Name: HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 배우세요 HOX 유전자 좌위 특이적 sgRNA 라이브러리를 활용한 CTCF 경계 식별 방법입니다. 이 기술은 조기 배아 발달 및 백혈병 연구에서 비암호화 요소의 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

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또한 저자는 원고를 편집 하기 위해 니콜라스 Cesari를 감사 합니다. 작품은 건강의 국립 연구소 (상훈, R01DK110108, R01CA204044)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. CTCF sgRNALibrary 온라인 도구를 사용 하 여 디자인
<ol><li>유전 섭 동 (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) 플랫폼 (GPP) 디자이너 도구를 사용 하 여 인간 HOX loci에서 CTCF 바인딩 사이트를 대상으로 sgRNA 디자인.</li>
	<li>1070 sgRNAs sgRNAs 303 무작위 대상 유전자, 60 긍정적인 컨트롤, 500 인간 대상으로 컨트롤 및 207 CTCF 요소 또는 lncRNA 유전자 (그림 1, 표 1)을 대상으로 대상으로 구성 된 총 음성 합성. 각 대상 DNA 요소 5-10 다른 sgRNAs 대상 이다.</li>
</ol>2. sgRNA 라이브러리 복제
<ol><li>
CRISPR 백본 lentiviral 벡터 (lentiCRISPRv2)에 합성된 oligonucleotides 클론.
	<ol>
<li>LentiCRISPRv2 벡터 2 h 37 ° C에서 BsmBI 제한 효소로 다이제스트.</li>
		<li>큰 밴드의 존재에 대 한 보고 (약 12,873 bp)에 BsmBI 소화 후 젤 젤 추출 키트와 함께 그것을 정화 하 고. 참고: 2 kb 작은 필러 조각, 소화 후 젤에도 있지만이 무시 됩니다.</li>
		<li>위하여 합성된 oligonucleotides 및 150 LentiCRISPR 벡터 소화의 ng LentiCRISPR DNA, 1 µ L 10 µ M oligos, 10 x T4 리가 버퍼의 2 µ L, T4 리가의 1 µ L의 소화 그리고 다음 품 어 그들 16 ° C에서 하룻밤.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
확대를 위한 전기 유능한 세포에 lentiviral CRISPR/sgRNA 라이브러리 변환.
	<ol>
<li>1.8에는 electroporator을 준비 kV, 200 Ω와 25 µ F. 미리 복구 SOC 미디어 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 그리고 사전 37 ° c.에 파운드 암 피 실린 항생제 접시를 따뜻하게</li>
		<li>유능한 세포 10 분 동안 얼음에 녹여</li>
		<li>1.5 mL 마이크로 원심 튜브와 1mm electroporation 큐 벳 얼음에 준비 합니다.</li>
		<li>10 ng / µ L 도서관 플라스 미드 DNA 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 유능한 세포의 25 µ L로의 1 µ L를 혼합 하 고 수동으로 튜브의 하단에 몇 번을 터치 하 여 부드럽게 혼합.</li>
		<li>베트 충분히 추워요, 일단 그것에 DNA/유능한 세포 혼합물을 옮기십시오. 싱크대에 두 번 누르고 조직 종이 베트의 외관에서 어떤 물방울을 닦아. 다음은 멧 electroporation 모듈에 놓고 펄스를 누릅니다.</li>
		<li>37 ° C 미리 따뜻하게 SOC 미디어의 975 µ L을 추가 하는 즉시. 아래로 pipetting 15 mL 튜브에 의해 혼합.</li>
		<li>회전 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>100 µ L 셀 SOC 미디어의 900 µ L로 희석 하 고 파운드 암 피 실린 항생제 한 접시에 100 µ L를 놓습니다. 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
제조업체의 프로토콜에 설명된대로 맥시 준비 열을 사용 하 여 결합 된 식민지에서 플라스 미드 DNA를 추출 합니다.
	<ol>
<li>파운드 한 천 배지에서 모든 식민지를 긁어 파운드 암 피 실린 항생제 매체의 2 mL의 스타터 문화를 접종 하 고 활기찬 동요 (~ 200 x g) 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>초보 문화 1: 500 파운드 암 피 실린 매체의 100 mL로 희석 하 고 활기찬 동요 (~ 200 x g)와 12-16 h 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에 15 분 동안 6000 x g 에서 원심 분리에 의해 세균성 세포 pellet을 수확</li>
		<li>다시 서 스 펜 션 버퍼의 10 mL에서 세균 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
		<li>세포의 용 해 버퍼의 10 mL와 함께 일시 중단 된 펠 릿을 lyse 하 고 적극적으로 반전 4-6 시간. 실 온에서 5 분 동안 lysate를 품 어.</li>
		<li>냉장된 중립화 버퍼의 10 mL와 lysate 무력화. 부드럽게 반전 튜브 4-6 시간으로 혼합 하 고 얼음에 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에 30 분 동안 13500 x g 에서 스핀 다운 신속 하 게 새로운 튜브에 플라스 미드 DNA를 포함 하는 상쾌한 전송.</li>
		<li>2.3.7, 단계를 반복 하 고 신속 하 게 새로운 튜브에 플라스 미드 DNA를 포함 하는 상쾌한 전송.</li>
		<li>재래식 버퍼의 10 mL를 적용 하 여 열을 equilibrate 고 중력 흐름에 의해 빈을 열 수 있습니다.</li>
		<li>열에는 상쾌한을 추가 하 고 중력 흐름에 의해 수 지를 입력할 수 있도록.</li>
		<li>워시 버퍼 세척 2 x 30 mL로 열.</li>
		<li>차입 버퍼의 15 mL와 함께 DNA elute</li>
		<li>실 온 소 프로 파 놀 eluted dna의 10.5 mL와 DNA를 침전. 믹스 및 스핀 15000 x g 4 ° C에서 30 분 동안에 즉시 아래로 부드럽게는 상쾌한을 가만히 따르다.</li>
		<li>70% 에탄올, 10 분 15000 x g 에서 원심 분리기 DNA 펠 릿의 5 mL와 함께 DNA 펠 릿을 세척 하 고 맑은 상쾌한 삭제.</li>
		<li>2.5.14 두 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>10 분 동안 15000 x g 에서 펠 릿 DNA를 원심 고 부드럽게는 상쾌한 DNA 펠 렛을 방해 하지 않고 가만히 따르다.</li>
		<li>5-10 분, 펠 릿 건조 하 고 필요한 양의 버퍼 (TE 버퍼, pH 8.0)에서 DNA를 분해.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 높은 Titer sgRNA 라이브러리 Lentivirus 세대
<ol><li>준비 셀: 문화 HEK293T 세포에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% (vol/vol) 페니실린-스 (PS) 항생제 T-25 플라스 크에 보충. 37 ° C, 5% CO2배양 기에 넣어.</li>
	<li>Lentivirus 패키지: 공동 transfect 2 패키지 플라스 미드 (psPAX2)의 15 µ g과 10 µ g 바이러스를 수확 하기 전에 48 h에 대 한 봉투 플라스 미드 (pMD2.G)의 단계에서 순화 된 라이브러리 벡터의 20 µ g HEK293T 셀.</li>
	<li>바이러스 컬렉션: 후 48 h, collectthe 바이러스 표면에 뜨는 0.45 μ m 낮은 단백질 바인딩 PVDF 멤브레인 통해 표면에 뜨는 바이러스 필터링.</li>
	<li>바이러스 농도: lentiviral 상쾌한 50-fold 집중 장치를 사용 하 여 집중 하 고 5 단계에서 바이러스 나 테스트.</li>
	<li>바이러스 저장소: 약 수는 집중 된 바이러스 및 저장소-80 ° C 냉동 고에.</li>
</ol>4. 최적화 된 Puromycin 농도
<ol><li>백혈병 세포 배양: 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 T-125 플라스 크에서 페니실린-스 (PS) 항생제 x 1 보충 RPMI 1640 문화 MOLM13 AML 셀. 37 ° C, 5% CO2배양 기에 넣어. 참고: 세포는 일반적으로 모든 4-5 d 70 %confluency 보다는 더 많은 분할 비율 1:4 또는 1:6, 도달 하는 세포를 허용 하지에 전달 됩니다.</li>
	<li>잘 (2.0 x 104 셀) 당 2 mL의 총 볼륨에서 104 셀/mL, x 1.0의 밀도와 12-잘 접시의 MOLM13 세포를 설정 합니다.</li>
	<li>
시간-과정 분석 결과: 치료 MOLM13 셀 puromycin 증가 농도 (0.1 µ g/mL, 0.2 µ g/mL, 0.5 µ g/mL, 1.0 µ g/mL와 2.0 µ g/mL)에 7 일을
	<ol>
<li>하루 0에 puromycin 치료 없이 MOLM13 세포를 설정 하 컨트롤로 puromycin 치료 없이 3 복제 우물을 하루 0에서에서 7 일을 합니다.</li>
		<li>3 복제 우물을 포함 하는 각 실험 조건으로 0.1 µ g/mL, 0.2 µ g/mL, 0.5 µ g/mL, 1.0 µ g/mL, 2.0 µ g/mL, MOLM13 셀을 별도로 취급 합니다.</li>
		<li>라이브 셀 비율을 계산 하 고 하루 7 포함 된 모든 조건에 0에서 생존 곡선.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생존 곡선: Trypan 파랑 및 수 생존 매일 생존 곡선 각 puromycin 농도 가진 셀을 얼룩.</li>
	<li>최소한의 puromycin 농도 최적화: Trypan 푸른 얼룩 통해 최소 puromycin 농도 모든 MOLM13에 세포 5-7 일 사이 사망 확인.</li>
</ol>5. 적정 Lentiviral 도서관 MOLM13 백혈병 세포에서의
<ol><li>급성 골수성 백혈병 세포 준비: MOLM13 AML 셀 변환 매체와 수집 (RPMI 1640, 10 %FBS, 1 %PS 및 8.0 µ g/mL 코팅 매체) 1.5 x 10의 밀도에서6 셀 /mL.</li>
	<li>MOLM13 셀에 각 잘 106 셀 x 1.5 12-잘 접시에 놓습니다.</li>
	<li>lentivirus 녹여:-80 ° C 냉동 고에서 집중된 lentivirus를 제거 하 고 얼음에 녹여.</li>
	<li>0, 1, 2.5, 5를 포함 하 여 별도 우물에 집중된 lentivirus의 다른 복용량 믹스 MOLM13 셀 7.5, 10 µ L (총 6 그룹).</li>
	<li>즉시 1000 x g 33 ° C에서 2 시간에이 혼합물을 원심 고 12-잘 접시를 다시 4 h에서 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 전송.</li>
	<li>4 h 후 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g 에 감염 된 세포를 스핀.</li>
	<li>부드럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음 다시 신선한 미디어 (RPMI 1640, 10 %FBS 1 %PS) transduced 셀을 일시 중단 및 다음 T-25 플라스 크를 전송 고 puromycin 없이 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>48 h 후 2 플라스 크 (2 그룹)에 이러한 셀을 분할: 1 µ g/mL puromycin 5 일 동안 치료 하는 실험적인 그룹 그리고 puromycin 5 일에 대 한 치료를 하지 않고 제어 그룹.</li>
	<li>모든 비 불리고 제어 셀 죽 었 때까지 4 단계에 따라 1 µ g/mL puromycin 5 일 동안 puromycin 선택 수행 합니다. 신선한 미디어 2 일 마다 교환입니다.</li>
	<li>라이브 셀 puromycin puromycin 치료 없이 세포의 수와 처리 수를 나누어 변환에 대 한 최적화 된 MOI 값을 측정 합니다.</li>
</ol>6. 풀링된 CRISPR-Cas9 코 라이브러리의 변환
<ol><li>Lentivirus와 변환: 1.5 x 106 MOLM13 셀 중간에 sgRNA 풀링된 lentivirus의 0.3 나 감염 (RPMI 1640, 10 %FBS, 1 %PS, 및 8 µ g/mL 코팅 매체) 6 잘 플레이트에 lentivirus 감염 없이 셀을 사용 하 여 컨트롤.</li>
	<li>즉시 원심에서 spinfect에 33 ° C에서 2 시간에 대 한 1000 x g 6 잘 플레이트 세포 고 4 h 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 다시 플레이트를 전송.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 400 x g 에 감염 된 세포를 스핀.</li>
	<li>부드럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한 발음 다시 신선한 미디어 (RPMI 1640, 10 %FBS 1 %PS) transduced 셀을 일시 중단 및 다음 T-25 플라스 크를 전송 고 puromycin 없이 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>48 h 후 5 일 동안 1 µ g/mL puromycin 셀을 취급 합니다. 2 일 후 신선한 미디어에 대 한 교환 하 고 최적의 세포 조밀도에 계속.</li>
	<li>희석 방법 제한 96 잘 접시에 단일 클론 씨 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 이러한 단일 클론을 품 어. 3-4 주 동안 그들을 문화.</li>
	<li>단일 셀에 인구 성장, 후 puromycin 선택 추가 문화에 대 한 24-잘 접시로 셀의 절반을 전송 하 고 단계에서 이러한 클론을 확인 합니다. 셀의 나머지를 유지.</li>
</ol>7. 심사 단계 실시간 정량 Pcr는 풀링된 CRISPR-Cas9 코 도서관
<ol><li>1 단계 역전사 연쇄 반응 (단계 RT-정량)와 마커 유전자 HOXA9 의 식을 계산 하 여 심사 하는 sgRNA 통합된 복제의 효과 결정 합니다. 참고: HOXA9 높은 leukemogenesis22,23MOLM13 AML 셀에 표시 됩니다.</li>
	<li>수는 sgRNA MOLM13 셀 및 전송 1 x 104 셀 당 96 잘 PCR 접시에 잘 통합.</li>
	<li>5 분, 1000 x g 에서 튜브 원심 그리고 철저 하 게 제거 하 고 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 한 피펫으로와 상쾌한 삭제.</li>
	<li>125 µ L의 PBS 버퍼에 포함 된 셀을 세척 하 고 원심 1000 x g 5 분에 관. 다음는 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 120 µ L을 제거 하 고 각 잘에서 PBS의 약 5 µ L을 유지.</li>
	<li>각 잘을 포함 하는 세포 세포의 용 해 버퍼, 가수분해 K 솔루션 (10 mg/mL)의 1 µ L DNase 솔루션 (1 mg/mL)의 1 µ L의 48 µ L 셀 세포 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다. 다음 셀 펠 릿을 다시 중단 5 번 위아래로 피펫으로.</li>
	<li>37 ° C에서 5 분 뒤 실 온에서 10 분 동안 혼합 품 어 그리고 다음 75 ° C 5 분.</li>
	<li>-80 ° C 냉장고에 세포 lysate를 저장 합니다.</li>
	<li>1 단계 실시간 정량 Pcr 반응의 준비: 해빙 단계 반응 혼합 및 다른 반응 구성 요소 4 ° c 다음 스핀 아래로 짧게 아래쪽 튜브의 솔루션을 수집 하 여 빛 없이 얼음에. 혼합 하 고 부드럽게 회전.</li>
	<li>표식 유전자의 앞으로 뇌관의 1 µ L를 포함 하 여 실시간 정량 Pcr 반응 혼합으로 PCR 웰 스에 세포 lysate의 1 µ L를 추가 (300 nM) 및 뇌관 역 (300 nM), 0.125 µ L의 역전사 (10 U / µ L), 및 1 단계 반응 혼합 (2 배)의 5 µ L.</li>
	<li>광학 투명 필름, 그리고 부드럽게 소용돌이 우물을 밀봉 하 고 혼합 반응 구성 요소.</li>
	<li>실시간 PCR 장비에서 PCR 96 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>중 합 효소 비활성화와 95 ° c.에 1 분 동안 DNA 변성 50 ° C에서 10 분 동안 반전 녹음 방송 반응 실행</li>
	<li>PCR 반응의 40 주기 함께 RT-PCR을 수행: 15 변성 s 95 ° C, 어 닐 링/확장 및 플레이트 형광 20에 대 한 읽기에서 60 ° C, 그리고 2-5 s/단계에서 0.5 ° C 증가 통해 65-95 ° C에서 용융 곡선 분석 s.</li>
	<li>설정 upregulated downregulated, HOXA9 유전자의 표현 수준에 따라 변경 그룹이 비교 하 여 컨트롤은 별도로. Β-말라 유전자를 사용 하 여 내부 관리 유전자 제어로.</li>
</ol>8. 통합된 sgRNAs 유전형과 생어 시퀀스를 통해 긍정적인 클론의 확인
<ol><li>생어 통해 HOXA9 감소 식 클론 확인 시퀀싱 하 고 50-100 ng MOLM13 게놈 DNA, 5 µ L 중 합 효소 반응 버퍼 (10 배), 1 µ L 앞으로 뇌관 (10 µ M)으로 PCR을 수행 (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)와 1 µ L 역 뇌관 (10 µ M) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µ L dNTP (10 m m), 중 합 효소 1 단위 (5 U /µL). 30 94 ° C에서 초기 변성으로 PCR 반응을 수행 s, 그리고 다음 더 변성 20 94 ° C에서 20 위한 56 ° C에서 어 닐 링 s s, 20 68 ° C에서 확장 s (총 30 주기), 10 분 동안 68 ° C에서 최종 확장 다음 4 ° c.에서 개최</li>
	<li>추출 하 고 PCR 정화 키트 PCR 제품 (크기 285 bp)를 정화.</li>
	<li>2 µ L T4 결 찰 버퍼 (10 배), 50 ng T 벡터 DNA T 벡터에 순화 된 PCR 제품 선 (50 ng / µ L), 25 ng 정화 PCR DNA (285 bp), 1 µ L T4 리가 (3 단위 / µ L), 그리고 장소는 결 찰 16 ° C에 인큐베이터에 하룻밤 사이 혼합.</li>
	<li>결 찰 믹스 DH5α 유능한 셀으로 전송, 파운드 암 피 실린 항생제 한 접시에 성장 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
	<li>파운드 플레이트에서 단일 클론을 선택 하 고 유전형과 생어에 의해 확인 연속.</li>
</ol>9. sgRNAs Nuclease 소화 분석 결과 의해 유도 Indel 변이의 탐지
<ol><li>SgRNA 통합된 단일 클론 유도 Indel 요금 nuclease 테스트 분석 결과 의해 감지.</li>
	<li>별도로 50-100 ng Indel 돌연변이 (테스트)와 PCR 템플릿으로 야생-타입 (WT, 참조) DNA PCR amplicons 준비 5 µ L 중 합 효소 반응 버퍼 (10 배), 1 µ L dNTP (10 m m), 중 합 효소 1 단위 (5 U / µ L), 1 µ L 앞으로 뇌관 (10 µ M) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3'), 그리고 1 μ L 역 뇌관 (10 µ M) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). PCR 반응 초기 변성에 대 한 30, 98 ° C에 그리고 20 98 ° C에서 변성으로 수행한 20 56 ° C에서 어 닐 링 s s, 확장 30 s (총 30 주기), 72 ° C에서 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 4 ° c.에서 개최</li>
	<li>200 heteroduplex 혼합 그룹 설정 "참조" (20 ng / µ L) 및 200 ng ng 0.2 mL PCR 튜브에 "테스트" (20 ng / µ L) PCR amplicons만 400 homoduplex 혼합 그룹의 "참조" PCR amplicons 컨트롤의 ng.</li>
	<li>별도로 가득 물 800 mL 및 다음 anneal heteroduplex 또는 homoduplexes를 형성 하는 실내 온도를 점차적으로 진정 1 리터 비 커에 5 분 동안 95 ° C에서 heteroduplex 및 homoduplex 혼합물을 품 어.</li>
	<li>1 µ L indel 돌연변이 탐지 nuclease (2.5 U / µ L)와 2 µ L nuclease 반응 버퍼 (10 배) 60 분 동안 42 ° C에서 단련 된 heteroduplex 및 homoduplex 혼합물의 별도로 다이제스트 400 ng.</li>
	<li>Agarose 젤 전기 이동 법으로 소화 샘플을 분석, 작은 조각 (70-250 bp), 및 homoduplex DNA에 heteroduplex 혼합물 DNA를 절단 한다 (320 bp) 절단 한다.</li>
</ol>

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<li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li>
<li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+%28FLT3%29+and+Nucleophosmin+1+%28NPM1%29+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes%3A+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li>
<li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li>
<li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).</li>
<li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
</ol>

우리는이 보고서와 관련 된 충돌의 관심 있다.

단백질 코딩 유전자 관련 sgRNA 라이브러리 유전자와 sgRNA 농축24,,2526 통해 특정 세포 기능을 통제 하는 네트워크를 식별 하는 기능 심사 시스템에 적용 된 ,2728. 여러 비 코딩 영역 sgRNA 라이브러리 또한 표시 했다 유전자 특정 기능 화면 원심 및 인접 요소, BCL11A, 약물 저항, Tdgf1a 등 규제 관련 유전자28, 규제 29,30. 이러한 sgRNA 라이브러리 모두 자세한 생물 정보학에 의해 생성 된 디자인...

최근 게놈 상호 작용 연구 밝혀 인간의 핵 게놈 형태 토폴로지가 연결 도메인 (TADs) 세포 유형 및 종 보존을 안정. 별도 도메인으로 게놈의 조직 촉진 하 고 규제 요소 (예: 강화 및 발기인) 간의 상호 작용을 제한. CCCTC-바인딩 요소 (CTCF) 태 드 경계 한다 이웃 TADs1에 있는 DNA 요소의 제약 상호 작용에서 중요 한 역할을 한다. 그러나, 게놈 넓은 CTCF 바인딩 데이터 CTCF 주로 상호 작용 하는 다른 세포 유형에 동일한 DNA 사이트, 비록 자주 작동 하는지 다른 제안에 한 셀만 특정 사이트에서 chromatin 장벽으로 밝혀 그 CTCF 기능 함께 chromatin 경계2의 형성에 다른 활동. 알 수 없는 남아 여부 경계 요소 (CTCF 바인딩 사이트) 직접 CTCF의 생물학 기능에 연결 되 고 이러한 링크 발생 하는 방법 이다. 따라서, 우리는 게놈에 특정 CTCF 바인딩 사이트 직접 TADs의 형성을 조절 및 이러한 도메인 내에서 또는 이웃 도메인 간에 발기인/증강 상호 작용을 제어 가설. 인간과 마우스 게놈 시퀀싱 프로젝트 후속 epigenetic 분석 완료 게놈의 새로운 분자 및 유전 서명을 발견 했습니다. 그러나, 유전자 규칙 및 세포질 기능을, 뿐만 아니라 그들의 분자 따라 장치를 마더보드에, 특정 서명/수정 역할은 아직 완전히 이해 될.
증거의 여러 줄 CTCF 중재 TADs 기능 chromatin 도메인3,4,5대표 지원 합니다. 비록 CTCF 주로 상호 작용 하는 다른 세포 유형에 동일한 DNA 사이트, 게놈 넓은 CTCF 칩 seq 데이터 CTCF 종종 다른2에 한 셀만 chromatin 장벽 기능 공개 했다. CTCF 게놈 조직4,,67중재 하 여 개발 시 필수적인 역할을 재생 합니다. CTCF 경계의 증강/발기인 상호 작용, 유전자 발현, 발달 방해로 이어지는 손상. 이것은 CTCF TADs 중재 구조 구성 요소 뿐만 아니라 적절 한 증강 행동과 유전자 전사5,,89에 필요한 규정 단위는.
HOX 유전자는 배아 개발 하는 동안 중요 한 역할을 재생 하 고 그들은 일시적으로 그리고 공간 제한 됩니다 그들의 표현 패턴. HOXA 소재 시 두 안정 TADs CTCF 관련 경계 요소 hESCs 및 IMR90 셀1에 의해 앞쪽 및 후부 유전자를 분리 형성 한다. 최근 보고서는 HoxBlinc, HoxB 관련 된 로커 스 lncRNA 중재 CTCF 형성 시연 TADs와 HOXB 소재 시 상호 작용 증강/발기인 감독. 이것은 ESC 헌신과 차별화10중 앞쪽에 HOXB 유전자 활성화. 또한, 특정 유전자 loci HOXA 소재 시를 포함 하 여에 CTCF의 변경 태 드 도메인 변경 계보 특정 유전자 표현 프로필을 중재 하 고 질병 상태11,12의 개발과 관련 된 했다. 증거는 CTCF 유전자 전사를 조정 하 고 기능 도메인으로 게놈을 구성 하 여 셀 정체성 결정에 대 한 기본 기능을 지원 합니다.
조, 중 배아 개발에서의 역할에도 불구 하 고 HOX 유전자 조절 조 혈 줄기와 조상 세포 (HS/PC) 기능. 이것은 확산 및 감 별 법10,13,,1415사이의 균형을 제어 하 여 이루어집니다. HOX 유전자의 표현 사양과 HS에 가장 높은 표정으로 조 혈 모 세포의 분화를 통해 긴밀 하 게 규제 / pc HOX 유전자 발현의 최저 수준으로 성숙 하는 동안 점차 감소 조 혈 모 세포16차별에서 발생. HOX 유전자 dysregulation leukemic 전이17,18선도 HS/Pc의 dysregulating 자체 갱신 및 차별화 속성으로 leukemic 전이의 지배적인 메커니즘입니다. 그러나, 구축 및 유지 관리 관련된 규제 네트워크 HOX 유전자의 종양 식 패턴 대 정상의 기계 장치는 불분명 남아 있습니다.
CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리 심사 잘으로 비-코딩 유전자, lncRNA20 와 미르21 종 등으로 단백질 코딩 유전자19 가 널리 사용 되었습니다. 그러나, 새로운 게놈 목표를 식별 하는 CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리를 사용 하는 비용 때문에 높은 처리량 게놈 시퀀싱은 종종 sgRNA 라이브러리 심사 확인, 높은 남아 있습니다. 우리의 sgRNA 시스템 심사 특정 게놈 loci에 집중 하 고 HOXA9같은 마커 유전자 발현에 따라 1 단계 RT-PCR을 통해 대상 sgRNAs를 평가. 또한, 생어 시퀀싱 게놈, 및 Indel 돌연변이에 sgRNA 통합 되었다 확인 사이트를 대상으로 sgRNA를 식별 하기 위해 검색할 수 있습니다. Loci 특정 CRISPR Cas9 유전자 검사를 통해 CBS7/9 chromatin 경계 종양 chromatin 도메인을 설정 하 고 급성 골수성 백혈병의 병 인에서 소성 HOX 유전자 표현 패턴 유지를 위한 중요 한 레 귤 레이 터로 확인 되었습니다. 12. 메서드 CTCF 경계 배아 개발, 조, leukemogenesis, 뿐만 아니라 CTCF 경계에서의 특정 기능 뿐만 아니라 미래의 후 치료에 대 한 잠재적인 치료 대상으로 식별에 널리 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 3000 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 cells&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>&nbsp; </td><td></td>C737303</tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>MOLM-13</td><td>DSMZ</td><td>ACC 554</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pGEM&reg;-T Easy Vector Systems&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A137A</td><td></td></tr><tr><td>T4 리가제&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩&</td><td>nbsp; M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAuick PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SingleShot&trade; SYBR&reg; &nbsp; 그린 원스텝 키트</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725095</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN 플라스미드 맥시 키트</td><td>QIAGEN</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 수정된 독수리 미디엄&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>&nbsp; </td><td></td>11965084</tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td></td><td></td>10378016</tr><tr><td>Lenti-X 집중 장치&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)&nbsp;</td><td>제네시 사이언티픽</td><td>&nbsp; 25-507</td><td></td></tr><tr><td>TAE 버퍼&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>FERB49</td><td></td></tr><tr><td>측량사&reg; 돌연변이 검출 키트</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>706020</td><td></td></tr><tr><td>Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8126</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath/Block Heaters</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88870002</td><td></td></tr><tr><td>TSX 시리즈 초저온 냉동고</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSX40086V</td><td></td></tr><tr><td>Forma&trade; Steri-Cult&trade; CO2&nbsp; 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3308</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe&trade; KS, 클래스 II 생물 안전 캐비닛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51022484</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&trade; 전설&거래; XT/XF 원심분리기 시리즈</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004506</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; 아이소템프&트레이드; 수조</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; 로케이터&트레이드; 플러스 랙 및 박스 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-762-353</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp&trade; Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems 기술</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; 올빼미&거래; EC300XL2 컴팩트 전원 공급 장치</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7217581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; 올빼미&거래; 이지캐스트&트레이드; B1 미니 젤 전기영동 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-528-178</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; 튜브 로테이터 및 로티시리즈</td><td>VWR International</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; 인큐베이팅 미니 셰이커</td><td>VWR International</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울 MS104TS/00</td><td>메틀러 토레도</td><td>30133522</td><td></td></tr><tr><td>DS-11 FX 및 DS-11 FX+ 분광 광도계</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11 FX</td><td></td></tr></tbody></table>

hox loci focused crispr/sgrna 라이브러리 심사 식별 중요 ctcf 경계

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC-바인딩 요소 (CTCF)-안정적인 도메인 토폴로지가 연결 (TADs) TADs 이웃에 있는 DNA 요소의 제약 상호 작용에 중요 한 역할을 할 중재. CTCF 배아 발달, 신체 모방, 조, 및 leukemogenesis 제어 하는 HOX 유전자의 공간 및 시간 표현 조절에 중요 한 역할을 한다. 그러나, 그것은 크게 알 수 없는 남아 여부와 HOX loci 관련 CTCF 경계 chromatin 조직과 HOX 유전자 발현을 조절 하는 방법. 현재 프로토콜에서 HOXA/B/C/D loci에서 모든 CTCF 바인딩 사이트를 타겟팅 하는 특정 sgRNA 풀링된 라이브러리 생성 CTCF 관련 chromatin 경계 태 드 형성과 HOX 유전자에 방해의 효과 검사 하 식입니다. CRISPR-Cas9를 통해 유전자 검사, HOXA7/HOXA9 유전자 (CBS7/9) 사이 위치한 CTCF 바인딩 사이트 종양 chromatin 도메인으로 소성 HOX 유전자를 유지 하기 위한 중요 하 고 중요 한 레 귤 레이 터로 확인 되었습니다. MLL 재배열 급성 골수성 백혈병 (AML)에 식 패턴. 따라서,이 sgRNA 접근 차단 특정 유전자 loci에서 중재 CTCF 게놈 조직에 새로운 통찰력을 제공 도서관과 또한 두 코딩 주석된 유전 규제 요소 기능 특성에 대 한 기초를 제공 하 고 noncoding 포스트 인간 게놈 프로젝트 시대에 정상적인 생물학 과정.

CRISPR-Cas9 기술은 기능 게놈 연구를 위한 강력한 연구 도구입니다. 그것은 빠르게 편집 기술을 기존의 유전자를 대체 하 고 게놈 전체 및 개별 유전자 중심 애플리케이션 위한 높은 유틸리티 있다. 여기는 첫 번째 개별적으로 복제 loci 특정 CRISPR Cas9 짓고 sgRNA 라이브러리 포함 1070 sgRNAs sgRNAs 303 무작위 대상 유전자, 60 긍정적인 컨트롤, 500 인간 대상으로 컨트롤 및 207 CTCF 요소 또는 lncRNA를 대상으로 구성 된 (그림 1, 표 1) 4 HOX loci에서 유전자를 대상으로. 이 라이브러리는 모든 CTCF 코어 바인딩 모티프, HOX 유전자 관련 lncRNAs, 규제 요소, 그리고 여러 가지 HOX 유전자 HOX loci에 긍정적인 컨트롤 이라는 대상. 그것은 ...

CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

라이브러리 스크리닝이라고 불리는 당사의 풀드sgRNA는 게놈 전체의 비코딩 요소의 생물학적 기능을 식별하고 평가하는 강력한 유전적 접근법입니다. 이 기술을 통해 우리는 표적 유전자 발현에 관련된 결합 부위, 색채 경계 또는 기타 규제 요소를 방해하는 효과를 검사할 수 있습니다. 우리의 접근은 초기 배아 발달에 있는 HOX 유전자 규정에서 CTCF, 긴 비 코딩 RNA 및 증강제의 역할을, 뿐만 아니라 비정상적인 HOX 유전자 서명을 가진 특정 백혈병의 역할을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다.CTCF 바인딩 사이트를 대상으로 하는 sgRNA의 설계로 이 절차를 시작합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포 제제에서 sgRNA 라이브러리의 복제. 렌티바이러스를 포장하기 위해, cotransfect HEK293 T 세포에 20 마이크로그램의 정제 된 라이브러리 벡터, 포장 된 플라스미드의 15 마이크로 그램, 그리고 봉투 플라스미드의 10 마이크로 그램, 바이러스를 수확하기 전에 48 시간 동안.48 시간 후에, 바이러스 상체를 수집하고 0.45 미크론 저단백질 결합 PVDF 막을 통해 필터링합니다. 다음으로, 농축기사용, 렌티바이러스 상체를 50배 씩 농축한다. 농축 된 바이러스를 알리쿼트와 영하 80도 냉동고에 저장합니다.MOLM13 세포를 농축 렌티바이러스의 다양한 용량과 혼합하여 총 6개의 총 군에 대해 12개의 웰 플레이트의 별도의 우물에서 작업한다. 즉시 33섭씨에서 2시간 동안 1000배 g의 혼합물을 원심분리합니다. 12개의 웰 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4시간 동안 인큐베이터로 다시 옮길 수 있습니다.셀 팔레트를 방해하지 않고 슈퍼나탄을 부드럽게 흡인시키고, 신선한 보충 RPMI 1640 배지로 변환된 세포를 다시 중단한다. 그런 다음 다시 중단된 세포를 T25 플라스크로 옮기고 푸오마이신없이 48시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 48시간 후에 이 세포를 2개의 플라스크로 분할한 후에, 5일 동안 밀리리터 푸오마이신 당 1개의 마이크로리터로 취급된 실험군 및 5일 동안 푸오마이신 처리 없이 대조군.푸오마이신 처리 없이 세포의 수로 푸오마이신으로 처리된 살아있는 세포의 수를 분할하여 전이에 최적화된 MOI 값을 측정합니다. 풀이 된 라이브러리로 세포를 변환하려면, sgRNA 풀렌티바이러스의 0.3 MOI를 가진 6 웰 플레이트에 150만 MOLM13 세포를 감염시 배지에서 렌티바이러스를 풀로 한다. 렌즈 바이러스 감염없이 세포를 대조군으로 사용하십시오.즉시 세포를 소독하기 위해 섭씨 33도에서 2 시간 동안 1000 배 g에서 6 개의 우물 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 4시간 동안 5%의 이산화탄소로 다시 배양합니다. 셀 팔레트를 방해하지 않고 부드럽게 슈퍼내퍼나탈트를 흡인시키고, 환원된 세포를 신선한 배지로 다시 중단한다.그런 다음 세포를 T25 플라스크로 옮기고 푸오마이신없이 48 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 48 시간 후에, 5 일 동안 밀리리터 puromycin 당 1 개의 마이크로 그램으로 세포를 치료하십시오. 2 일 후에 신선한 매체를 교환하고 최적의 세포 밀도를 유지합니다.희석 방법을 제한하는 96 웰 플레이트에서 단일 클론을 시드합니다. 이 단일 클론을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 3-4 주 동안 그들을 문화.sgRNA 통합 MOLM13 세포를 0.4%의 Trypan Blue 용액 염색으로 계산한 다음 잘 10, 000 개의 라이브 셀을 96 개의 잘 PCR 플레이트로 전송합니다. 접시를 5분 동안 1000배 g로 원심분리한 다음 피펫으로 상판을 철저히 제거하고 폐기합니다. 셀 팔레트를 방해하지 마십시오.텍스트에 설명된 바와 같이 세포를 세척한 후 각 웰에 셀 리시스 마스터 믹스의 50 마이크로리터를 첨가한다. 파이펫은 셀 팔레트를 다시 일시 중단하기 위해 5번 위아래로 합니다. 상온에서 10분 동안 믹스를 배양합니다.그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 5분간 옮은 다음, 섭씨 75도를 추가로 5분간 옮김시합니다. 이제 RT qPCR 반응 믹스를 포함하는 PCR 웰에 셀 리세이트의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 이러한 혼합에는 마커 유전자가 전방 및 역프라이머, 역실사 및 1단계 반응 믹스를 포함한다.섭씨 50도에서 10분 동안 역전사 반응을 실행하고, 95도에서 1분간 DNA-데니션을 사용한다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 40사이클의 PCR 반응으로 RT PCR을 수행합니다. HOXA9감소발클론을 Sanger 시퀀싱을 통해 검증하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 MOLM13 게놈 DNA로 PCR을 수행한다.PCR 정제 키트로 PCR 제품을 추출하고 정화합니다. 정제된 PCR 제품을 T4 결찰 버퍼, T 벡터 DNA, PCR DNA 및 T4 리구아제로 T 벡터로 리게이트합니다. 하룻밤 사이에 인큐베이터에 리기션 믹스를 넣습니다.LB 암피실린 항생제 한고 판에 DH5 알파 유능한 세포 및 플레이트로 결찰 믹스를 전송합니다. 하룻밤 사이에 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다. LB 플레이트에서 단일 클론을 선택하고 지노티핑과 Sanger 시퀀싱으로 확인합니다.200 나노그램의 기준체와 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 200 나노그램의 테스트 PCR 앰플리턴을 가진 헤테로두플렉스 혼합물 군을 설정하였다. 대조군으로서 400나노그램의 레퍼런스 PCR 앰플리콘을 가진 호모듀플렉스 혼합물 군을 포함한다. 800 밀리리터의 물로 채워진 1리터 비커로 5분간 95도의 이테로듀플렉스와 호모듀플렉스 혼합물을 별도로 배양합니다.그런 다음 혼합물을 실온으로 점진적으로 냉각하여 음막으로 냉각하고 이종 또는 호모듀플렉스를 형성합니다. 지금, 별도로 소화 400 안열 이테로듀플렉스및 호모두플렉스 혼합물의 1개의 마이크로리터인 인델 돌연변이 검출 뉴클레아제, 그리고 60분 동안 42°C에서 뉴클레아제 반응 완충제의 2개의 마이크로리터. 아가로즈 젤 전기포고증으로 소화된 샘플을 분석한다.이종 혼합물 DNA는 작은 조각으로 절단되어야하며 호모 두플렉스 DNA는 절단되어서는 안됩니다. MOLM13 양성 클론을 표적으로 하는 sgRNA는 대조군 세포와의 비교를 가진 HOXA9 유전자의 발현 수준에 기초하여 RT qPCR 방법으로 확인되었다. 528개의 생존 클론 중 10개의 클론이 HOXA9 수준에서 50% 이상 감소했습니다.HOXA9에 통합된 sgRNA감소, HOXA9 변경 및 HOXA9 증가 클론, SgRNA의 PCR 증폭 및 Sanger 서열에 의한 식별에 의해 더욱 확인되었다. HOXA9 수준이 감소하는 것을 보여주는 10개의 클론 중 6개는 Sanger 시퀀싱에 의해 결정된 바와 같이 CBS79 사이트를 대상으로 sgRNAs를 포함했다. 통합 sgRNA 양성 클론의 인델 돌연변이는 PCR 계 유전화 및 뉴클레아제 소화에 의해 결정되었다.HOXA7과 HOXA9 유전자 사이에 위치한 CTCF 사이트의 이종화구균 삭제는 PCR 기반 의 유전자 인식에 의해 확인되었다. HOXA9 감소 클론 5, 6, 28 및 121 CBS79 경계 위치에서 삭제를 나타냈다. 핵소화 분석에 의해 분석된 CBS79 부위에서 인델 돌연변이에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.이 절차를 수행할 때, 핵분석 분석기를 통해 sgRNA 유도 인델 돌연변이를 검출하기 위해 동일한 양의 헤테로듀플렉스 및 호모듀플렉스를 만드는 것이 중요합니다. 우리의 접근은 선택된 마커의 활용을 가능하게 하고, 백혈증에 유전자의 효력을 발견하기 위하여 표적 유전자에 차세대 순서를 실행합니다. 전반적인 우리의 접근은 사후 게놈 프로젝트 오류에 있는 일반적인 생물학 프로세스 및 백혈신생 도중 지적한 유전 불규칙한 요소의 기능적 정확성 그리고 감소를 위한 RPC의 방지합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상은 CRISPR-Cas9을 사용하여 게놈이 변형된 형질전환 초파리 파리를 식별하는 스크리닝 방법을 설명합니다. CRISPR-Cas9은 과학자들이 유기체의 게놈을 조작하는 방식에 혁명을 일으킨 강력한 게놈 편집 도구입니다. 예제 프로토콜에서는 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법을 확인할 수 있으며, 여기서 transactivation sequence의 삽입은 branchless(bnl) 유전자의 첫 번째 엑손을 대체하여 bnl 유전자 특이적 드라이버 라인인 bnl-LexA를 생성합니다.

유전체 변형 스크리닝: 초파리에서 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

강화, 같은 DNA 규제 요소, 물리적으로 대상 유전자 발기인, 큰 게놈 거리에 걸친 장거리 염색체 상호 작용을 통해 자주 연락 하 여 유전자 발현을 제어 합니다. 발기인 캡처 안녕-C (PCHi-C) 그들의 표적 유전자를 잠재적인 규제 시퀀스의 지정을 활성화 발기인 및 원심 지역 사이 중요 한 상호 작용을 식별 합니다.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

이 프로토콜 설계 및 다중화 비활성화 융해 단백질 SID4X-dCas9-리아로 알려진 또한 증강 간섭 (증강 인자-i)와 강화의 대상으로 수행 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 유전자 발현을 조절 하는 강화의 식별을 가능 하 게 일반적인 대상 유전자 규제 강화 간의 관계의 해 부를 촉진 한다.

증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

이 원고는 세포외 수용체-리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 규모의 세포 기반 스크리닝 접근법을 기술한다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

여기서 우리는 면역 능력 마우스의 피부와 구강에 있는 몇몇 유전자의 기능을 동시에 평가하기 위하여 자궁 배아 렌즈바이러스 주사에서 초음파 유도를 사용하여 생체 내 CRISPR/Cas9 검열 방법론을 기술합니다.

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

게놈은 핵 공간에서 염색체 형성 포획 기술을 통해 드러나게 할 수 있는 다른 구조물로 조직됩니다. 핵 내 Hi-C 방법은 드로소필라 세포주에서 크로마티닌 상호작용의 게놈 전체 컬렉션을 제공하며, 이는 제한 단편 수준에서 메가베이스 해상도로 탐색할 수 있는 접촉 맵을 생성합니다.

드로소필라 세포의 인핵 하이-C

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술과 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 통합하여 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 비정상적인 증식 능력에 중요한 후보 유전자를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

우리는 원발성 CAR T 세포에 대한 최적화된 CRISPR-Cas9 녹아웃 스크리닝 프로토콜을 개발했습니다. 효소 소화와 sgRNA 카세트 풀다운을 통한 gDNA 운반을 줄임으로써 PCR 인공물을 최소화하고 정확한 sgRNA 검출과 기능성 유전자 표적의 견고한 식별을 보장합니다.

CAR T 세포에서 CRISPR-Cas9 스크리닝 개선: 라이브러리 준비를 위한 정교한 방법

배우세요 HOX 유전자 좌위 특이적 sgRNA 라이브러리를 활용한 CTCF 경계 식별 방법입니다. 이 기술은 조기 배아 발달 및 백혈병 연구에서 비암호화 요소의 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

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