Name: 작은 인도 몽구스(헤르페스 오로 punctatus)에서이오페녹산 유사체의 분석은 구강 광견병 예방 접종 생물학적 마커로 사용하기위한 세라 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 학습하세요 몽구스 혈청에서 LC-MS/MS를 이용한 이오페녹산 정량 분석 방법을. 단백질 침전 기법으로 광견병 백신 미끼 섭취 확인 생물학적 마커를 검출하는 이 기술은 야생동물 예방접종 모니터링에 활용됩니다.

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이 연구는 미국 농무부, 동물 및 식물 건강 검사 서비스, 야생 동물 서비스, 국립 광견병 관리 프로그램 및 IDT 바이오로지카(독일 데사우-로슬라우)의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

모든 절차는 승인 된 연구 프로토콜 QA-2597에 따라 USDA 국립 야생 동물 연구 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 다음 프로토콜은 몽구스 혈청에서 메틸-이오페노산검출분석 절차를 기술한다. 이 방법은 몽구스 혈청에서 에틸 이오페노산의 분석으로 시작된 반복 과정의 최종 버전입니다. 에틸-이오페노산의 초기 평가 동안 사소한 변형이 이 방법들을 수정하였고, 그 결과 아래에 제시된 최종 프로토콜이 생성되었다. 대표적인 결과에는 두 반복 모두에서 얻은 결과가 포함됩니다.
1. 솔루션 및 표준 준비
<ol><li>me-IPA 및 ET-IPA를 구입하십시오.</li>
	<li>이월 A의 경우, 1 mL의 포름산과 1L의 초순수(≥ 18 MΩ)를 결합하여 물에 0.1%(v/v) 포름산 1L을 준비합니다. 이월 B의 경우, 1mL의 포름산을 ACN 1L과 결합하여 아세토니트릴(ACN)에 0.1% (v/v) 포름산 1L을 준비합니다.</li>
	<li>희석제의 경우, TFA 1mL과 ACN 200 mL을 결합하여 ACN에서 0.5% (v/v) 삼중불소산(TFA)의 200 mL를 준비합니다.</li>
	<li>약 1,000 μg/mL의 농도로 ACN에서 me-IPA 및 et-IPA의 농축 IPA 재고 솔루션을 준비합니다.<ol>
<li>마이크로 저울에 me-IPA의 대략 10 mg을 무게하고 질량을 ± 0.0001 mg. 정량적으로 45 mL ACN을 사용하여 10 mL 클래스 A 체적 플라스크로 me-IPA를 전송한다. 모든 고체를 용해시키기 위해 1 분 초음파 처리한 다음 ACN으로 볼륨을 가져옵니다.</li>
		<li>각 스톡의 ~8 mL을 폴리 테트라플루오로에틸렌(PTFE) 라이닝 캡이 있는 호박색 8 mL 유리 병으로 옮니다. 실온(RT)으로 보관하십시오. 남은 재고를 유해 폐기물로 옮김.</li>
	</ol>
</li>
	<li>25x-7 me-IPA 스톡(표 1)의 경우 약 200 μg/mL로 ACN에서 me-IPA 주식을 준비합니다. 예: 1,000 μL 유리 주사기를 사용하여 me-IPA 농축 스톡의 1 mL을 단계 1.4.2에서 5 mL Class A 체적 플라스크로 옮김. ACN으로 부피를 희석하십시오. PTFE 라이닝 캡으로 호박색 8mL 유리 병으로 재고를 옮김을 옮김. RT에 보관하십시오.</li>
	<li>표1에 설명된 6개의 추가 25x me-IPA 주식을 준비합니다. 각 스톡에 대해, 반복 피펫터를 사용하여 표시된 볼륨을 호박색 8mL 호박색 유리 병과 PTFE 라이닝 캡으로 결합합니다. 각 재고를 RT에 보관하십시오.</li>
	<li>25x 대리 주식의 경우, 1.4.2단계에서 제조된 농축 재고로부터 약 10 μg/mL로 ACN에서 me-IPA의 대리 주식을 준비합니다. 농축 된 me-IPA 스톡의 0.100 mL을 100 μL 유리 주사기를 사용하여 10 mL Class A 체적 플라스크로 옮은 다음 ACN으로 부피를 희석합니다.<ol>
<li>PTFE 라이닝 캡으로 ~8 mL를 호박색 8mL 유리 병으로 옮김. RT에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표2에 설명된 바와 같이 2 mL 스크류 탑 유리 자동 샘플러 바이알에 두 가지 매질이 모두 포함된 4x 주식을 준비합니다.<ol>
<li>예를 들어, 스톡 4x-7을 2mL 바이알에 준비하려면 0.5 mL 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 1.5단계에서 25x-7 me-IPA 스톡의 0.20 mL를 추가합니다. 0.5 mL 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 1.7 단계에서 25x 서로게이트 et-IPA 스톡의 0.20 mL를 추가합니다.</li>
		<li>1mL 용량 팁이 있는 반복 피펫터를 사용하여 0.85 mL의 ACN을 추가합니다. 바이알을 단단히 캡으로 고정하고 5배 뒤집어 섞어보입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표3에 설명된 대로 2mL 스크류 탑 자동 샘플러 바이알로 표준 곡선을 준비합니다.<ol>
<li>예를 들어, 표준 7(Std 7)을 2mL 바이알에 준비하려면 0.5mL 용량 팁이 있는 반복 피펫을 사용하여 단계 1.8.2에서 4x-7 스톡의 0.20 mL를 추가합니다. 1 mL 용량 팁의 반복 파이펫터를 사용하여 0.60 mL의 초순수 DI 물을 추가하십시오. 바이알을 단단히 캡으로 고정하고 5배 뒤집어 섞어보입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 견본 준비
주의: 이 절차를 수행하는 직원은 광견병 사전 노출 예방의 전체 시리즈를 수신하고 연방 직업 보건 지정 의료 시설에서 0.5 IU 이상의 문서화 된 광견병 항체 역가가 있어야합니다. 직원은 추출을 수행하는 동안 항상 실험실 코트와 눈 보호를 착용해야합니다. 주의: 클래스 II 생체 안전 성 캐비닛에서 단계 2.3-2.6을 수행하십시오.
<ol><li>각 샘플에 대해 200-300 mg의 NaCl.를 포함하는 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 80 위치 플라스틱 랙에 튜브를 준비합니다. 2.6단계에서 사용할 수 있습니다. 참고: 많은 수의 시료에 마이크로 스쿱(또는 기타 소형 측정 장치)을 권장합니다.</li>
	<li>각 샘플에 대해 두 개의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 "A"로, 다른 하나는 "B"로 라벨을 붙입니다. 튜브를 80위치 플라스틱 랙에 배치합니다.</li>
	<li>클래스 II 생물 안전 성 캐비닛에 혈청 추출에 필요한 다음 재료와 장비를 배치 : 단계 2.1 및 2.2단계로 제조 된 미세 원심 분리튜브 (랙내), 와류 믹서, 0.5 mL 및 5 mL 용량 팁이있는 반복 파이펫터, 100-1,000 μL 공기 변위 1,000 μL 팁이 있는 파이펫, 희석제 및 초순수 DI 물 각각 약 100mL의 용기, 생물학적 위험 폐기물 용기.</li>
	<li>냉동 보관에서 세럼 샘플을 제거하고 생체 안전 성 캐비닛에서 RT로 따뜻하게하십시오. 소용돌이는 샘플링 전에 각 혈청 샘플을 혼합합니다.</li>
	<li>0.5 mL 용량 팁의 반복 피펫을 사용하여 0.050 mL의 몽구스 혈청을 튜브 "A"에 분배하고 25x 대리 스톡의 0.050 mL를 추가합니다. 그런 다음 5 mL 용량 팁이있는 반복 피펫을 사용하여 튜브 "A"에 희석제 0.950 mL을 추가합니다. 캡을 단단히 고정하고 10-15 s용 와류 믹스.</li>
	<li>2.1단계에서 미리 계량된 NaCl을 튜브 "A"로 분배하고 8-12s용 와류 믹스 3x를 분배합니다. 참고: 이제 샘플 랙을 클래스 II 생체 안전 캐비닛에서 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>12,000 x g에서 1분 동안 원심분리튜브 "A"를 수성 및 ACN 상을 분리한다. 100-1,000 μL 공기 변위 파이펫을 사용하여 상부 ACN 상에서 "B"를 튜브로 0.80 mL. 남은 용액을 튜브 "A"로 유해 폐기물로 옮기고 바이오 유해 폐기물 용기에 빈 튜브를 폐기하십시오.</li>
	<li>45°C 수조에서 N2 가스의 완만한 흐름으로 튜브 "B"에서 ACN 및 TFA를 제거합니다.</li>
	<li>반복 피펫터를 사용하여 튜브 "B"에 0.250 mL의 ACN을 추가하고, 4-5 s에 대한 소용돌이 혼합물을 넣고 12,000 x g에서 잠시 원심 분리 (2−4 s)하여 튜브 바닥에 액체를 수집합니다.</li>
	<li>5 mL 용량 팁이있는 반복 파이프터를 사용하여 튜브 "B"에 0.750 mL의 초순수 DI 물을 추가하고, 4-5 s의 소용돌이 혼합물을 한 다음 12,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 사용하여 샘플을 명확히합니다.</li>
	<li>1,000 μL 공기 변위 파이펫을 사용하여 상급기의 0.75 mL를 자동 샘플러 바이알로 옮김. 생물학적 위험 폐기물 용기에 파이펫 팁을 버리십시오.</li>
	<li>캡 자동 샘플러 바이알을 안전하게 분석하고 LC-MS/MS(섹션 4)로 분석합니다. 남은 용액을 튜브 "B"로 유해 폐기물로 옮기고 빈 튜브를 바이오 유해 폐기물 용기로 폐기하십시오. 모든 생물학적 유해 폐기물은 오토클레이브 또는 소각을 통해 폐기하십시오.</li>
</ol>3. 품질 관리 샘플
주의: 섹션 2에 설명된 주의 문구를 따르십시오.
참고: 다음 절차에서는 분석에 필요한 최소 품질 관리(QC) 샘플 수를 설명합니다. 충분한 제어 몽구스 혈청을 사용할 수있는 경우 각 수준에서 복제하는 것이 좋습니다.
<ol><li>NaCl 200-300 mg을 함유한 4개의 1.5 mL 미세원원지 튜브를 준비합니다. 튜브를 80위치 플라스틱 랙에 배치합니다.</li>
	<li>각 QC 샘플에 대해 두 개의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 "A"로, 다른 하나는 "B"로 라벨을 붙입니다. 튜브를 80위치 플라스틱 랙에 배치합니다.</li>
	<li>2.3단계를 반복합니다.</li>
	<li>냉동 보관에서 제어 몽구스 세럼을 제거하고 생체 안전 성 캐비닛에서 RT로 따뜻하게하십시오. 소용돌이는 샘플링 전에 대조군 혈청을 혼합한다.</li>
	<li>0.050 mL의 제어 몽구스 세럼을 0.5 mL 용량 팁의 반복 피펫을 사용하여 4 개의 1.5 mL "A" 튜브에 분배합니다.</li>
	<li>0.5 mL 용량 팁이 있는 반복 파이펫터를 사용하여 표 4에 명시된 4개의 QC 샘플 각각을 인증합니다. 각 QC 샘플을 단단히 캡하고 10-15 s용 와류 혼합물을 캡합니다.</li>
	<li>단계 2.6-2.12에 설명된 대로 추출 절차를 수행합니다.</li>
</ol>4. LC-MS/MS 분석
<ol><li>표5에 설명된 모든 매개 변수로 LC-MS/MS를 구성합니다. LC-MS/MS의 전원을 켜고 유량을 0.800mL/min로 설정하기 전에 컬럼이 70°C에 도달할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>데이터 수집 소프트웨어(재료 표)에서 시퀀스를 설정하여 품질 관리 샘플 및 알 수 없는 샘플로 구성된 각 배치 전후에 표준 곡선을 주입합니다.</li>
	<li>표 5에 나열된 매개 변수를 사용하여 모든 표준 및 샘플을 주입하고 MRM 이온 크로마토그램을 획득합니다.</li>
	<li>시퀀스 완료 후 LC-MS/MS를 끄고 모든 자동 샘플러 바이알을 유해 폐기물로 폐기하십시오.</li>
</ol>5. 정량화
<ol><li>데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 et-IPA를 내부 표준으로 사용하여 me-IPA에 대한 상대 적 응답과 상대 농도의 교정 곡선을 생성합니다. me-IPA에 대한 정량자 MRM 전이로부터 상대적 응답을 계산(556.6 → 428.7) et-IPA에 대한 MRM 전이(570.7 → 442.7)로 나눈 값. 1/x에 가중치가 가중되고 원점을 무시하는 2차 이차 함수를 사용하여 7레벨 교정 곡선을 구성합니다.</li>
	<li>다음 방정식을 사용하여 me-IPA의 혈청 농도(C혈청)를계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59373/59373eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> 여기서c계는 μg/mL 단위로 교정 곡선에서 계측기에서 계측기에서 결정되는 농도, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59373/59373eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> 1.25는 희석 인자, V파이널은 최종 시료 부피(1.0 mL) 및 V혈청은 mL(mL)의 혈청 부피( 0.050 mL 명목).</li>
</ol>

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</ol>

저자 AV 및 SO는 경구 광견병 백신 미끼 제조 업체의 풀 타임 직원입니다.

연구를 위해 개발된 LC-MS/MS 방법은 몽구스 혈청에서 me-IPA 및 et-IPA를 정확하게 정량화하기 위해 다중 반응 모니터링의 선택성을 활용하였다. MS/MS 검출의 선택성은 또한 분석 전에 혈청에서 단백질을 침전시키기 위하여 아세토니트릴에 전적으로 의존하는 간단한 정리 프로토콜을 허용했습니다.
이오페노산은 ACN에서 용해되지만 물에 실질적으로 용해되지 않습니다. ACN 추출로부터 물을 배제하기 위해, 염화나트륨을 첨가하여 맑은 물을 강제로 첨가하였다:ACN 상 분리는 수성(혈청) 상으로부터의 이온 강도를 증가시킴으로써 분리되었다. 휘발성 산 삼류 성 산 (TFA) 또한 iophenoxic 산 추출 하는 동안 protonatated 하 고 ACN 단계에서 더 쉽게 용해 될 것 이다 보장 하기 위해 추가 되었습니다. TFA는 LC-MS/MS 분석 전에 드라이다운 단계 동안 제거된다.
몽구스에서 혈액 무승부는 약 1 mL, ...

광견병 바이러스(RABV)는 부정적 감각의 단일 좌초 된 lyssavirus이며, 카니보라와 치옵테라 의 주문 내에서 다양한 야생 동물 저수지 종 들 사이에서 순환한다. 몽구스의 여러 종은 RABV의 저수지이며, 작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코와 서반구 1,2,3의 다른 카리브 해 제도에서 유일한 저수지입니다 . 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략을 통해 수행됩니다. 미국(미국)에서는 이 관리 활동이 USDA/APHIS/야생 동물 서비스 국립 광견병 관리프로그램(NRMP) 4에 의해 조정됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 광견병 백신및 몽구스를 위한 다양한 미끼 종류에 대한 연구는 몽구스를 위한 ORV 프로그램이가능하다는 것을 시사하는 유망한 결과로 실시되어 5,6,7,8.
ORV의 충격을 감시하는 것은 일반적으로 RV 항체 혈청증에 있는 변경을 평가하는 관련시키는 표적 종에 의하여 미끼 옥천을 추정에 의존합니다. 그러나, 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RV가 RABV 중화 항체 (RVNA)의 enzootic 및 배경 수준이 저수지 종에서 존재하는 지역에서 도전적일 수 있습니다. 이러한 상황에서, 미끼 또는 외부 미끼 매트릭스에 포함된 바이오마커가 유용할 수 있다.
다양한 생물학적 마커는 너구리(프로시온 로터)9,10,stoats (무스텔라에르민)11,12,유럽 오소리 등 수많은 종에서 미끼 섭취를 모니터링하는 데 사용되어 왔다. 멜레스 멜레스) 13,멧돼지(수스 스크로파)14,작은 인도 몽구스15 및 대초원 개 (Cynomysludovicianus)16,17,다른 사람의 사이에서. 미국에서, 수술 ORV 미끼는 종종 미끼 매트릭스에서 1% 테트라사이클린 바이오마커를 포함하여 미끼 흡기18,19를모니터링한다. 그러나, 테트라사이클린의 사용에 대한 단점은 환경에 항생제의 분포에 대한 우려가 증가하고 테트라 사이클린의 검출이 일반적으로 침략적이라는 것을 포함, 뼈를 얻기 위해 동물의 치아 추출 또는 파괴를 요구 샘플20. 로다민 B는 다양한 조직에서 마커로 평가되어 왔으며 모발 및 수염10,21에서자외선(UV) 빛및 형광을 이용하여 검출될 수 있다.
이오페노산(IPA)은 코요테(Canis latrans)에서 미끼 소비를 평가하는 데사용되어 온백색, 결정성 분말로, 북극여우(Vulpeslagopus)23,붉은 여우(Vulpesvulpes)24,너구리 9개 , 25,멧돼지14,붉은 사슴 (세르부스elaphus scoticus)26,유럽 오소리12 및 페렛 (M.furo)27,다른 여러 포유류 종 중. IPA의 체류시간은 종에 따라 2주 미만의 28,29,26주 이상, 26주 이상 국내견(Canislupusfamiliaris)에서 52주 이상이다. 보존 시간은 또한 용량 의존적 일 수있다31. 이오페녹산은 혈청 알부민에 강하게 결합하고 역사적으로 혈중 요오드 수치32를측정하여 검출되었다. 이러한 간접접근법은 UV 검출33을통해 이오페노산 농도를 직접 측정하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법에 의해 대체되었고, 결국 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법(LCMS)으로 대체되었습니다. 34,35. 이 연구를 위해, 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 이용한 매우 민감하고 선택적인 액체 크로마토그래피가 개발되어 다중 반응 모니터링(MRM)을 활용하여 이오페노산의 두 가지 유사체를 정량화합니다. 우리의 목표는 2-(3-하이드록시-2,4,6-triiodobenzyl) 프로파노산(메틸-IPA 또는 me-IPA) 및 2-(3-하이드록시-2,4,6-트리오도벤실)부타노산(에틸-IPA 또는 IPA 에서 전달될 때)의 마킹 능력을 평가하기 위해 이 LC-MS/MS 방법을 사용하는 것이었습니다. 포로 몽구스에게 미끼를.
몽구스는 시판되는 훈제 소시지와 생선 기름으로 미끼를 찍은 케이지 트랩에서 라이브 포획되었습니다. 몽구스는 개별 60 cm x 60cm x 40cm 스테인레스 스틸 케이지에 보관하고 시판되는 닭 허벅지로 일주일에 두 번 보충된 상업용 건식 고양이 사료를 매일 50g씩 먹였습니다. 물은 사용할 수 있는 광고 libitum. 우리는 위약 ORV 미끼에 포로 몽구스에 IPA, 에틸-IPA와 메틸-IPA의 두 가지 유도체를 전달했다. 모든 미끼는 분말 닭 계란및 젤라틴(재료표)을 함유하는 외부 코팅(이하 "미끼 매트릭스")을 가진 28 mmx 20 mm x 9 mm 호일 블리스터 팩으로 구성되었다. 미끼는 0.7 mL의 물 또는 IPA 유도체를 포함하고 약 3 g의 무게를 가했으며, 그 중 ~2 g은 외부 미끼 매트릭스였다.
우리는 3 개의 농도에서 16 포로 몽구스 et-IPA를 제공: 0.14% (2.8 mg et-IPA ~ 2 g 미끼 매트릭스; 3 남성 [m], 3 여성 [f]), 0.4 % (0.7 mL 블리스터 팩 볼륨에서 2.8 mg et-IPA, 3m, 3f), 및 1.0 % (0.7 mL 블리스터 팩 볼륨에서 7.0 mg 에틸-IPA; 2m , 2f). 의 전반적인 복용량 2.8 mg의 복용량 속도에 해당 5 mg/kg27,36 푸에르토리코에서 560 g의 평균 몽구스 무게에 따라. 우리는 연구가 일부 바이오 마커에 대한 맛 혐오가 일부 종37에서 농도 >1%에서 발생할 수 있음을 시사하는 가장 높은 농도로 1 %를 선택했습니다. 우리는 블리스터 팩에서 1% 용량만 제공했는데, 응집은 용매에서 용해되는 용질이 미끼 매트릭스에 균등하게 통합될 만큼 충분히 용해되는 것을 방지하였다. 1개의 대조군 (2m, 1f)은 멸균수와 IPA가 없는 미끼를 받았다. 우리는 아침 (~8 시)에 매일 유지 보수 배급을 먹이기 전에 몽구스에게 미끼를 제공했습니다. 미끼는 약 24시간 후에 제거되었다. 우리는 치료 전에 혈액 샘플을 수집, 하루 후 치료 후 다음 매주 최대 8 주 후 치료. 우리는 이소플루란 가스를 흡입하여 몽구스를 마취시키고 페렛38에대해 설명된 바와 같이 두개골 정맥의 정맥에 의해 전혈의 1.0 mL까지 수집했다. 우리는 전혈 샘플을 원심 분리하고, 혈청을 극저온으로 옮기고 분석할 때까지 -80°C에서 저장했습니다. 모든 동물은 동물의 건강에 반복 혈액 무승부의 영향을 최소화하기 위해 모든 기간 동안 샘플링되지 않았습니다. 대조군 동물을 0일째에 샘플링한 다음, 매주 최대 8주 동안 치료 후 샘플링하였다.
우리는 3 개의 농도에서 me-IPA를 전달: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) 그리고 0.14% (2.8 mg), 모든 미끼 매트릭스에 통합, 와 함께 2 남성과 2 치료 그룹 당 여성. 두 남성과 두 여성은 멸균 물과 IPA로 가득 미끼를 받았다. 미끼 제공 시간과 몽구스 마취는 위에서 설명합니다. 우리는 1 일째에 치료 전에 혈액 샘플을 수집한 다음 매주 최대 4 주까지 치료 후.
우리는 정상성에 대한 혈청 농도 데이터를 테스트하고 다른 치료 그룹의 혈청 IPA 농도에 대한 추정 수단. 우리는 선형 혼합 모델을 사용하여 개인에 걸쳐 풀린 평균 혈청 et-IPA 농도를 비교했습니다. 미끼 유형(매트릭스/블리스터 팩)은 실험일 이외에 고정된 효과가었으며, 동물 ID는 무작위 효과였습니다. 모든 프로시저는 공통 통계소프트웨어(자료표)를사용하여 실행되었고 유의성은 α =0.05로 평가하였다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴, 옵티마 등급</td><td>Fisher</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204</td><td></td></tr><tr><td>C18 컬럼, 2.1 x 50mm, 2.5-&마이크로; m 입자 크기</td><td>Waters Corp.</td><td></td><td></td>186003085</tr><tr><td>ESI 출처</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>G1958-65138</td><td></td></tr><tr><td>에틸-이오페녹산, 97 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N/A</td><td>Lot</td></tr><tr><td>MKBP5399V름산, LC/MS 등급</td><td>Fisher</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>LCMS 소프트웨어</td><td>Agilent</td><td>MassHunter 데이터 수집 및 정량 분석</td><td></td></tr><tr><td>메틸-요오페녹산, 97 % (w/w)</td><td>PR EuroChem Ltd.</td><td>N/A</td><td>Lot</td></tr><tr><td>PR0709514717 미세분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP6U</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td></td></tr><tr><td>MS/MS</td><td>Agilent</td><td>G6470A</td><td></td></tr><tr><td>N-Evap</td><td>Organomation</td><td>115</td><td></td></tr><tr><td>Oral Rabies Vaccine Baits</td><td>IDT Biologika, Dessau Rossleau, 독일</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>프로필-요오페녹산, 99 % (w/w)</td><td>PR EuroChem Ltd.</td><td>N/A</td><td>Lot PR100612108RR</td></tr><tr><td>Repeat 피펫터</td><td>Eppendorf</td><td>M4</td><td></td></tr><tr><td>Screw-top autosampler 바이알 캡, PTFE 라이닝</td><td>Agilent</td><td>5190-7024</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, ACS 등급 인증</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Statistical Software Package</td><td>SAS Institute, Cary, North Carolina, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산, 99 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Agilent</td><td>1290 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Glas-Col</td><td>099A PV6</td><td></td></tr><tr><td>0.2-mL 피펫터 팁</td><td>Eppendorf</td><td>30089.413</td><td></td></tr><tr><td>0.5-mL 피펫터 팁</td><td>Eppendorf</td><td>30089.421</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>14-666-325</td><td></td></tr><tr><td>1250-& 마이크로; L 용량 피펫 팁</td><td>GeneMate</td><td>P-1233-1250</td><td></td></tr><tr><td>1-mL 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>30089.43</td><td></td></tr><tr><td>2-mL 황색 스크류 탑 자동 시료 주입기 바이알</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td></td></tr><tr><td>5-mL 피펫 팁</td><td>Eppendorf</td><td>30089.456</td><td></td></tr><tr><td>80-Position microcentrifuge tube rack</td><td>Fisher</td><td>05-541-2</td><td></td></tr><tr><td>8-mL 앰버 바이알 PTFE 라이닝 캡</td><td>Wheaton</td><td>224754</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) 이소프로판올</td><td>Fisher</td><td>A459</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; L 공기 변위 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr></tbody></table>

작은 인도 몽구스(헤르페스 오로 punctatus)에서이오페녹산 유사체의 분석은 구강 광견병 예방 접종 생물학적 마커로 사용하기위한 세라

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

작은 인도 몽구스(Herpestes auropunctatus)는푸에르토리코에서 광견병 바이러스 (RABV)의 저수지이며 매년보고되는 동물 광견병 사례의 70 % 이상을 포함합니다. 야생 동물 저수지에서 RABV 순환의 제어는 일반적으로 구강 광견병 예방 접종 (ORV)의 전략에 의해 수행됩니다. 현재 푸에르토리코에는 야생 동물 ORV 프로그램이 없습니다. 구강 광견병 백신 및 몽구스를 위한 각종 미끼 모형에 대한 연구는 유망한 결과로 실시되었습니다. ORV의 성공을 모니터링하는 것은 일반적으로 RABV 중화 항체 (RVNA) 포스트 예방 접종의 변화를 평가하는 것을 포함하는 표적 종에 의하여 미끼 섭취를 추정에 의존합니다. 이 전략은 활성 야생 동물 ORV 프로그램을 가진 지역 또는 RABV가 Enzootic 및 RVNA의 배경 수준이 저수지 종에 존재하는 지역에서 해석하기 어려울 수 있습니다. 이러한 상황에서, 백신 또는 미끼 매트릭스와 통합된 바이오마커가 유용할 수 있다. 우리는 미끼 내부0.4 %와 1 %의 농도에서 에틸 이오페노산 (et-IPA)을 함유 한 16 개의 포로 몽구스 위약 ORV 미끼를 외부 미끼 매트릭스에서 제공했습니다. 우리는 또한 외부 미끼 매트릭스에서 0.035 %, 0.07 %, 0.14 %의 농도로 메틸 - 이오페노산 (me-IPA)을 함유 한 12 개의 포로 몽구스 ORV 미끼를 제공했습니다. 우리는 미끼 제공 하기 전에 혈 청 샘플을 수집 하 고 최대 8 주 포스트 제공에 대 한 다음 매주. 우리는 혈청에서 아세토니트릴로 이오페노산산을 추출하고 액체 크로마토그래피/질량 분석법을 사용하여 정량화했습니다. 우리는 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 et-IPA 또는 me-IPA에 대한 세라를 분석했습니다. 우리는 et-me-IPA에 대해 적어도 8 주와 4 주 동안 적절한 마킹 능력을 발견했습니다. 두 IPA 유도체 모두 몽구스에서 ORV 미끼 섭취량의 현장 평가에 적합할 수 있다. 몽구스 세라에서 마커의 수명으로 인해 연속 평가 중에 동일한 IPA 유도체를 사용하여 결과를 혼동하지 않도록 주의해야 합니다.

me-IPA 분석에서 대표적인 이온 크로마토그램은 그림1에 제시되어 있다. 대조군 몽구스 혈청(도1A)은지시된 보존 시간에 et-IPA(대리 analyte)의 보존 시간 및 me-IPA의 부재를 도시한다. 품질 관리 샘플(그림1B)은me-IPA에 대한 정량자 및 한정자 전환뿐만 아니라 et-IPA로부터 의 me-IPA의 기준선 분리를 도시한다. 도 1C는 33.5 μg/mL me-IPA의 관찰된 혈청 농도를 가진 연구에서 대표적인 샘플을 나타낸다.
me-IPA 분석의 대표적인 교정 곡선은 그림2에 나...

우리는 에틸 또는 메틸 이오페노산과 함께 포로 몽구스 위약 경용 광견병 백신 미끼를 바이오마커로 제공하고 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 사용한 새로운 액체 크로마토그래피를 사용하여 미끼 섭취를 검증했습니다.

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

우리는 몽구스 혈청에서 이오페녹스산을 검출하고 정량화하는 절차를 설명했습니다. 결과는 iophenoxx산이 종에 있는 beta uptake를 확인하기 위하여 생물학 마커로 이용될 수 있다는 것을 건의합니다. 이 방법의 주요 장점은 단백질 강수 기술을 수행하기 위해 간단한 을 사용하여 10 억 수준 당 부품에서 iophenoxic 산 유사체의 정량화를 허용한다는 것입니다.이동 상 A의 경우 포믹산 1밀리리터와 1리터의 초순수수를 결합합니다. 이동 상 B의 경우 포믹산 1밀리리터와 아세토닐릴 1리터를 결합합니다. 희석제의 경우, 아세토나이트 200밀리리터와 트리플루오로아세트산 1밀리리터를 결합합니다.다음으로, 마이크로 밸런스에 메틸 IPA의 약 10 밀리그램의 무게, 플러스 또는 마이너스 0001 밀리그램질량을 기록. 메틸-IPA를 10 밀리리터 급 A 체피플라스크로 정량적으로 전송하여 아세토닐트리어의 4~5밀리리터를 사용한다. 모든 고체를 용해한 다음 아세토나이트로 볼륨을 가져오기 위해 1분 동안 초음파 처리합니다.각 스톡의 약 8밀리리터를 PTFE 라이닝 캡이 달린 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 옮기고 샘플을 실온에 보관합니다. 그런 다음 남은 주식을 유해 폐기물로 옮기습니다. 25X 재고의 경우 7 개의 메틸 IPA 재고는 밀리리터 당 약 200 마이크로 그램에서 메틸 IPA 및 아세토나이트 의 주식을 준비합니다.주식의 1 밀리리터를 5 밀리리터 플라스크로 옮기고 아세토닐로 부피로 희석합니다. 그런 다음, PTFE 줄 지어 모자와 8 밀리리터 호박 유리 유리 바이알에 주식을 전송하고 실온에서 저장합니다. 반복 피펫을 사용하여 PTFE 라이닝 캡이 있는 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 텍스트 프로토콜에 설명된 6개의 추가 25X 메틸-IPA 주식을 준비하고 실온에 보관합니다.25X 대리 주식의 경우, 농축 된 에틸-IPA 주식의 0.1 밀리리터를 10 밀리리터 클래스 A 볼륨 플라스크로 100 마이크로 리터 유리 주사기를 사용한 다음 아세토나이트로 부피로 희석합니다. 대리 스톡의 약 8밀리리터를 PTFE 라이닝 캡이 달린 8밀리리터 앰버 유리 바이알로 옮기고 실온에서 보관하십시오. 남은 주식을 유해 폐기물로 옮기.다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 메틸-IPA와 에틸-IPA를 모두 포함하는 4배 의 주식을 10밀리리터 스크류 톱 유리 자동 샘플러 바이알로 준비한다. 예를 들어, 재고 4X7을 준비하려면 0.

analysis-iophenoxic-acid-analogues-small-indian-mongoose-herpestes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 감염된 쥐의 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색을 보여줍니다. 이 과정에는 탈파라핀화(deparaffinization) 및 알코올 처리(alcohol treatment)가 포함되며, 항원 접근성을 높이기 위한 단백질 분해 처리(proteolytic treatment)가 이어집니다. 면역조직화학 염색을 통해 붉은 침전물이 나타나 조직 단면에 광견병 항원이 존재함을 확인합니다.

광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색

직접 급속 면역 조직 화학 검사 (DRIT)는 광견병 진단을위한 직접 형광 항체 (DFA) 테스트에 대한 인식 대안 동물 보건 및 세계 보건 기구 (OIE / WHO)에 대한 세계 기구를 제공합니다. 이 시험은 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 두뇌 노출에 따라 대략 1 시간에서 수행 될 수있는 필드 기반 응용 프로그램을 허용합니다.

직접 신속한 면역 기능 화학 검사를 사용하여 향상된 광견병 감시

중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

이 프로토콜의 목표는 광견병 검사를 위한 만족스러운 조직 샘플을 얻기 위해 크고 작은 동물에서 안전한 부검 기술을 입증하는 것입니다.

크고 작은 동물의 광견병 부검 기법

여기에서 우리는 광견병 백신에 있는 면역원성 당단백질 내용을 결정하기 위하여 간접적인 ELISA 샌드위치 면역 포착을 기술합니다. 이 시험은 당단백질 트리머를 인식하는 중화 단일클론 항체(mAb-D1)를 사용한다. 그것은 생산 하는 동안 백신 힘의 일관성을 따라 생체 내 NIH 테스트에 대 한 대안.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

이 프로토콜은 체외 전사를 사용하여 다양한 소 뇌 해부학 구조 내에서 광견병 바이러스 뉴클레오프로틴(N) 유전자 복사 수를 결정하기 위한 qRT-PCR 기반 접근법을 제시한다.

다양한 소 뇌 구조에서 광견병 바이러스의 양

이 방법은 광견병 항원을 미리 결정된 지연 후에 박동성 방출을 가능하게 하는 구조적 및 물질적 특성을 가진 생분해성 고분자 미세입자로 캡슐화하는 것을 설명합니다. 입자 코어에서 회수된 항원의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 평가는 입자 제조를 통해 손상되지 않은 삼량체 광견병 바이러스 당단백질의 존재를 확인합니다.

광견병 항원을 캡슐화하는 박동성 고분자 미세입자의 제조

여기에서는 나노포어 기술을 사용하여 광견병 바이러스(RABV) 게놈을 특성화하기 위한 빠르고 비용 효율적인 워크플로우를 제시합니다. 이 워크플로우는 지역 수준에서 유전체학 정보 감시를 지원하기 위한 것으로, 광견병 통제 조치를 안내하기 위해 순환하는 RABV 계통 및 지역 계통 발생 내 배치에 대한 정보를 제공합니다.

나노포어 기술을 사용한 광견병 바이러스의 신속한 특성 분석을 위한 전체 게놈 염기서열 분석

이 원고의 목적은 광견병 특이적 IgG 및 IgM 항체 검출을 위한 광견병 간접 형광 항체 검사의 사용을 조사하는 것입니다.

광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 광견병 IgG 및 IgM 항체 검출

이 프로토콜은 조직 채취에서 결과 해석에 이르기까지 pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석을 보여주며, 여기에는 일부 비광견병 lyssavirus 및 lagomorphs에 대한 분석 성능을 개선하기 위한 프라이머 염기서열 및 제형 업데이트가 포함됩니다. 또한 단일 웰 LN34 다중화(LN34M) 형식에 대한 분석 설정을 시연합니다.

업데이트된 멀티플렉스 LN34 Real-Time 역전사-중합효소 연쇄 반응 분석을 통한 동물 광견병의 사후 진단

학습하세요 몽구스 혈청에서 LC-MS/MS를 이용한 이오페녹산 정량 분석 방법을. 단백질 침전 기법으로 광견병 백신 미끼 섭취 확인 생물학적 마커를 검출하는 이 기술은 야생동물 예방접종 모니터링에 활용됩니다.

작은 인도 몽구스(헤르페스 오로 punctatus)에서이오페녹산 유사체의 분석은 구강 광견병 예방 접종 생물학적 마커로 사용하기위한 세라

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