Name: 예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 배우세요 혈액-뇌종양 장벽의 in vitro 모델을 만드는 방법을 쥐와 인간 세포를 사용하여. 이 방법은 중추신경계 종양을 표적으로 하는 약물 전달 예측 가능성을 높여줍니다.

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이 연구는 핀란드 암 조직, 제인 & Aatos Erkko 재단, 그리고 Sigrid Juselius 재단 (P.L.와 V.L.J.), 스위스 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (고급 Postdoc.Mobility 부여 no: P300PB_164732 s. K.), 오리온 연구 재단 (S.K.)에, Maud Kuistila 기념 재단 (S.K.), 그리고 핀란드의 아카데미 (TERVA 2017, 부여 no: 314 498). Biomedicum 이미징 장치 (헬싱키)는 현미경 이미징 핵심 시설을 제공 하는 인정 했다.

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저자는 공개 없다.

Interpatient 종양 다양성 개념의 맞춤된 암 의학21에 대 한 연구를 젊 어지게. 이 다양성은 또한 중앙 신경 신생의 특징 이다. 종양의 예측 때문 화학 요법에 대 한 응답 약물 전달에 대 한 BBB의 sheltering 효과를 추가 하 고 환자 치료22주요 과제를 구성 하는 모두. 더 효과적인 치료법을 개발 하기 위하여 그것이 종종 새로운 분자의 화면 큰 라이브러리에 필요 합니다. Antitumor 효능과 종양 사이트에 도달 하는 새로운 치료 단서의 능력을 평가 하기 위해 최고의 옵션 murine 환자 아바타에 생체 내에 이식 환자 파생 셀에 전 임상 연구 이다. 실제 (재정, 시간, 인적, 시설 자원) 및 윤리적인 이유로 (3Rs 원리 실험실 동물을 사용 하는 경우), 같은 대규모 vivo에서 심사 플랫폼의 개발은 종종 가능, 그리고 그러므로, 세포 기반 분석 선택23의 모델을 남아 있다. 선택에 대 한 주요한 이유 세포 라인을 설립 하 고 재현성 하며 절연 및 기본 murine 문화의 설립에 대 한 주요 소스는 실험실 동물의 사용 하는 1 차 셀을 피하. 여기, 제시 하는 방법을 효율적으로 폐기 수 확고 하 게 준수 하는 3Rs nanoparticles는 추가 임상 조사는 쿠리에 모델 BBTB 교차 하는 그들의 무 능력의에서. 원칙으로 서 증거-의-, 여기 개발 및 유효성 검사는 BBTB의 기간 동안 얻은 결과 설명 합니다. 우리는 예를 들어 때 측정 376 다 나트륨 fluorescein의 수동 확산 vivo에서 생체 외에서 연구 결과 확인 수 있었다.
이 문서에서 설명 하는 프로토콜 이다와 cocultured 내 피 세포의 준비를 생체 외에서 설치에서 혈액 종양 장벽 같은 인터페이스를 설명 합니다. 이러한 두 셀 형식 간의 신체 접촉 설립 되 면, 내 피 세포 층 BBB (예를 들어, 한 셀 표면 식 꽉 접합 단백질의 상대적으로 낮은 침투성)와 유사성을 전시 한다. 흥미롭게도, murine BBTB 모방 vivo에서 마우스로 BBB 침투성 측정24얻은 그 특히 비슷한 나 플로리다 침투성 값을 제공 하는 것 같았다. 따라서, BBTB 모방의 성능 장벽을 형성 하는 데 사용 하는 셀의 선택에 직접 연결 될 것입니다. BEND3 내 피 세포 두뇌에서 발생 하 고 이다25cocultured 때 장벽을 형성에 성공한 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 우리는 사용 하 고 불멸 하 게 HIFko 이다26 BBTB 모방 생성 하. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인의 그들의 부족 때문이 이다 생산 하지 않습니다 VEGF A는 여기에서 설명 하는 BBTB 모방의 안정화에 전형적인. 이다는 VEGF-A neuroinflammation27에 대 한 응답의 출시를 통해 예를 들어 BBB 침투성의 변조기로 확인 되었습니다. 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 (VEGFRs)의 활성화는 내 피/혈관 침투성 모두 체 외28 에 vivo에서29의 키 레 귤 레이 터입니다. 따라서, 매체에 VEGF A 보충 VE cadherin30등 외화 접합 단백질의 인 산화를 유도 한다 내 피 세포에 VEGFR2를 활성화 합니다. 내 피 세포-세포 접촉의 손실 높은 침투성 혈관 생성합니다. 마찬가지로, 강한 mitogenic 속성 및 셀 문화 분석에 사용 되는 태아 소 세라의 알 수 없는 구성 장벽 및 분석 결과 재현성에 주요 문제를 일으킬.
인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 가끔 체 외31; BBB를 형성 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 그들은 크게 다 뇌 microvascular 내 피 세포에서 hCMEC/D3 셀 라인32, 유전자 발현 및 방 벽을 형성 하는 같은 속성. 그러나, 혼자 성장 하는 HuAR2T 세포로 가져온 값은 bEND3에 비해 상대적으로 높은 침투성 인간의 기본 이다와 coculturing에 의해 크게 감소 했다. 비록 내 피 세포는 세포 벽을 형성 하는 데 필요한, 그것은 분명는 이다 BBTB 형성 및 안정화를 동등 하 게 중요 한 역할을 했습니다.
때 환자 파생 glioma 분야는이 방정식에 추가 된, 마우스 BBTB 모방 murine xenografts 뇌 맥 관 구조와 종양 세포 타겟팅을 통해 마약 확산 등의 기능 중 일부 지. 여기 BBTB 모방 했다 예를 들어, 우리는 다른 직경을 가진 여러 나노 상영 때 vivo에서 동작을 미러링에 성공. 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델 간의 병렬 처리를 설명 하기 위해 우리 세포 관통 속성34 에 종양을 대상으로 펩 티 드 쿠퍼에 활용 된 앞에서 설명한 mesoporous 규 산 염 나노 입자33 사용 그들의 surface20입니다. 닭장을 대상으로 펩 티 드 주택 유 방 파생 된 성장 억제 물 (MDGI)에 특정 바인딩을 통해 침입 종양 세포. Gliomas를 포함 하 여 여러 암 MDGI 정상 조직의35, 쿠퍼는 매우 효율적인 종양을 대상으로 moiety 페이로드20의 납품을 증가 수 게에 비해 overexpressing는. 여기에 사용 되는 나노 입자 (27547955), 뇌 실질에 확산 이전 표시 되었습니다 그리고 때 Taxol과 기능성, 이러한 나노 화물 전 임상 모델36에 glioma 성장 감소에 성공 했습니다. 나노 입자의 표면에 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 잔류물의 추가 또한 그들의 정전기 양수 값을 유지 (주위 4 + mV), 혈관 단위37 와 함께 더 나은 상호 작용을 허용 하 고 또한 그들의 안정성을 증가 순환. 표시 데이터에서 말뚝의 3 kDa NP350s 말뚝의 10 kDa 코팅 했다 하는 동안 NP110s에 활용 했다. 그러나, 증가-분자-무게 못 또한 결과 나노 직경, 따라서 상당한 증가에 BBB를 그들의 실제 기능. 따라서, 우리는 입자의 실제 크기는 BBTB 통해 그들의 통행을 방해 하는 여부 및 여부 이러한 관측 수 미러링할 vivo에서 확인 합니다.
이전 게시 된 관측에 따라 생체 외에서 BBTB와 NP350s BBTB 모방의 luminal 사이드의 혈관에서에 유지 하면서 intracranial 종양 방위 쥐의 BBB를 통해 NP110s extravasated는 관찰 된 쥐입니다. 이러한 비슷한 결과 좋습니다 BBTB 모델 BBB를 교차 하 고 두뇌에 도달 하는 나노 입자의 생체 조건 능력을 예측 했다.
BBB의 휴대 전화 모델의 관련성은 나노38의 중앙 배달에도 자주 토론 됩니다. 우리가 보여 여기는 기본 이다 그리고 내 피 세포, 둘 다 가장 관련 된 생체 외에서 도구로 간주 대체 될 수 있다 불멸 하 게 또는 상업적으로 사용할 수 있는 셀, 더 큰 확장성과 재현성을 확보. 생체 외에서 BBB 모방의 다음 세대는 구조적으로 유사한 실제 BBB12,14아름 답게 형성된 neurovascular 단위를 수 있도록 미세 장치를 통합 하 여 개발 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 모델은 현재 gliomas 배달14의 속 행에 기술적인 제한 때문에 배달 하는 분자의 높은 처리량 검열에 적합 합니다. 그것은 실제로 접시에 BBB의 생리 적인 복잡성을 포착 하기 어려운 그리고 일부 수용 체/단백질, BBB에 의해 표현 될 알려진의 가능한 부족 결과의 해석을 손상 시킬 수 있습니다. 또 다른 인자 유전자 발현 특히 내 피 세포를 고려 하 고, 다른 한 셀 라인에서 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 조건 사이에서 큰 변화를 염려 한다. 그러나, 그것은 수 또한 될 주장 neurovascular 단위 두뇌39내 균일 한 엔터티 아니다. 생물학에서 과학 연구에 도달 했습니다 인간적 시대 어디 동물 복지, 윤리적 책임, 그리고 동물 생활을 사용 하 여 비용 항상 실험을 설계 하기 전에 간주 됩니다. 따라서, 동물의 교체를 지원 하기 위해 최근 연구의 증가 수 보여줍니다 모델의 한계와 장벽을 설치 하기 세포 모델의 신중한 선택의 인식-는 이다에 대 한 강조와 함께-영장을 경기 결과 접시에 고 동물 모델40있습니다. 여기에 설명 된 방법으로 우리는 한 걸음 더 가까이 상영 BBB transcytosis 잠재적인 치료에 대 한의 목적을 위해 사용 하는 실험 동물의 수를 감소 얻을.

혈관 단위는 뉴런, 이다, 그리고 pericytes, 이다, 내 피 세포, 두뇌 microvasculature1형성 관련된 지하실 막 간의 복잡 한 연결에 의해 형성 된 BBB의 구성입니다. 연속, nonfenestrated 배에 의해 가늘게 형성이 꽉 세포 벽 세포1순환의 뿐만 아니라 이온 및 분자 (를 포함 하 여 호르몬, 영양분, 또는 약물)의 움직임을 통제 한다. 치료 항 체, 약물 어원이 같은 말, 또는 nanocompounds와 같은 높은 분자 무게 분자의 BBB 통해 특히 낮은 transcytosis 극적으로 제한 하는 등 악성 신경 질환에 대 한 신약에서 발전 gliomas2. 실제로, 구두로 또는 정 맥으로 전달된 chemotherapies antitumor 효과 유도 하기 위해 부적당 하 게 낮은 농도에서 종종 뇌 실질에 도달 또는 단순히 종양 약 셀3에 도달 BBTB 교차 수 있습니다. 여러 전 임상 및 임상 연구 BBTB 침투의 문제 처리 하지는 하지만 집중된 초음파4,5을 사용 하 여 예는 BBTB 정도, 방해 하거나 현장에서 직접에 의해 그것을 우회 시도 약6의 납품입니다. 그러나, 이러한 기술의 아무도 피할 수 없는 종양 확장을 중화 또는 재발을 수 있었다. 따라서, 소설 antiglioma 치료를 개발할 때 치료제7의 성공적인 전달에 대 한 중요 한 측면 중 하나는 BBTB 통해 유포를 고려 한다.
BBTB 내 세포 상호 작용의 매우 복잡 한 특성상, vivo에서 연구 실험실 동물에 뇌에 혈액에서 분자의 통로 공부를 할 때 분명 한 선택이 될 것 같다. 그러나, 대규모 vivo에서 메서드는 상대적으로 복잡 한 설정 하 고, 따라서 허용 하지 않습니다 적절 한 시간에 분자의 높은 처리량 검열 합리적인 비용. 심지어 더 중요 한 것은, 동물 실험 i) 구체화로 정의 3R 윤리 지침에 따라, ii), 그리고, 현재 컨텍스트에 관련성, iii) 대체 대체 프로토콜 (예: 체 외/철 방법) 있다. 따라서, 생체 외에서 BBTB를 재현 한 흥미롭고 매력적인 가능성으로 나타나지만 그것은 또한 다양 한 한계에 의해 도전 하는 복잡 한 작업을 구성. 많은 교양된 1 차 셀 또는 셀 라인 개, 돼지, murine, 그리고 심지어 인간의 기원 (로 라만 외.8 과 헬 름 외.9의 검토) 게시 된에서이 복잡 한 구획을 다시 하려고 합니다. 이러한 모델을 3 차원 미세 시스템10, BBB-칩11,12, 포함 고 변종에 클래식 공동 문화에 따라 수많은 시스템을 삽입 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 현재 미세 칩 시스템 중 하지는 급속 한, 높은 처리량의 약물 유효성 검사 연구13,14 또는 현재 연구와 호환 되지 않는 뇌 종양 약물 전달의 적합. 또한, 일차 전지, 유도할 수 있는 만능 줄기 세포 (iPSC), 또는 상업 셀 라인을 사용 하 여 155 게시 된 모델의 검토 모든 공동 경작된에 삽입 그들의 측정 및 결론8interstudy 불일치에 대 한 추세를 보였다. 연구실 재현성이 부족 수와 상관 될 i) 정규화 되지 않은 문화 조건, 예를 들어 셀 문화 선박, subculture 및 사용의 증가 수 ii)는 지하실 멤브레인 매트릭스 단백질 선택 코팅 포함 하는 혈 청의 미디어, 셀 라인15또는 iii의 유전 그리고 phenotypic 수정의 주요 드라이버 모두) reproducibly astroglial와 접시에 내 피 구성 요소 간의 올바른 균형을 재현 하는 데 어려움. 우리 불멸 하 게 셀 또는 상업적인 셀을 사용 하 여 생체 외에서 BBB 모델 부족만 1 차 셀을 사용 하는 비슷한 모델에 비해 속성의 일부 설정 라인, 비록 설명 방법에서의 적절 한 조합을 전시 세포 표시는 매우 유사한 성능을 참조16,17의 다른 모델에 연구 출판. 결국, 연구 대상으로 BBTB 통해 뇌종양 치료 화합물의 통과를 강력 하 고 재현할 수 모델의 부족 여기에 설명 된 방법을 개발 하는 우리 동기.
목표는 전 임상 동물 모델에서 나노 입자의 생체 조건 납품을 예측 하는 모델을 사용 했다, 이후 우리가 먼저 murine 이다 접촉 murine 내 피 세포를 포함 하는 삽입을 이용 하 여 BBTB 모델 검증. 이것 이외에, 우리는 또한 특정 인간의 세포 라인을 사용 하도록 모델 최적화. 안정, 일단 세포 장벽은 세포종 환자에서 파생 된 분야 또는 상업적인 glioma 셀 라인 문화에 전송 됩니다. 그 후, 나노 입자 및 종양 세포를 대상으로 transcytosis confocal 현미경 검사 법에 의해 시각 하 고 시간 동안 샘플을 수집 하 여 정량 될 수 있습니다. 중요 한 것은, BBTB 모방을 사용 하 여 얻은 결과 안정적으로 예측할 수 vivo에서, BBTB 모방 전에의 사용을 지 원하는 나노 입자의 동작 전 임상 유효성 검사.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bEND3</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>배양: 10% FBS, 5mL L-글루타민 및 5mL 페니실린/스트렙토마이신</td></tr> HIFko 불멸의 마우스 성상세포가 보충된 DMEM(1g/L 포도당) <tr><td></td><td>Dr. Gabriele Bergers 연구실에서 분리</td><td>https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td><td>배양 위치: 5% FBS, 5mL 1M HEPES, 5mL 100mM 피루브산 나트륨, D-글루코스 3g 및 5mL 페니실린/스트렙토마이신 HuAR2T가 보충된 BME-1</td></tr><tr><td></td><td>https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 Dr. Dagmar Wirth 실험실에서 분리</td><td>배</td><td>양: EBM-2와 SupplementMix</td></tr><tr><td>정상 인간 1차 성상세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td>배양: ABM과 SingleQuots</td></tr><tr><td>Material 및 reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm x17 mm 접시, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학 피펫</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170361</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>ABM 기초 매체, 500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>원발성 인간 성상세포용. ABM+: 보충제 믹스의 모든 첨가제를 함유하고 있습니다. ABM-:rhEGF 및 FBS</td></tr><tr><td>Accutase 세포 분리 용액</td>을 제외한 모든 첨가제 <td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td></td></tr><tr><td>AGM SingleQuots 보충제 및 성장 인자</td><td>Lonza</td><td>CC-4123</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>GBM + 및 - 매체</td></tr> 기<tr><td>저 매체 Eagle</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21010046</td><td>BME-1</td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3506</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 폴리에스터 막 세포 배양 삽입물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td>은 배지 Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham Gibco 21331-020 배지에 <td>추가하기 전에 50mL의 BME-1 및 멸균 필터에 용해</td></tr>됩니다. 우리 <tr><td></td><td></td><td></td><td>실험실에서 분리된 환자 유래 구체의 배양에 따라 특이적으로 다른 신경교종 세포주에 따라 다를 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>EBM-2 성장 Medium SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>c-39216</td><td>EBM+: 보충제 믹스의 모든 첨가제를 포함합니다. EBM-:VEGF-A 및 FBS</td></tr><tr><td>EBM-2(Endothelial Basal Medium 2)</td>를 제외한 모든 첨가제<td>PromoCell</td><td>c-22211</td><td>EBM+: 보충제 믹스의 모든 첨가제를 포함합니다. EBM-:VEGF-A 및 FBS</td></tr><tr><td>소태아 혈청(FBS)을 제외한 모든 첨가제, 적격, 열 불활성화, EU 승인, 남미 원산지</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Greiner 655090</td><td>블랙 폴리스티렌 웰 평평한 바닥(마이크로 투명 바닥 포함)</td></tr><tr><td>멘젤-Gl &auml; SER 0.9 cm 라운드 보로실리케이트 커버 슬립</td><td>Thermo Scientific</td><td>10313573</td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>dH2O 1리터당 한 정, 그런 다음</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td>을 고압멸균하여 용액을 살균하십시오.<td></td></tr><tr><td>GBM+ 매체에 대한</td> <td>재조합 인간 EGF</td><td>Peprotech</td><td>GMP100-15</td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-basic(154 a.a.)</td><td>GBM+용</td> <td>Peprotech</td><td>100-18B</td></tr><tr><td><강>면역형광</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>24mm x 60mm 현미경 슬라이드 커버 유리</td><td>ORSAtec</td><td>0224601-D</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 및 594 2차 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>희석: 1/500</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5 항체</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>희석: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-GFAP 항체 클론 GF5</td><td>Abcam</td><td>ab10062</td><td>희석: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31&nbsp; 항체 클론 MEC 13.3</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>희석 1/800</td></tr><tr><td>Anti-SV40 T-항원 항체</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>희석: 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Zonula Occludens-1</td><td>Abcam</td><td>ab96587</td><td>희석: 1/200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>TOCRIS</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>플루오로마운트 수성 장착 매체&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Animal procedures</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 곡선 해부 가위</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 25 G 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게 (12.5 cm)</td><td>조직 해리를 위한</td> <td>World Precision Instruments</td><td>503283</td></tr><tr><td>Intramedic 폴리에틸렌 튜빙 PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol vet 50 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Mains Powered microdrill</td><td>World Precision Instruments</td><td>503599</td><td></td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml; SER 0.5cm 원형 붕규산염 커버 슬립</td><td>Thermo Scientific</td><td>11888372</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bulldog 클램프</td><td>World Precision Instruments</td><td>14119</td><td></td></tr><tr><td>생리식염수 Mustela</td><td></td><td>멸균 1회 용량 바이알 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - 의료 기기 등급</td><td></td></tr><tr><td>Rochester-Oschner 집게</td><td>World Precision Instruments</td><td></td> 501709 <td></td></tr><tr><td>Rompun vet 20 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr148999</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>스테레오택시 어댑터</td><td>세계 정밀 기기</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Sugi 스폰지 포인트</td><td>Kettenbach</td><td>31603</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 형광 스테레오 줌 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega 마이크로플레이트 리더</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 디지털 sCMOS 카메라</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universal 320 테이블탑 원심분리기&nbsp;</td><td>Hettich</td><td>고양이. No. 1401</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 880 with Airyscan 컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

예측의 vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

매우 자연에 의해 선택, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 생리 적인 조건에서 두뇌 항상성 필수적입니다. 그러나, 뇌 종양의 맥락에서 BBB의 분자 선택도 또한 보호 종양 약 셀 주변 관리 chemotherapies의 납품을 차단 하 여 한다. 이상적으로 악성 뇌 종양을 대상으로 하는 소설 약물 (포함 나노 입자)의 개발 의약품의 transcytosis antitumor 효능을 공부 하 고 전 임상 동물 모델의 사용을 해야 합니다. 3R 원칙에 따르기 위해 (수정, 그리고 대체) 우리 재현 생체 외에서 인간을 개발 하는 실험 설정에서 실험 동물의 수를 줄이기 위해 antitumor 에이전트의 큰 도서관의 높은 처리량 검열을 수행 하 고 혈액-뇌 종양 방 벽 (BBTB)의 murine 모방 내 피 세포, 이다, 및 세포종 환자-파생 분야의 문화 3 층을 사용 하 여. 높은 확장성 및 재현성, 상업 세포 선 또는 불멸 하 게 셀 사용 되었습니다 맞춤형된 조건에서 실제 BBB를 닮은 방 벽의 대형을 허용 하도록. 여기는 삽입에 특정 세포 조밀도에서 이다 접촉 내 피 세포를 배양 하 여 BBTB 모방을 프로토콜에 설명 합니다. 이 BBTB 모방 사용할 수 있습니다, 예를 들어, 정량화 및 동일한 분석 결과 내에서 타겟팅 하는 종양 세포의 평가 뿐만 아니라, 내 피 및 astrocytic 장벽을 통해 나노 통로의 confocal 영상. 또한, 우리는 전 임상 동물 모델에서 나노 입자의 행동을 예측 하는 얻은 데이터를 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 광범위 한 관점에서이 체 외 모델 BBB 통해 새로운 치료 분자의 통과의 결정에 대 한 다른 신경 퇴행 성 질환에 적응 될 수 및 직접의 효능을 평가 하기 위해 뇌 organoids로 보충 마약입니다.

Murine BBTB 모방의 confocal 영상 bEND3 표현과 꽉 접합 단백질 zonula occludens-1 (조로-1) claudin-5의 셀룰러 지역화를 보여 줍니다. 연락처 내 피 세포 사이의 이다 명확 하 게 ZO-1 claudin-5 bEND3 monocultures (그림 1D)에 비해 내 피 세포-세포 연락처의 이전을 유도 한다. 면역 형광 막의 뇌 쪽에 GFAP 표현 이다 시각화에 얼룩을 사용 하 여, 그것은 관찰 하 고 연구 astrocytic 프로세스 및 끝 발 내 피 세포 막 (그림 1E를 통해 연락 가능 ). 사이토 내 피 세포 연락처 홍보 하 고 세포 벽의 강화 안정 하며 BBB19의 낮은 침투성 가치와 관련 됩니다. 우리 없음-플로리다 monocultures의 경우 10-6 cm/s x 27.63 (± 3.45)에서 10-6 cm/s x 6.74 (± 3.01)에 대 한 마우스 BBTB 모방의 침투성에 상당한 감소를 관찰 하는, 그에 따라 때와 hypoxia-유도할 수 있는 공동 경작 요소 (HIFko) 이다 (표 1) 밖으로 노크. 불멸 하 게 HuAR2T 높게 침투성 세포 장벽 (104.92 ± 27.1 x 10-6 c m/s, 표 1)을 형성 한다. Murine 모델와 마찬가지로, 우리가 측정 BBTB x 10-6 c m/s, 즉 47.4 (± 14.32) 나 플로리다의 상당히 낮은 침투성 HuAR2T 세포 인간의 기본 이다 (표 1)와 함께 공동 경작 했다.
모두 인간과 murine BBTB 모방에 세포종 환자-파생 분야의 존재 침투성 값 혼자 내 피 세포-사이토 공동 문화에 비해 (표 1)에 약간의 증가 유도 한다. 이 현상은 여러 관찰 하지만 환자 glioma의 모든 모델을 범위. 이것은 일부 환자에서 파생 된 세포에 의해 은닉 되는 VEGF A 원인일 수 있습니다.
Vivo에서 BBB와 생체 외에서 BBTB 모방의 침투성 값 비교, 우리 누드 마우스에 이식 두개골 창을 통해 나 플로리다의 실시간 확산 몇 군데. 형광 stereomicroscope를 사용 하 여, 주요 pial 혈관에서 파생 혈관 모세 혈관에서 나 플로리다 확산 하기 전에, 하는 동안, 그리고 프로브 (그림 2C)의 조직의 주입 후를 기록 했다. 시간이 지남에 순환 혈액과 뇌 피 질 실질에서 차동 형광 값의 측정'누드 마우스의 대략적인 침투성 값을 계산할 수 있었습니다 s BBB 나 Fl (5.57 ± 2.19 x 10-6 c m/s, 에 대 한 표 1).
뇌 쪽으로 혈액 쪽에서 화합물의 통로의 시각화를 위한이 BBTB 모방을 사용 하는 방법을 설명 하기 위해 우리는 ø 110 nm (NP110)와 ø 350 nm (NP350) 나노 대상 세포종 환자-파생 분야의 transcytosis 비교. 결과 얻은 생체 외에서 다음 vivo에서 transcytosis에 비교 했다. 제시 등에서 나노 쿠퍼20 종양을 대상으로 펩타이드와 표면 코팅 되었고 (FITC) 시각화를 촉진 하기 위하여 형광 염료와 로드. 우리는 lysosomal 염료를 사용 하 여 셀을 표시 하 고는 BBTB의 혈액 쪽에 FITC 나노 입자의 추가 모방 다른 수준 (예: 혈액 쪽, 막, 두뇌 쪽에 confocal 현미경 인수 후 DAPI 24 h counterstained 그리고 환자 세포종 분야) (그림 3A). NP110 관련 형광 신호 이다, 내 피 세포, 종양 세포의 리소좀과 colocalized. 또한, NP110s은 검색된 사이 내 피 세포 및 삽입 (그림 3A)의 막 숨 구멍을 통해 전달 하는 이다.
NP110s의 통로 혈액과 뇌 쪽에서 수집 된 샘플에서 형광을 측정 하 여 정량 했다. 그의 나노 입자에 대 한 결정이 침투성 값 비교 되었다 ø 350 nm (NP350). 결과 표시만 NP110 (그림 3B) BBTB 모방을 교차 수 있었습니다. NP350는 이러한 나노 입자에 대 한 낮은 침투성 값 결과 BBTB 모방의 혈액 쪽에 남아 있었다.
Vivo에서 모델에 비해 BBTB 모방의 관련성을 강조 하기 위해 누드 마우스 정 맥 NP110 또는 NP350 나노 입자는 종양을 대상으로 펩 티 드 쿠퍼와 코팅 및 검출을 위한 빨간색 형광 염료 (TRITC)와 활용으로 주입 했다. 조직 여러 시간 지점에서 수집 된 후 8 h, BBB 투과 나노가 뇌 실질의 순환에 머물 렀 고 즉 vivo에서 조직의 순환에서 주로 맑게 되었다 nonpermeable 동안에 extravasated는 밝혔다. 따라서, 우리 두뇌를 수집 하 고 정연 한 밀리미터 8 h postinjection 당 나노 입자의 수를 측정할. 생체 외에서 연구 결과, NP110, 하지만 하지 NP350에 따라 뇌 실질 (그림 3C)으로 extravasated 성공적으로. 뇌에 나노 위치의 고배율 이미징 NP110 혈액 모세 혈관 밖 뇌 실질에 균질 분산 되었고 성공적으로 이식된 세포종 세포 (그림 3D)에 홈을 보여주었다. Moiety (쿠퍼)를 대상으로 같은 종양, 전시에 불구 하 고 NP350 뇌 실질에 extravasate 하지 못했습니다 하 고 뇌 혈관의 (그림 3E), 생체 외에서. 을 얻은 결과 유사 luminal 측면 이내 감지만
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> 그림 1: 혈액 뇌종양 장벽 (BBTB) 모델의 설명. (A) 종류의 다른 세포 위치의 도식 적인 표현입니다. (B) 그림 6 잘 플레이트 커버에 삽입'의 뇌에 이다에 대 한 시드 기술 삽입 배치의 s 막. 사이토 접착 수 있도록 6 잘 플레이트 배치의 (C) 그림. (D) 꽉 접합 단백질 zonula occludens-1 (조-1, 위 행, 레드)와 claudin-5 (낮은 행, 녹색)의 면역 형광 현미경. 단백질 표정 murine 뇌 microvascular 내 피 세포 (bEND3) 단 (왼쪽된 열) 또는 murine 불멸 하 게 HIFko 이다 (오른쪽 열)와 함께 혼자 BBTB의 혈액에 경작과 비교 됩니다. 세포 핵 DAPI (파란색)와 counterstained는. (E) HIFko 이다은 BBTB의 뇌 쪽에 교양 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP, 레드)를 보여주는 면역 형광 현미경 사진. 끝-피트 (화살표) 내 피 세포는 세포 막을 통해 연락 숨 구멍 (오른쪽 패널) 및 고배율 이미지는 사이토 프로세스를 보여 줍니다. HIFko 이다의 id 유인원 바이러스 40 큰 T 항 원 (SV40 큰 T, 녹색) 셀의 immortalization 사용의 면역 형광 염색에 의해 확인 되었다. 내 피 세포에 GFAP도 SV40 큰 T 익스프레스 그리고, 따라서 관찰 될 수 있다 부분적으로 반대 측 DAPI 전용 스테인드 셀 (점선)으로 막의 투명 한 통해. 세포 핵 DAPI (파란색)와 counterstained는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> 그림 2: 마우스 BBB 침투성의 intravital 라이브 결정. 삽입형 꼬리 정 맥 카 테 터의 (A) 준비 합니다. (1) 도구와 장비는 다음: (a)는 PE20 폴 리 에틸렌 튜브 (b) 2 개의 25 G 바늘 (c) 로체스터 Ochsner 집게, 및 (d) 작은 불독 클램프. (2) A 25 G 바늘 여러 torsions에 의해 제거 되는 튜브에 삽입 집게 및 (3) 신중 하 게 사용 하 여. (4) 튜브의 다른 쪽은 또 다른 25 G 바늘에 연결 된다. (B) 마우스의 꼬리 정 맥을 통해 나트륨 fluorescein 솔루션에 카 테 테 르 주입 및 위치에 대 한 지도. 동그라미 지역 cyanoacrylate 접착제 한 방울 테를 확보 하기 위해 위치 하는 영역을 나타냅니다. 불독 클램프 카 테 터를 처리 하는 데 사용 하 고 일단 테 장악을 제거. (C) 대표 이미징 및 정량화 메서드를 나트륨 fluorescein 침투성 값을 결정 합니다. 나트륨 fluorescein 주입 (왼쪽된 열), 이전 autofluorescence/텅 빈 뇌 (상단 패널, 흰색 사각형)와 혈관 영역 (하단 패널, 빨간 사각형)에 관심 (ROI)의 영역 내에서 측정 됩니다. 나트륨-fluorescein 주입 (오른쪽 열) 동안 형광 강도 BBB 침투성의 계산을 허용 두 ROIs 측정 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> 그림 3: 예측의 vivo 생체 외에서 BBTB 모델을 사용 하 여에서 BBB 통해 나노 입자의 intracerebral transcytosis. (A) 대표 confocal 이미지 murine BBTB 모델의 지정 된 서로 다른 수준에서 얻은 BBTB 분석 결과의 그래픽 표현입니다. 110의 나노 nm 직경 (NP110) FITC (녹색)를 활용 하 고 추가 된 혈액에 BBTB 세포의 lysosomal 프로브 (LT-99, 빨간색)으로 표시 했다.  (1) Endothelial 세포 막 (흰색 점선), (3) 이다의 숨 구멍을 통해 나노 입자의 (2) Endothelial transcytosis 및 (4) 환자 세포종 분야는 그래픽에 식별 되 고 해당 confocal 현미경 사진 (오른쪽)입니다. 나노 입자 (화살표)의 lysosomal 캡슐화는 BBTB의 내 피와 사이토 레이어를 통해 활성 transcytosis를 나왔다. (B) 생체 외에서 BBTB 통해 표시 된 나노 침투성의 정량화 (n = 6). 뇌 조직에서 지정 된 나노 입자 밀도의 부 량 (C) 섹션, 누드 쥐의 꼬리 정 맥 주입 후 8 h (n = 3). (D) Confocal 현미경 murine 뇌 조직 단면도에 110 nm 나노 입자 (NP110, 빨간색)는 ø의 분포를 보여 주는 안티 마우스 CD31 항 체 (녹색)으로 표시. 화살표는 나노 transcytosis (왼쪽된 패널)를 강조 표시합니다. 나노 입자 축적 때문에 닭장을 대상으로 펩 티 드 그들의 표면에 뇌 종양 세포 (종양, 오른쪽 패널) 주변. 아니 중요 한 유도 뇌 조직 (뇌)에서 관찰 됩니다. (E) Confocal 현미경 표시는 ø의 분포 350 nm 나노 (NP350, 빨간색) murine 뇌 조직 단면도 반대로 마우스 CD31 항 체 (녹색)으로 표시. 화살촉을 혈관 루멘에 유지 했다 NP110s. 세포 핵에 비해 그들의 큰 직경 때문에 아마 BBB를 교차 하지 못했습니다 NP350s 포인트는 DAPI (파란색)와 counterstained. P &lt; 0.01. P-값 양측 비패라메트릭 맨-휘트니 U 테스트를 사용 하 여 계산 했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>murine BBTB 모방</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko로</td>
			<td>bEND3 + 기가바이트</td>
			<td>bEND3 + HIFko로 + 기가바이트</td>
			<td>Vivo에서</td>
		</tr>
<tr>
<td>침투성 (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>6.74</td>
			<td>26.8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>인간 BBTB 모방</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + 기가바이트</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>침투성 (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 체 외에서 결정 (초당 센티미터)에서 나트륨-fluorescein (Na-플로리다) 침투성의 값 표시 된 공동 문화 시스템에서 그리고 vivo에서 NMRI 누드 마우스에. 대표적인 실험에서 데이터 (n = 3 쥐).

마약 중추 신 경계 종양을 대상으로 하는 것은 주요 도전 이다. 여기는 murine 및 인간의 세포를 사용 하 여 혈액 뇌종양 장벽의 생체 모방을 생산 하 고 중추 신 경계 종양 vivo에서 대상의 예측 가능성에 대 한 그들의 관련성을 토론 하는 프로토콜에 설명 합니다.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

중추 신경계에서 종양을 표적으로 하는 새로운 약물과 화합물을 개발하기 위해, 혈액-뇌 장벽을 통과하는 접근성과 통로는 매우 중요합니다. 화합물의 세포 독성치료 분자와 세포를 배양 하 여 쉽게 측정될 수 있지만, 그것은 정말 뇌의 종양 사이트에 실제 전달에 대 한 아무것도 말하지 않습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 접시에 체외에서 혈액 뇌 종양 장벽을 재현하는 방법을 설명하는 다음과 같은 프로토콜을 개발했다.뮤린 또는 인간 기원의 불멸한 세포의 사용은 이 분석이 아주 유연하게 만듭니다. 또한 재현성이 높은 수십 개의 화합물을 쉽게 선별할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 전임상 모델을 진행하기 전에 화합물의 통로 및 표적화 능력의 정량화 및 시각화를 모두 가능하게 한다.따라서, 당사의 방법은 미리 설정된 세포주를 사용하여 동물 모델을 부분적으로 대체합니다. 환자 유래 뇌종양 세포의 포함은 환자 이질성을 분석하며, 혈액-뇌 장벽을 확립하기 위해 불멸의 세포를 사용하면 결과의 재현성을 보장합니다. 전부, 이 혈액 두뇌 장벽 모형은 약 확산 또는 약 차량의 납품을 분석하기 위하여 정말 흥미로운 공구를 제공합니다.이 방법의 시각적 데모는 삽입의 반대쪽에 있는 셀의 시드를 사용하여 다른 프로토콜에 자주 설명되지 않는 조작이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 삽입을 거꾸로 배치할 때 성상세포의 접착을 얻는 것은 시각적 표현의 이점이 매우 높습니다. 멸균 세포 배양 후드 에서, 조심스럽게 멸균 PBS의 5 밀리리터와 배양 된 성상 세포를 세척.진공 펌프를 사용하여 PBS를 부드럽게 폐기하고 셀 을 분리하기 위해 5 분 동안 세포 해리 시약 2 밀리리터를 추가하십시오. 이어서, 멸균 완전 성상세포 배양 배지의 10밀리리터를 용기에 첨가하여 세포 해리의 활성을 억제한다. 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 분리된 세포를 용기에서 멸균 15밀리리터 튜브로 이송합니다.원심분리기는 실온에서 3분 동안 250배 g로 합니다. 한편 인서트를 설정합니다. 멸균 집게를 사용하여 멸균 6웰 플레이트의 뚜껑에 뇌 측이 있는 인서트를 놓습니다.원심분리가 완료되면 셀 서스펜션에서 상체를 조심스럽게 폐기하고, 튜브 벽에 펠릿을 최대 5회 파이프로 부드럽게 피펫하여 ABM 플러스의 1밀리리터로 성상세포 펠릿을 재놓습니다. 이어서, 세포를 카운트하고, 삽입당 ABM 플러스의 400 마이크로리터에서 세포 현탁액 밀도를 150, 000 세포로 조절한다. 세포 현탁액을 인서트 막의 뇌 측면 중앙에 놓고 멸균 파이펫 팁으로 모세관력을 사용하여 조심스럽게 퍼짐합니다.인서츠의 뇌 측이 여전히 위로 올라가면 6웰 플레이트를 인서치에 다시 놓습니다. 플레이트와 인서트를 뇌 측위로 올려 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣고 세포 접착을 허용합니다. 그 후, 6웰 플레이트를 다시 정규 위치로 되돌리고, 인서트는 이제 혈액 측이 위로 올라간다.매체를 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인큐베이션을 계속합니다. 멸균 세포 배양 후드 하에서, 멸균 PBS의 5 밀리리터로 배양 된 내피 세포를 조심스럽게 씻는다. 진공 펌프를 사용하여 PBS를 부드럽게 폐기하고 셀 을 분리하기 위해 5 분 동안 세포 해리 시약 2 밀리리터를 추가하십시오.이어서, 세포 해리 시약의 활성을 억제하기 위해 혈관에 멸균 완전 내피 세포 배양 배지10밀리리터를 첨가한다. 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 분리된 세포를 용기에서 멸균 15밀리리터 튜브로 이송합니다. 원심분리기는 실온에서 3분 동안 250배 g로 합니다.그 후, 상체를 버리고, 튜브 의 벽에 세포 현탁액을 5배까지 천천히 피펫으로써 EBM 플러스의 1밀리리터로 내피 세포 펠릿을 재연한다. 세포를 카운트하고, 세포 현탁액 밀도를 200, 000 세포로 조정하여 삽입당 혈청 및 혈관 내피 성장 인자-A가 없는 내피 세포 배양의 2.5 밀리리터에서 조정한다. 인서트가 포함된 플레이트를 검색합니다.조심스럽게 혈액 측에서 매체를 버리고 내피 세포 현탁액의 2.5 밀리리터로 대체하십시오. 이어서, 플레이트를 인큐베이터로 돌려보내 내피 세포가 멤브레인에 부착할 수 있도록 하룻밤 을 둡니다. 다음 날, 미리 따뜻워진 ABM-마이너스 3밀리리터를 각 웰에 전송하여 6웰 플레이트를 준비합니다.멸균 집게를 사용하여 인서트를 처리하여 혈액 측에서 내피 완전 배지를 조심스럽게 폐기하고 ABM-마이너스를 포함하는 새 플레이트에 삽입을 넣습니다. 그런 다음 EBM-마이너스 2.5 밀리리터를 추가합니다. 5 일 동안 최소한의 물리적 장애 또는 온도 변화로 인큐베이터에 인서트를 둡니다.전송 당일, 매체를 교체하십시오. 면역 불광 이미징의 경우, 폴리 D-리신 2 밀리리터를 포함하는 6웰 플레이트의 각 웰에 최대 4개의 둥근 멸균 보로실리케이트 커버립을 배치합니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요.한편, 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 세포 배양 용기에서 종양 구체를 15밀리리터 멸균 튜브로 조심스럽게 이송한다. 3 분 동안 250 배 g에서 종양 구체를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 GBM-마이너스의 1 밀리리터로 구를 부드럽게 다시 중단합니다.세포를 계산하고, GBM-마이너스의 밀리리터 당 약 10, 000 구 또는 100, 000 세포로 세포 밀도를 조절한다. 다음으로, 우물에서 폴리 D-리신을 버리고 멸균 PBS로 우물을 세 번 헹구십시오. 종양 스페로이드 현탁액의 3밀리리터로 플레이트의 각 웰을 시드하고, BBTB 모방을 종양 세포 현탁액으로 이송한다.분석의 혈액과 뇌종양 측면이 평형에 올 수 있도록 이산화탄소 5 %와 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양. 다음 날, 혈액 측의 미디어를 분자, 약물 또는 나노 입자로 보충한 EBM-마이너스로 대체하십시오. 이전에 설명한 대로 직접 정량화를 위해 시간이 지남에 따라 샘플을 수집합니다.먼저, BBTB 모방의 혈액과 뇌 측 모두에서 배지 100 마이크로리터를 수집하고, 후속 형광 측정을 위해 별도의 평평한 바닥, 검은 색, 96 웰 플레이트로 각각 전송한다. 다음으로, EBM-마이너스에서 플루오레세인 나트륨의 50 마이크로몰라 용액을 준비하여 우물당 2.5 밀리리터를 준비하십시오. 이 용액을 섭씨 37도로 미리 데우고, 삽입물의 혈액 측에서 미디어를 이 나트륨 형광액을 함유한 미디어로 대체한다.매체를 교체하는 즉시 타이머를 시작합니다. 삽입물의 혈액과 뇌 측모두에서 5분, 30분, 60분, 120분 동안 100마이크로리터의 미디어를 조심스럽게 수집합니다. 각 샘플을 적절한 블랙, 96웰 플레이트의 우물을 분리하도록 전송합니다.플레이트 판독기를 사용하여 수집된 샘플에서 형광을 정량화합니다. 첫째, 리소성 형광염을 미리 데운 매체에서 적절한 작업 농도로 희석한다. 이를 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 45분 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다.그런 다음, 얼음 차가운 PBS로 세포를 세 번 헹구는다. PBS를 폐기하고, 우물에 얼음 차가운 4% 파라포름알데히드 3밀리리터와 2.5 밀리리터를 삽입에 넣습니다. 10분 동안 얼음에 배양하세요.그 후, 파라포름알데히드를 버리고 PBS로 세포를 세 번 헹구십시오. 증류수에서 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도에서 DAPI 용액을 사용하여 세포 핵을 제거하고, 세포 핵을 카운터스테인한다. 실온에서 7분간 배양하세요.그런 다음 DAPI를 제거하고 증류수로 멤브레인을 세 번 세척합니다. 조심스럽게 멤브레인을 잘라 증류수를 제거하고 유리 현미경 슬라이드에 장착 매체의 한 방울에 놓습니다. 멤브레인의 반대편에 장착 매체의 또 다른 방울을 추가하고 조심스럽게 보로실리케이트 커버 유리로 덮습니다.이 연구에서는, 내피 세포는 체외 설치에 있는 혈액 두뇌 종양 장벽 같이 인터페이스를 형성하기 위하여 성상세포와 공동 배양되었습니다. 뮤린 BBTB 모방의 공초점 화상 진찰은 bEND3에서 단단한 접합 단백질 구역 -1 및 claudin-5의 발현 및 세포 국소화를 보여줍니다. 내피 세포와 성상 세포 사이의 접촉은 bEND3 단배양에 비해 내피 세포-세포 접촉에 이 두 단백질의 재배치를 명확하게 유도한다.뇌측에서 GFAP 발현 성상세포를 시각화하기 위해 면역형염색체 염색을 사용하여, 막을 통해 내피세포에 접촉하는 성상체 과정과 말발을 관찰하고 연구할 수 있다. 체외 BBTB 모방의 투과성 값을 체외 혈액-뇌 장벽과 비교하기 위해, 형광나트륨의 실시간 확산은 누드 마우스에 이식된 두개골 창을 통해 이미지화됩니다. 형광 스테레오 현미경을 사용하여, 주요 피알 혈관에서 파생되는 혈관 모세혈관으로부터의 형광 나트륨 확산은 프로브의 전신 주입 전, 도중 및 후에 기록된다.환자 유래 교모세포종 구체를 표적으로 하는 나노 입자의 트랜스사이토시스는 이 BBTB 모방이 어떻게 혈액 측에서 뇌 측으로 화합물의 통과를 시각화하는 데 사용될 수 있는지 를 설명하기 위해 비교된다. NP110-관련 형광 신호는 내피 세포, 성상세포 및 종양 세포에서 리소좀과 공동 국한한다. 또한, NP110s는 내피 세포와 성상세포 사이에서 검출되어 삽입물의 막 기공을 통과한다.NP110s의 전달은 혈액과 뇌 측 모두에서 수집된 샘플로부터형광을 측정하여 정량화되며, 이러한 값은 350나노미터인 결정된 나노입자와 비교된다. 볼 수 있듯이, NP110s만이 BBTB 모방을 교차할 수 있으며, NP350은 혈액 측에 남아 있어 이러한 나노 입자에 대한 투과성 값이 낮아집니다. 삽입을 조심스럽게 처리하고, 조심스럽게 멤브레인의 직접 접촉없이 삽입의 뇌 측에 성상 세포 현탁액을 확산.멤브레인의 손상으로 인해 누출이 발생합니다. 이 방법은 말초 투여 페이로드의 뇌 전달의 질문에 대답하도록 조정할 수 있습니다. 더 큰 막 모공을 가진 다른 삽입을 사용하여, 세포 사치를 공부하는 것도 가능합니다.이 기술은 다른 세포 유형을 사용하여 다른 세포 장벽을 모방하여 수정할 수 있습니다. 또한 항암 약물 검증에 사용되는 실험실 동물의 수를 줄이는 것을 목표로 보다 책임감 있고 윤리적인 연구의 길을 열어줍니다. 파라포름알데히드는 매우 독성이 있는 화학물질이며 그에 따라 처리해야 한다는 점을 기억하십시오.또한 날카로운 메스를 사용하여 인서츠에서 멤브레인을 추출하는 동안주의하십시오.

predicting-vivo-payloads-delivery-using-blood-brain-tumor-barrier

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

침윤성 뇌종양인 교모세포종의 마우스 모델부터 시작하십시오.종양 주변부에서 혈액뇌장벽(BBB)은 손상되지 않은 상태로 유지되며 내피 세포는 분자 진입을 조절하는 긴밀한 접합을 형성합니다.마우스에는 레이저 광을 전달하기 위해 헤드 마운트 광섬유가 장착되어 있습니다.피부와 두개골을 관통하여 뇌에 도달하는 저강도 적외선 레이저를 투여합니다.레이저는 뇌 세포의 분자 산소를 여기시켜 활성 산소종(ROS)을 생성합니다.결과적인 산화 스트레스는 밀착 접합을 방해하고 BBB 투과성을 증가시킵니다.BBB를 통한 체액 누출은 뇌 세포와 혈관을 둘러싸고 있는 간질액(ISF)의 흐름을 향상시킵니다.약물 전달을 위해 설계된 나노 크기의 소포인 리포좀 현탁액을 정맥 주사합니다.리포좀은 파괴된 BBB를 통과하고 향상된 ISF 흐름은 종양 내에서 리포좀의 분포 및 축적을 촉진합니다.시간이 지남에 따라 밀착 접합 단백질의 발현은 BBB 무결성을 회복하고 추가 누출을 방지합니다.

교모세포종의 마우스 모델로의 리포솜 전달을 위한 레이저 유도 혈액-뇌 장벽 파괴

이 비디오에서는 혈액-뇌 종양 장벽을 모방한 체외 모델을 구축하기 위한 포괄적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 모델은 뇌종양 치료를 위한 치료제의 전달을 이해할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다.

혈액-뇌종양 장벽 또는 BBTB 모델: 종양에 대한 치료제 전달을 평가하기 위한 혈액-뇌 장벽 또는 BBB 모델의 적응

이 비디오는 플루오레세인나트륨 분자를 사용하여 체외 혈액-뇌 장벽의 투과성을 평가하기 위한 투과성 분석에 대해 설명합니다.

Blood-Brain Barrier 모방 투과성 분석: 추적자 분자에 대한 BBB 모방의 투과성을 평가하기 위한 체외 분석

소설 고해상도<em&gt; 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기&gt; 이미징 기술

뇌는 잘 시험관이나 자궁외 분석으로 표시되지 않은 자질을 가진 유일한 사이트입니다. 위치 재현성과 성장 특성 정위 마우스 모델을 확실 정위 고정기구 및 저압 주사기 펌프를 사용하여 두개 내 주사로 생성 될 수있다.

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

우리는 유기형 뇌 슬라이스 모델에서 유방암 뇌 전이성 세포의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하기위한 프로토콜을 소개합니다. 상기 방법은 뇌 미세환경 계면 내에서 생체외 방식으로 유방암으로부터의 뇌 전이에 대한 다양한 치료법의 치료 효과를 조사하기 위한 정량적 검정을 제공한다.

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

전임상 테스트를 위해 일반적인 환자 돌연변이에 의해 유도되는 면역 능력이 있는 자가종양 모델을 활용하는 것은 면역 치료 테스트에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일반적인 환자 돌연변이를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용하여 뇌종양 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하므로 정확하고 재현 가능하며 일관된 마우스 모델을 제공합니다.

Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures(환자 돌연변이 시그니처를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용한 생체 내 뇌종양 모델링)

혈액-뇌 장벽은 치료법이 없는 질병인 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 중요한 장애물입니다. 여기에서, 우리는 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양에 축적될 수 있는 in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform을 보고합니다.

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

정형소 소아 뇌종양 모델의 개발에는 암세포를 정밀하게 이식하기 위해 입체 장치를 사용하는 세심한 정밀도가 필요합니다. 여기에 제시된 방법론은 뇌종양 세포를 준비하고, 두개내 주사를 수행하고, 뇌종양 생착을 평가하기 위한 수술 후 모니터링 시스템을 구현하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Stereotaxic Device를 이용한 뇌종양에 대한 Orthotopic Patient-derived Xenograft Models 구축

배우세요 혈액-뇌종양 장벽의 in vitro 모델을 만드는 방법을 쥐와 인간 세포를 사용하여. 이 방법은 중추신경계 종양을 표적으로 하는 약물 전달 예측 가능성을 높여줍니다.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

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