs의 식별 및 배제를 위한 마커를 선택 하는 것은 게시 된 MSC 마커 (30)의 수가 많기 때문에 까다로울 수 있다. MSCs express는 섬유 아 세포와 같은 CD90 때문에, CD105 또는 CD271와 같은 추가 MSC 마커는 그들의 식별을 위해 유용 하 게 증명할 수 있었습니다. 그러나, MSCs는 모든 진 피 세포의 매우 낮은 비율만을 나타내며, CD90+ 섬유 아 세포는 선별 시 섬유 아 세포의 전형적인 형태학 적 특징을 표시 하기 때문에, 별개의 세포 표면 마커의 사용에의 한 mscs의 배제를 주장할 수 있습니다 필요 하지 않습니다.
중요 하 게는, 우리는 CD90 유전자 발현을 선별 후 7-14 일 동안 배양 하 여 세포를 유지 한 후에 FAP를 분석 하 고 (데이터는 표시 되지 않음) 두 마커의 발현이 각각의 선별 된 단일 양성 (FAP+CD90에 상향 조절 됨을 발견 하였다 CD90+) 세포16. 그러므로 우리는 전술 된 마커 세트 및 프로토콜이 이전에 배양 된 혼합 섬유 아 세포 집단 으로부터 직접 조직 으로부터 1 차 섬유 아 세포 서브 세트의 분리를 허용 하는 것을 강조 한다.
그럼에도 불구 하 고, 우리는 섬유 아 세포가 FAP+CD90- 유 두 섬유 아 세포로 분류 되기 때문에 3 개의 모든 하위 집단의 기능이 세포 표면 마커 발현의 변경에 관계 없이 세포 배양에 유지 된다는 것을 입증 합니다 아 섬유 아 세포가 FAP+CD90+ 또는 fap CD90+ 망상 섬유 아 세포로 분류 되는 동안 배양의긴 기간 후에 지질을 겪는 능력을 습득 하 여 지방 세포로 분화 하는 능력을 유지 한다 16 . 중요 한 것은, 우리는 또한 유 두 및 망상 특이 적 유전자는 여전히 FAP+CD90 및 CD90+ 에서 더 높은 범위로 표현 된다는 것을 발견 했습니다.
결론적으로, 우리는 인간의 피부 진 피 로부터 순수 하 고 순진한 섬유 아 세포 집단의 분리 및 분석을 최초로 허용 하는 FACS를 통해 기능적으로 뚜렷한 섬유 아 세포 서브 세트의 분리를 위한 프로토콜을 확립 하였다. 이 방법은 (i) 피부 표면에서 피하 진 피에 존재 하는 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 대 향하는 기울기 (i)와 같이 상부 및 하 부 진 피 로부터 통상적으로 사용 되는 섬유 아 세포를 이용한 분리 프로토콜에 대 한 큰 진보를 확립 하 고 (ii) 섬유 아 세포는 시험관 내에서 그들의 유전자 서명을 변경.

결합 조직의 주요 세포 성분으로 서, 섬유 아 세포는 궁극적으로 세포 외 기질1을 형성 하는 콜라겐 및 탄성 섬유의 침착에 대 한 책임이 있으며, 따라서, 조직 항상성, 재생 및 질병은 오랜 시간 동안 과소 평가 되었습니다. 그러나 섬유 아 세포는 최근 연구자 들의 주목을 받고 있으며,이는 유도 만능 줄기 세포에 대 한 두드러진 세포 공급원을 나타내기 때문에2 뿐만 아니라 그들의 병 인에서 높은가 소성 및 의미 또한 있기 때문에 장기 섬유 증3,4,5 또는 암6등의 다양 한 질환.
인간 피부는 다층 상피, 표 피 및 그것의 기저 결합 조직으로 구성 되며,이는 조직 학적으로 상부 유 두 및 하 부 망상 진 피로 세분 될 수 있고 주로 섬유 아 세포로 구성 되 고 세포 외 기질8 및 피하 진 피. 조직 내에서 그들의 위치에 따라, 진 피 섬유 아 세포는 대략 유 두 및 망상 섬유 아 세포로 분류 되었다1.
중요 하 게는, 최근의 데이터는 이러한 진 피 섬유 아 하위 집단이 조직 학적으로 구별 될 뿐만 아니라, 그의 기능이 상당히 다양 하다는 것을 나타낸다. 마우스 피부에서, 유 두와 망상 섬유 아 세포는 배아 발생 시에 2 개의 별개의 선로에서 일어나9. 여러 줄의 증거가 제시 된 두 개의 선은 조직 항상성, 모 낭 형성, 상처 복구 및 섬유 증7,9,10에 뿐만 아니라 다른 역할을 발휘 하지만 그들은 또한 다른에 응답 신생 플라스틱 표 피 줄기 세포의 신호11, 암 병 인에서 분기 역할을 제안. 편리 하 게도, 두 계보는 성인 마우스 피부에 상호 배타적 인 세포 마커의 뚜렷한 집합을 표현 하 여 순수 피부 섬유 아 세포 집단의 분리를 가능 하 게 하 고 시험관 내 특정 기능에 대 한 연속적인 광범위 한 분석을 가능케 합니다.9 , 11.
상응 하 여, 별개의 형태학 및 기능을 갖는 2 개 이상의 별개의 섬유 아 세포 서브 세트, 증식 율, 조직 리 모델링 능력12,13뿐만 아니라 성장을 지 원하는 능력 표 피 줄기 세포는 시험관 내에서, 인간의 피부 진 피14,15에 대해 기술 되었다. 그러나, 인간 진 피 섬유 아 세포에 관한 대부분의 출판 된 연구는 dermatomed 피부 로부터 익 형 배양 으로부터 분리 된 혼합 섬유 아 세포 집단을 사용 하 여 진행 되었으며, 특정 세포 표면 마커 세트는 순수한 인간 유 두의 분리를 가능 하 게 하기 때문에 또는 마우스 진 피에 비유 된 망상 섬유 아 세포 수는 아직 확립 되지 않았다.
우리는 최근에 입증, 인간의 피부 유 두 및 망상 섬유 아 세포는 형광 활성 세포 선별 (FACS)를 통해 각 하위 집단의 분리를 가능 하 게 하는 특정 세포 표면 마커를 특징으로 한다: FAP + CD90- 섬유 아 세포는 상부 진 피에 주로 위치 하는 유 두 섬유 모 세포를 나타내며, 더 높은 증식 율, 뚜렷한 유전자 시그너처를 제시 하지만 지질 성 가능성은 없습니다. FAP+CD90+ 및 fap-CD90+ 섬유 아 세포는 덜 증식 하는 낮은 진 피 구획의 망상 혈통에 속하며 쉽게 지질을 겪는 다-망상 섬유 모 세포에 대 한 특징. 이 방법은 생리 적 조건 하에서 그들의 특정 기능에 관해서는 뿐만 아니라 피부 암을 포함 하는 피부병의 발병의 맥락 에서도 이러한 뚜렷한 섬유 아 세포 집단을 광범위 하 게 연구할 수 있게 한다.
그러나, 섬유 아 세포는 그들의 세포 표면 마커 발현을 시험관 내 배양16,17,19에서 변화 시키기 때문에, 우리의 프로토콜의 적용은 인간 으로부터 일차 섬유 아 세포의 단 리로 제한 된다 진 피 및 혼합 세포 배양 집단에서 유 두 또는 망상 섬유 아 세포의 동정을 허용 하지 않는다. 중요 하 게는, 세포 표면 마커의 발현이 시험관 내에서 변화 되더라도, 우리는이 하에서 설명 된 프로토콜에 따라 분리 된 섬유 아 세포 서브 세트가16일 때 그들의 특정 한 기능성을 유지 한다는 것을 입증 하 고, 따라서 가능 하 게 생리 적 또는 병리학 적 조건 하에 하위 집합 특정 속성의 시험관 연구.
결론적으로 우리는 처음으로 순수한 섬유 아 세포 집단을 인간 피부 진 피 로부터의 단 리를 허용 하는 FACS을 통해 별개의 섬유 아 세포 서브 세트의 분리를 위한 프로토콜을 개발 했습니다.

<table><tbody><tr><td>재료:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>Sigma</td><td>9718</td><td>자체 제작 ACK 용해 완충액에 사용</td></tr><tr><td>Amniomax-C100 (1x) 기초 매체</td><td>Gibco</td><td>17001-074</td><td>섬유아세포 성장 배지</td></tr><tr><td>&베타에 사용;-메르캅토에탄올</td><td>Scharlau</td><td>ME0095</td><td>주의</td></tr><tr><td>C100 보충제</td><td>Thermo Scientific</td><td>12556015</td><td>섬유아세포 성장 매체에 사용</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 I</td><td>Thermo Scientific</td><td>17100017</td><td>주의</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td>주의</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV</td><td>시그마</td><td>C5138</td><td>주의</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>주의</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 염</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>자체 제작에 사용 ACK 용해 완충액</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(열 비활성화)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>히알루로니다아제</td><td>시그마</td><td>H4272</td><td>주의</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>머크</td><td>1,096,341,011</td><td></td></tr><tr><td>오일레드 O</td><td>시그마</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히</td><td>드 시그마</td><td>158127</td><td>주의 암성. 피부와 눈을 자극합니다. 조심히 다루십시오.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ 없이 인산염 완충 식염수 Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>자체 제작 ACK 용해 버퍼에 사용되는</td><td>중탄산칼</td>륨 시<td>그마</td><td>237205</td></tr><tr><td>PureLink RNA MicroKit</td><td>Invitrogen</td><td>12183-016</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11752</td><td></td></tr><tr><td>Taqman 2x Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td>주의: 피부와 눈에 자극을 줍니다.</td></tr><tr><td>Troglitazone</td><td>Sigma</td><td>T2573</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Flow cytometry 항체:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti human CD31-AF488</td><td>Biolegend</td><td>303109</td><td>희석 : 1:30, 로트 : B213986, RRID : AB_493075</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD45-퍼시픽 블루</td><td>바이오 레전</td>드 <td>304029</td><td>희석 : 1:20, 로트 : B218608, RRID : AB_2174123</td></tr><tr><td>anit human CD49f / ITGA6-PE</td><td>Serotec</td><td>MCA699PE</td><td>희석 : 1:20, 로트 : 0109, RRID : AB_566833</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD90 / Thy-1-AF700</td><td>Biolegend</td><td>328120</td><td>희석 : 1:30, 로트 : B217250, RRID : AB_2203302</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD106-AF421</td><td>BD</td><td>744309</td><td>희석 : 1:100, 로트 : 7170537, RRID : x</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD235ab-Pacific</td><td>블루 Biolegend</td><td>306611</td><td>희석 : 1:1000, 로트 : B224563, RRID : AB_2248153</td></tr><tr><td>안티 휴먼 E-cadherin-PE</td><td>Biolegend</td><td>147304</td><td>희석 : 1:20, 로트 : B197481, RRID : AB_2563040</td></tr><tr><td>안티 휴먼 FAP-APC</td><td>R & D</td><td>FAB3715A</td><td>희석 : 1:20, 로트 : AEHI0117111, RRID : x</td></tr><tr><td>인간 TruStain FcX</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>희석 : 1:20, 로트 : B235080, RRID : x</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.4mL 마이크로 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>4140</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 스크류 캡 마이크로 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72,692,405</td><td></td></tr><tr><td>5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함</td><td>) Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>48웰 세포 배양 클러스터</td><td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>50mL 폴리프로필렌 표준 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>70 &마이크로; m 세포 여과기 나일론</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Acculan 3Ti Dermatome</td><td>VWR</td><td>AESCGA670</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Dermatome 블레이드</td><td>VWR</td><td>AESCGB228R</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96well</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Primary cell culture dish</td><td>Corning</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>F.S.T</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>차 여과기</td><td>x</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Fibroblast 성장 매체:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX C-100 보충을 가진 strongAmnioMAX 기초 매체, 10% FCS 및 1% P/S</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

형광 활성 세포 선별에의 한 인간의 피부에서 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

섬유 아 세포는 많은 인간 질병의 발병 기 전에 연루 된 고도로 이종 세포 집단 이다. 인간의 피부 진 피에서, 섬유 아 세포는 전통적으로 그들의 조직학 지역화에 따라 피상적 또는 낮은 망상 진 피에 기인 했다. 마우스 진 피에서, 유 두 및 망상 섬유 아 세포는 생리 적 및 병리학 적 과정과 구별 될 수 있는 별개의 세포 표면 마커 발현 프로필에 대 한 분기 기능을 가진 2 개의 서로 다른 선 시대에서 시작 됩니다.
중요 하 게는, 피상적이 고 하 부 진 피 층에서의 익 지 않은 배양 으로부터의 증거는 적어도 2 개의 기능적으로 별개의 피부 섬유 아 세포가 인간적 인 피부병에 또한 존재 한다는 것을 건의 합니다. 그러나, 마우스 피부와 달리, 상이한 섬유 아 세포 서브 세트의 차별을 가능 하 게 하는 세포 표면 마커는 아직 인간의 피부를 위해 확립 되지 않았다. 우리는 2 개의 세포 표면 마커 섬유 아 세포 활성화 단백질 (FAP) 및 티 모 세포 항 원 (Thy1)/CD90. 사용 하 여 형광 활성 세포 선별 (FACS)을 통해 인간 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리를 위한 신규 한 프로토콜을 개발 하였다. 이 방법은 체 외 조작 없이 순수한 섬유 아 세포 서브 세트의 단 리를 가능 하 게 하 여, 유전자 발현에 영향을 미치는 것으로 나타나 조직 항상성 또는 질병에 관한 인간 피부 섬유 아 세포 서브 세트의 정확한 기능적 분석을 허용 병리학.

피부 조직을 처리 하기 위한 주요 단계에 대 한 개요는 도 1에 나타난 바와 같이, 피부의 dermatoming를 표시 하 고, 상이한 진피 층 (도 1b), 피하 지방의 제거 층 (도 1c) 및 표 피와 유 두와 진 피 (도 1d)의 분리 뿐만 아니라 수동 및 효소 적 조직 해리의 상이한 단계 들 (도 1e, F)을 갖는다. 3 개의 진 피 층의 구성표가 도 2에 제공 된다.
도 3 은 인간 피부 로부터 상이한 섬유 아 세포 서브 세트를 분석 하기 위한 유 세포 분석기 염색 패널의 게이팅 전략을 디스플레이 한다. 섬유 아 세포에 발현 되지 않는 추가의 세포 표면 마커는 최대 순도를 달성 하기 위해 면역 세포, 표 피 세포, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs), 적혈구 또는 내 피 세포와 같은 피부에 존재 하는 다양 한 다른 세포의 배제를 허용 고립 된 집단에서. 이러한 섬유 아 세포 집단의 동정을 위해 도 2 에 사용 된 동일한 FACS 패널을 사용 하는 것은 중요 하지 않지만, 이것은 우리의 권장 사항입니다. 하나는 다른 형광 염료로 라벨링 된 항 체를 사용 하거나 배제 마커의 조합을 변경할 수 있습니다.
참고로,이 프로토콜은 다른 피 질 국 소화, 유전자 발현 프로 파일 및 또한 기능으로 존재 하는 인간의 피부에서 3 개의 섬유 아 세포 집단의 동정을 가능 하 게 한다 (도 4). FAP+ CD90- 유 두 진 피에 풍부 하 고 fap+CD90+ 및 fapCD90+ 는 망상 진 피에 더 풍부 하다 (그림 4a). 3 개의 모든 하위 집단은 세포 배양에서 선별 시 전형적인 섬유 아 세포 형태학을 나타낸다 (도 4b). 흥미롭게도, 그 (것) 들은 망상 섬유 아 세포를 위한 특징 인 지방 세포로 분화 하는 그들의 능력에 관하여 다릅니다. 이러한 결과를 유전자 발현 프로 파일링과 결합 하 여 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)16 (도 4c)을 통해 FAP+CD90 세포가 일반적으로 기인 하는 높은 수준의 마커를 발현 한다는 것을 보여 CD90+ 세포가 높은 수준에서 CD36, ACTA2 및 p a r a와 같은 알려진 망상 마커를 표현 하는 동안 CD26와 같은 유 두 섬유 아 세포는, 우리는 FAP +CD90 세포가 유 두와 CD90에 속하는 결론 세포는 망상 혈통에 속한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig1.jpg"> 그림 1: 온전한 인간의 피부에서 진 피 단일 세포 현 탁 액의 분리. (A) 피부는 유 두와 망상 진 피에 전기 피부 분절으로 슬라이스 된다. (B) 상부 망상 진은 700 두께 (µm) 인 반면 인접 표 피를 가진 유 두는 300 두께 (상단)입니다. (C) 피하 지방 층은 메스로 하 부 망상 진 피를 긁어 냅니다. (D) 1 시간 동안 37 ° c에서 해리 효소 용액에 유 두 진을 인큐베이션 한 후, 표 피를 핀셋으로 쉽게 제거할 수 있다. (E) 상이한 진 피 층은가 위로 다진 후 콜라 게 나아 제 i, II 및 IV 및 히 알루로 니다 제의 효소 분해 혼합물로 옮겼다. (F) 37 ° c에서 1 h 해리 후, 조직 소화가 중단 되 고 티 스 트레이너를 통해 현 탁 액이 부 어 지 고 소화 되지 않은 피부 조각을 제거 합니다. (G) 세포 현 탁 액을 70 µm 세포 스 트레이너를 통해 한번 더 여과 하 고 4°c에서 10 분 동안 500 x G 에서 원심 분리 한 후, 원심 분리 후, 세포 펠 렛을 10% FCS로 1x PBS로 세척 하 고 FACS 염색을 위해 준비 한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig2.jpg"> 그림 2: 인간의 피부 진 피를 피부 분절와 망상 층으로 절편. 전체 두께의 피부를 유 두 진으로 얇게 썰어 서 얻어진 3 개의 경 피 층 (표 피 층을 포함 하는)을 나타내는 스킴 (u2012300), 상부 망상 (300 u20121) 및 하 부 망상 > 진 피 층 3) 피부 분절. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig3.jpg"> 도 3: 인간 진 피 섬유 아 세포 집단에 대 한 FACS 게이팅 전략. (A\u2012e) 먼저 셀은 단일 (B) 및 실행 가능한 (dapi) 셀에서 제어 됩니다. 면역 세포 (CD45+), 중간 엽 줄기 세포 (CD106+), 적혈구 (CD235ab)및 태평양 청색 음성 세포는 전자 cadherin (Ecad) 및 ITGA6 이중 음극 세포에서 더 게이팅 된다 (PE 채널, D ). ITGA6는 표 피 세포에 표시 된 마커입니다. 다음으로, CD31 양성 세포 (내 피 및 림프 세포)가 배제 된 (D) 2 개의 세포 표면 섬유 아 세포 마커를 FAP 및 CD90 중 어느 하나 또는 둘 모두를 발현 하는 3 개의 섬유 모 세포를 포함 한다: fap+CD90-, Fap+ CD90 + 및 fapCD90+ (E) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig4.jpg"> 그림 4: fap+ CD90+ CD90 +및 fap CD90+ 섬유아 세포는 피부 국 소화, 유전자 발현 및 기능 면에서 차이가 있습니다. (A) 유 두, 상 망상 및 하 부 망상 진 피 로부터 분리 된 게이트 섬유 아 세포의 대표적인 FACS 플롯. 게이팅 전략은 그림 3에 설명 되어 있습니다. FAP+CD90- 섬유 아 세포가 유 두 진 피에서 농축 된 (19.2%) 낮은 망상 진 피 (0.83%)에 비해. FAP+CD90+ 세포는 진 피 전체에 걸쳐 발견 될 수 있지만 가장 높은 풍부 함은 상부 망상 진 피 (40.7%)입니다. CD90+ 는 하 부 망상 진 피 (64.4%)에서 농축 된다. (B) 참고로, 3 개의 분류 된 집단은 모두 7 일 동안 배양 시 전형적인 섬유 아 세포 형태학을 표시 한다 (왼쪽). 흥미롭게도, 그들은 지질 분석에서 다르게 행동 합니다. 배양 14 일 후, fap +CD90- fap+CD90+ 및 fap CD90+ 가 쉽게 지질을 받는동안 지방 세포로 분화 하지 마십시오 (오른쪽; 오일 레드 O는 지질 베어링 세포 붉은 얼룩). 축척 막대 = 1000 µm 직접 정렬된 fap+CD90- 섬유 아 세포는 유 두와 섬유 아 세포 마커 CD26, NTN1 및 pdpn을 발현하는 반면, fap CD90+ 세포는 CD36, ACTA2 및 p a r γ, 망상 혈통에 의해 표현. * p ≤ 0.05; p ≤ 0.0005에 비해 FAP+/Cd90- 셀; # p ≤ 0.05; FAP-/cd90+ 셀에 비해 ≤ 0.0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 원고는 인간의 피부에서 유 두와 망상 섬유 아 세포를 분리 하기 위한 FACS 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이는 시험관 문화를 우회 하 고,이는 일반적으로 사용 되는 격리 프로토콜을 통해 명시적으로 불가피 한 것 이었습니다. 발산 된 섬유 아 세포 서브 세트는 기능적으로 구별 되 고 진 피 내에서 차별적 유전자 발현 및 국 소화를 표시 한다.

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

이 프로토콜은 세포 표면 마커 발현에 기초한 FAC 정렬에 의해 인간 피부로부터 기능적으로 뚜렷한 섬유아세포 서브세트의 분리를 용이하게 한다. 처음으로, 유두와 망상 섬유아세포는 체외 조작 없이 피부에서 직접 분리될 수 있다. 이것은 절제 된 문화를 사용하여 이전에 설립 된 격리 방법에 비해 거대한 발전이다.진피 섬유아세포 서브세트는 근종 조건에서 뚜렷한 기능을 제공합니다. 이 도구를 사용하면 암이나 염증성 피부 질환을 포함한 피부 병리학의 기능적 차이를 조사 할 수 있습니다. 인간 조직의 처리는 만족스러운 세포 수율을 달성하기 위하여 몇몇 사례가 필요하기 때문에, 우리는 이 과정을 촉진하고 가속화하기 위하여 시각적인 데모를 제공하고 싶습니다.전체 두께 진피를 준비하려면 표피가 아래쪽으로 향하는 두꺼운 필터 용지에 인간의 피부 한 조각을 놓습니다. 표피를 집게로 단단히 잡고 메스로 피하 지방 층을 긁어 냅니다. 그런 다음 조직을 5mm 너비의 스트립으로 썰어 페트리 접시에 넣습니다.진피를 유두와 망상 층으로 구분하려면 표피가 위쪽으로 향하는 두꺼운 필터 용지에 피부 조각을 놓습니다. 포셉으로 피부를 단단히 잡고 전기 피부로 300 마이크로미터 두께의 부분을 잘라냅니다. 표피와 유두 진피로 구성된 첫 번째 층을 페트리 접시에 옮기다.그런 다음 즉시 표피와 진피를 분리하거나 1x PBS를 추가하여 조직이 건조되지 않도록 하십시오. 다음으로, 피부막을 700 마이크로미터의 절삭 두께로 조정하고 나머지 진피를 슬라이스한다. 상부 망상 진피로 정의된 상부 슬라이스를 별도의 페트리 접시에 놓습니다.이어서, 잔류 하부 잔류 진피 층으로부터 메스로 피하 지방층을 긁어 내고 폐기한다. 다른 페트리 접시에 낮은 망상 진피를 수집합니다. 효소 소화 시술을 즉시 진행하거나 1x PBS를 추가하여 조직이 건조되지 않도록 하십시오.효소 소화를 수행하려면 5mm 피부 스트립 또는 표피/유두 진피를 페트리 접시에 위쪽으로 향하는 표피와 함께 10밀리리터의 효소 용액을 제공합니다. 그런 다음 페트리 요리를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 표피/유두 진피를 페트리 접시 뚜껑으로 옮기습니다.표피를 두 개의 집게로 상부 진피에서 분리하고 각각 진피의 가장자리를 잡습니다. 그 후 각 진피 층을 가능한 한 철저히 다진다. 조각이 작을수록 조직 소화가 좋습니다.그런 다음 소화 믹스를 준비합니다. 다진 조직을 10밀리미터의 소화 혼합물을 50mm 튜브로 옮기습니다. 동요 하에서 1 시간 동안 섭씨 37도에서 조직을 배양하십시오.소화 중에 튜브를 여러 번 반전시면 됩니다. 단일 세포 현탁액을 준비하려면 얼음에 소화 된 조직에 섬유 아세포 배지 10 밀리리터를 추가하여 효소 조직 소화를 중단하십시오. 다음으로, 일반 멸균 스테인리스 티 스트레이너를 통해 각 튜브의 내용물을 붓고 깨끗한 페트리 접시에 셀 서스펜션을 수집합니다.스트레이너를 중간 크기로 씻고 소화되지 않은 티슈 조각을 주사기 플런저 가장자리로 으깬다. 그 후, 수집된 세포 현탁액은 70마이크로미터 세포 여과기를 통해 50밀리리터 튜브로 들어갔다. 세포 스트레이너를 중간 크기로 헹구고 동일한 튜브를 통해 흐름을 수집합니다.그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 500배에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 제거하고 섬유아세포 배지의 5밀리리터로 세포 펠릿을 세척합니다. 원심 분리 단계를 다시 반복합니다.그 후, 상체를 제거하고, ACK 적혈구 용해 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 한다. 셀을 주변 온도에서 약 1분 동안 리시스 버퍼에 둡니다. 그런 다음 10 %의 FCS와 1 x PBS의 9 밀리리터를 추가하여 lysis를 중지합니다.튜브를 섭씨 4도에서 500배로 다시 원심분리하고, 그 후 상퍼를 폐기합니다. 세포가 표준 프로토콜에 따라 FAC 분류를 위해 염색된 후에, RNA 절연을 위한 350마이크로리터 또는 세포 배양을 위한 섬유아세포 성장 배지의 350 마이크로리터로 채워진 별도의 미세센심분리기 튜브로 3개의 섬유아세포 하위 집단을 분류합니다. 튜브를 즉시 반전시키고 리시스 버퍼 튜브를 액체 질소에 넣거나 섬유아세포 성장 중간 튜브를 얼음에 넣습니다.FACS에 이어 섭씨 4도에서 3분간 500배 g로 셀을 감산합니다. 그런 다음, 24웰 세포 배양 접시에서 섬유아세포 성장 배지에서 동일한 양의 세포를 플레이트하고 70%의 합류에 도달할 때까지 자라도록 둡니다. 다음으로, 배양세포 배지를 세포 분화 배지로 대체하고, 세포가 14일 동안 분화하게 한다.분화 일 14에서, 20 분 동안 4 %의 PFA로 세포를 수정합니다. 60%의 이소프로판놀로 우물을 씻고 완전히 증발합니다. 그런 다음 여과 된 오일 레드 O의 5 밀리모라리로 세포를 20 분 동안 얼룩지게합니다.20분 후, 스테인드 셀을 증류수로 4회 세척합니다. 전달된 빛으로 10배 배율로 반전된 현미경으로 물에 침지된 세포를 이미지합니다. 이 프로토콜은 다른 상인가 지역화, 유전자 발현 프로필 및 기능을 제시하는 인간 피부에 있는 3개의 섬유아세포 집단의 확인을 가능하게 합니다.FAP 양성 CD90-음수는 유두 진피에 풍부하지만 FAP 양성 CD90 양성 및 FAP 음수 CD90-양성은 망상 진피에 더 풍부합니다. 세 가지 정렬 된 하위 인구는 모두 7 일 동안 배양시 전형적인 섬유 아세포 형태를 표시합니다. 흥미롭게도, 그들은 사이포게네스 분석에서 다르게 행동합니다.14일 간의 문화 가후 FAP 양성 CD90-음수는 지방세포로 구별되지 않으며, FAP 양성 CD90 양성 CD90 양성 CD90 양성은 쉽게 선포생성을 겪습니다. 유전자 발현 프로파일링은 FAP 양성 CD90-음수 세포가 CD26, NTN 및 PDPN과 같은 유두 섬유아세포에 일반적으로 기인하는 높은 수준의 마커를 발현하는 반면, CD90 양성 세포는 CD36, 부드러운 근육 액틴 및 PPAR-감마와 같은 알려진 망상 마커를 높은 수준에서 발현하는 것을 보여줍니다. 우리는 FAP 양성 CD90 음성 세포가 유두에 속하고 CD90 양성 세포가 망상 혈통에 속한다는 결론을 내립니다.소화는 진피 조각이 철저하게 다진 경우 소화가 충분한 양의 소화 매체로 배양되는 경우에 가장 잘 작동합니다. 진피 섬유아세포 서브세트는 기능적으로 다양하다. 질병 병인의 맥락에서 그들의 기능을 탐구하는 것은 새로운 진단 및 치료 내정간섭을 위한 도로를 포장할 것입니다.

isolation-papillary-reticular-fibroblasts-from-human-skin

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting(형광 활성화 세포 분류에 의한 인체 피부에서 유두 및 망상 섬유아세포 분리)

인간의 피부 펀치 생검에서 섬유 아세포의 절편 배양 프로토콜은 낮은 통로 번호로 만 15-20 세포 은행을위한 4-8 주 이내에 피부 세포를 유도하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

우리는 인간 피부 생검에서 피부 상주 T 세포를 효율적으로 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 및 생체 외 배양을 위한 충분한 수의 생존 가능한 인간 피부 상주 림프구를 생성합니다.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

섬유아세포 행동은 다양한 임상 개체의 기초가 되지만, 주로 내재된 이질성으로 인해 특성화가 제대로 이루어지지 않은 상태로 남아 있습니다. 전통적인 섬유아세포 연구는 체외 조작, 생체 내 섬유아세포 거동 마스킹에 의존합니다. 세포 배양이 필요하지 않은 마우스 피부 섬유아세포의 분리를 위한 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

성체 줄기세포 생물학을 연구하기 위한 이상적인 모델은 쥐의 모낭입니다. 여기에서는 모낭, 줄기세포 및 표피 각질세포의 다양한 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시하며, 쥐 등쪽 피부의 효소 분해와 FACS 분석을 사용합니다.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직으로부터 1차 섬유아세포를 확립하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

학습하세요 인간 피부에서 형광 활성 세포 선별(FACS)을 이용하여 유두 및 망상 섬유아세포를 직접 분리하는 방법을. 이 기술은 체외 배양 없이 기능적으로 구별되는 섬유아세포 하위집단을 연구하여 피부 병리학 연구를 발전시킵니다.

형광 활성 세포 선별에의 한 인간의 피부에서 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리

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