Name: 단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: 학습하세요 3D 단일 분자 추적 현미경법을 활용하여 살아있는 세균 세포 내 형광 표지 단백질의 공간적 위치와 운동 궤적을 분석하는 방법을. 이 기술은 단백질 상호작용과 확산 행동을 연구하는 데 필수적인 도구입니다.

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알레시아 아치모비치와 팅 얀에게 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 버지니아 대학의 고급 연구 컴퓨팅 서비스 그룹의 선임 직원 인 Ed Hall에게 이 작업에 사용되는 최적화 루틴을 설정하는 데 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작업에 대한 자금은 버지니아 대학에 의해 제공되었다.

저자는 공개 할 것이 없다.

제시된 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 중요한 요소는 단일 분자 신호가 서로 잘 분리되도록 하는 것입니다(즉, 공간과 시간에 희소해야합니다(보충 Mov.1)). 세포에 동시에 하나 이상의 형광 분자가 있는 경우, 국소화는 다른 분자의 궤적에 잘못 할당될 수 있습니다. 이를 링크 문제30이라고합니다. 단백질 발현 수준 및 여기 레이저 강도와 같은 실험 조건은 연결 문제를 피하기 위해 선택될 수 있다. 그러나, 대표적인 결과 보장 하기 위해 야생 형 단백질 발현 수준을 얻기 위해 주의 해야 한다. 여기서, 우리는 표지된 단백질의 네이티브 발현 수준을 보장하기 위해 화학적으로 유도성 발현 대신 에네이티브 프로모터의 통제 하에 모든 것을 대체했습니다. 따라서, 여기 레이저 강도(eYFP 깜박임) 또는 활성화 레이저 강도(광-활성 형광 프로브의 경우)는 활성 방출기의 농도를 제 시간에 제어하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 화학염료 표지가 HALO 및 SNAP<s...

생체 분자의 확산 거동을 검사하면 생물학적 기능에 대한 통찰력을 제공합니다. 형광 현미경 검사법 기반 기술은 그들의 모국적인 세포 환경에서 생체 분자를 관찰하기위한 귀중한 도구가되었습니다. 광표백(FRAP) 및 형광 상관분광법(FCS)1 후형광 회복은 앙상블 평균 확산 거동을 제공합니다. 반대로, 단 하나 분자 현지화 현미경 검사법은 높은 공간 및 시간분해능을가진 개별형질 표를 붙인 분자의 관찰을 가능하게 합니다2,3,4. 관심 있는 단백질이 다른 확산 상태에 존재할 수 있기 때문에 개별 분자를 관찰하는 것은 유리합니다. 예를 들어, 대장균의CueR과 같은 전사 조절기가 시토솔에서 자유롭게 확산되거나 DNA 서열에 결합하여 측정 시간 척도에 고정될 때 두 가지 쉽게 구별할 수 있는 확산 상태가발생합니다 5 . 단일 분자 추적은 이러한 서로 다른 상태를 직접 관찰하기 위한 도구를 제공하며 이를 해결하기 위해 정교한 분석이 필요하지 않습니다. 그러나, 그들의 확산 비율이 더 유사한 경우에 다중 확산 상태 및 그들의 인구 분수를 해결하는 것이 더 어려워집니다. 예를 들어, 확산 계수의 크기 의존성으로 인해, 단백질의 상이한 올리고머화 상태는 상이한 확산 상태6,7,8,9로 나타난다. , 10. 이러한 경우 데이터 수집, 처리 및 분석 측면에서 통합 된 접근 방식이 필요합니다.
세포질 분자의 확산 속도에 영향을 미치는 중요한 요소는 세포 경계에 의한 감금의 효과입니다. 세균 세포 경계에 의한 분자 운동에 대한 제한으로 인해 세포 분자의 측정된 확산 속도가 제한된 공간에서 동일한 움직임이 발생한 경우보다 느리게 나타납니다. 매우 천천히 확산 되는 분자에 대 한, 세포 감금의 효과 경계와 충돌의 부족으로 인해 무시할 수 있다. 이러한 경우 Brownian 모션 방정식에 기반한 분석 모델을 사용하여 분자 변위, r또는 명백한 확산 계수 D*의분포를 피팅하여 확산 상태를 정확하게 해결할 수 있습니다. 임의 확산)11,12,13. 그러나, 빠른 확산 cytosolic 분자를 위해, 실험 분포는 더 이상 세포 경계와 확산 분자의 충돌 때문에 제한되지 않은 Brownian 운동을 위해 얻은 것과 유사하지 않습니다. 감금 효과는 형광표지된 분자의 제한되지 않은 확산 계수를 정확하게 결정하기 위해 고려되어야 한다. 몬테카를로 시뮬레이션을 통해 (반)5, 14,15,16 또는 수치학적으로 감금 효과를 설명하기 위해 최근 여러 가지 접근법이 개발되었습니다. 브라우니안 확산6,10,16,17,18,19.
여기에서는 단일 분자 추적에 중점을 둔 단일 분자 국소화 현미경 데이터를 수집하고 분석하기 위한 통합 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 최종 목표는 형광 표지된 세포질 단백질의 확산 상태를 해결하는 것입니다.이 경우, 막대 모양의 세균 세포. 우리의 연구는 DNA 중합효소, PolI가 확산 분석20에의해 DNA 결합 및 언바운드 상태로 존재하는 것으로 나타난 단일 분자 추적을 위한 이전 프로토콜을 기반으로 합니다. 여기서는 단일 분자 추적 분석을 3D 측정으로 확장하고 보다 현실적인 계산 시뮬레이션을 수행하여 세포에 동시에 존재하는 여러 확산 상태를 해결하고 정량화합니다. 데이터는 이중 나선 점 확산 기능(DHPSF)21,22를사용하여 이미징을 통해 형광 방출기의 3D 위치를 결정할 수 있는 가정용 3D 초고해상도 형광 현미경을 사용하여 수집됩니다. 원시 단일 분자 이미지는 사용자 정의 작성 소프트웨어를 사용하여 3D 단일 분자 국소화를 추출한 다음 단일 분자 궤적으로 결합됩니다. 수천 개의 궤적이 풀려져 명백한 확산 계수의 분포를 생성합니다. 마지막 단계에서 실험 분포는 몬테카를로 모션의 몬테카를로 시뮬레이션을 통해 얻은 수치로 생성된 분포와 제한된 볼륨으로 적합합니다. 우리는 살아있는 Yersinia enterocolitica에있는 타입 3 분비 시스템 단백질 YscQ의 확산 상태를 해결하기 위하여 이 프로토콜을 적용합니다. 모듈식 특성으로 인해 당사의 프로토콜은 일반적으로 임의의 세포 기하학적 구조에서 모든 유형의 단일 분자 또는 단일 입자 추적 실험에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2,6-diaminopimelic acid</td><td>Chem Impex International</td><td>5411</td><td>Y. enterocolitica 세포의 성장에 필요합니다.</td></tr><tr><td>4f 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-080-A</td><td>f = 80mm, 2"</td></tr><tr><td>514 nm 레이저</td><td>Coherent</td><td>Genesis MX514 MTM</td><td>형광 여기</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Inivtrogen</td><td>16520100</td><td>현미경에 액체 박테리아 샘플을 장착하기 위한 젤 패드를 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>염화 암모늄</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A9434</td><td>M2G 성분.</td></tr><tr><td>대역통과 필터</td><td>Chroma</td><td>ET510/bp</td><td>여기 경로.</td></tr><tr><td>뇌 심장 주입</td><td>Sigma Aldrich</td><td>53286</td><td>Y. enterocolitica용 성장 매체.</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>223506</td><td>M2G 성분.</td></tr><tr><td>카메라</td><td>이미징 소스</td><td>DMK 23UP031</td><td>위상차 이미징용 카메라.</td></tr><tr><td>유전체 위상 마스크</td><td>Double Helix, LLC</td><td>N/A</td><td>DHPSF 신호를 생성합니다.</td></tr><tr><td>인산이나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>795410</td><td>M2G 성분.</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td>킬레이트 Ca2+. T3SS에서 분비를 유도합니다.</td></tr><tr><td>플립 미러</td><td>Newport</td><td>8892-K</td><td>형광과 위상차 경로 사이를 전환할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>fluospheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8792</td><td>형광 비드. 540/560 exication 및 emission 파장. 직경 40nm.</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td>#1.5, 22mmx22mm</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Chem Impex International</td><td>811</td><td>M2G 성분.</td></tr><tr><td>이머젼 오일</td><td>Olympus</td><td>Z-81025</td>를 <td>대물 렌즈에 장착했습니다.</td></tr><tr><td>철 (II) 황산염</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F0518</td><td>M2G 성분.</td></tr><tr><td>긴 패스 필터</td><td>Semrock</td><td>LP02-514RU-25</td><td>방출 경로.</td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25414A</td><td>M2G 성분.</td></tr><tr><td>도립 현미경을 위한</td> <td>현미경 플랫폼</td><td>Mad City Labs</td><td>맞춤형</td> 플랫폼.</tr><tr><td>날리딕산</td>: <td>Sigma Aldrich</td>, <td>N4382</td><td>Y. enterocolitica 세포는 날리딕산에 내성이 있습니다.</td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>1-U2B991</td><td>60X, 1.4 NA</td></tr><tr><td>오존 클리너</td><td>Novascan</td><td>PSD-UV4</td><td>유리 커버 슬립의 배경 형광을 제거하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>인산칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>795488</td><td>M2G 성분.</td></tr><tr><td>적색 LED</td><td>Thorlabs</td><td>M625L3</td><td>위상차 이미징을 위한 샘플을 비춥니다.625nm입니다.</td></tr><tr><td>sCMOS 카메라</td><td>형광 이미징을 위한</td> <td>Hamamatsu</td><td>ORCA-Flash 4.0 V2</td> 카메라.</tr><tr><td>단역 통과 필터</td><td>Chroma</td><td>ET700SP-2P8</td><td>방출 경로.</td></tr><tr><td>튜브 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-180-A</td><td>f=180 mm, 2"</td></tr><tr><td>Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>균주 AD4442, eYFP-YscQ</td></tr><tr><td>0차 1/4 파장 플레이트</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-514</td><td>여기 경로.</td></tr></tbody></table>

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

단 하나 분자 현지화 현미경 검사법은 수십 나노미터 공간 및 밀리초 측두력 해결책으로 살아있는 세포에 있는 개별 분자의 위치 그리고 운동을 조사합니다. 이러한 기능은 생리학적으로 관련된 환경에서 분자 수준의 생물학적 기능을 연구하는 데 이상적으로 적합한 단일 분자 국소화 현미경 검사법을 만듭니다. 여기서, 우리는 관심 있는 단백질이 나타낼 수 있는 상이한 확산 상태를 추출하기 위해 단일 분자 추적 데이터의 획득 및 처리/분석을 위한 통합 프로토콜을 입증한다. 이 정보는 살아있는 세포에 있는 분자 복합체 대형을 정량화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리는 카메라 기반의 3D 단일 분자 국소화 실험뿐만 아니라 개별 분자의 궤적을 산출하는 후속 데이터 처리 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 궤적은 형광표지된 분자및 이 상태의 상대적인 풍부의 널리 퍼진 확산 상태를 추출하기 위하여 수치 분석 프레임워크를 사용하여 분석됩니다. 분석 프레임워크는 임의의 셀 기하학에 의해 공간적으로 제한된 세포 내 브라우니안 확산 궤적의 스토시 시뮬레이션을 기반으로 합니다. 시뮬레이션된 궤적을 기반으로 원시 단일 분자 이미지가 실험 이미지와 동일한 방식으로 생성되고 분석됩니다. 이러한 방식으로 실험적으로 교정하기 어려운 실험 정밀도와 정확도 제한은 해석 워크플로우에 명시적으로 통합됩니다. 널리 사용되는 확산 상태의 확산 계수 및 상대 모집단 분율은 시뮬레이션된 분포의 선형 조합을 사용하여 실험 값의 분포를 피팅하여 결정됩니다. 우리는 세균성 병원체의 시토솔에서 호모- 및 이종 올리고머 복합체를 형성할 때 다른 확산 상태를 나타내는 단백질의 확산 상태를 해결함으로써 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

여기에 설명된 실험 조건(20,000프레임, 최소 4개의 국소화)과 형광 표지된 융합 단백질의 발현 수준에 따라 약 200-3,000개의 국소화가 10-150개 궤적은 셀당 생성될 수있습니다(그림 2a,b). 명백한 확산 계수의 잘 샘플링된 분포를 생성하려면 많은 수의 궤적이 필요합니다. 여기서 수집된 FOV의 크기는 ~55 x 55 μm이며, 실험당 10개의 FOV가 수집됩니다. 따라서, 실험당 &gt;5,000 궤적을 얻으려면 각 FOV는 적어도 50개의 세포를 포함해야 한다. 이상적으로, 세포 집단은 세포가 서로 접촉하지 않고 가능한 한 조밀하게 만들어져야 합니다. 셀 밀도가 너무 높으면 만지거나 겹치는 셀이 있으면 데이터 후처리에설명된 대로 OUFTI(28)를 사용하여 성공적으로 분할하기가 어려워집니다. 분할이 불량하면 세...

3D 단일 분자 국소화 현미경 검사법은 살아있는 세균 세포에서 형광표지된 단백질의 공간 위치 및 운동 궤적을 조사하는 데 사용됩니다. 본원에 기재된 실험 및 데이터 분석 프로토콜은 풀화된 단일 분자 궤적에 기초하여 세포성 단백질의 널리 퍼진 확산 거동을 결정한다.

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

3D 단일 분자 추적은 개별 단백질의 세포전 국소화 및 동작 거동을 결정할 수 있다. 살아있는 세포에서 단백질의 움직임을 관찰하면 네이티브 환경에서 결합 파트너와의 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 생물학 분자의 확산 상태를 해결하기 위하여 단 하나 분자 추적 데이터를 분석하기 위한 일반적인 틀을 제공합니다.임의로 형성된 세포 체적에 국한된 2D 및 3D 궤적 모두에 적용될 수 있다. 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 미리 준비된 아가로즈 패드에 형광 비드를 증착한 후 현미경 커버 슬립에 놓고 현미경 샘플 홀더에 커버 슬립을 고정시하십시오. 샘플 홀더는 반전형 형광 현미경에 장착됩니다.그런 다음 현미경의 그래픽 사용자 인터페이스를 초기화합니다.여기에서 MATLAB의 사용자 지정 소프트웨어는 계측기 제어에 사용됩니다. 카메라 소프트웨어 HCImage 라이브를 초기화합니다. 카메라 컨트롤 섹션 아래의 캡처 탭에서 노출 시간을 0.03초로 설정한 다음 Live를 클릭하여 카메라의 라이브 피드를 시작합니다.GUI 인터페이스의 적절한 레이저 열기 버튼을 클릭하여 레이저의 차단을 해제하고 아가로즈 패드의 형광 구슬을 흥분시킵니다. 라이브 스트림 모드를 사용하여 카메라의 형광 방출을 봅니다. 사용자 인터페이스의 마이크로 포지셔닝 스테이지 섹션에서 XY 위치 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 X 및 Y 위치를 조정하여 시야의 중심에 적어도 하나의 형광 비드를 배치합니다.필요한 경우 화살표 아래의 드롭다운 상자를 클릭하여 단계 크기를 변경합니다. 다음으로 나노 포지셔닝 스테이지 섹션 아래의 Z 위치 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 Z 위치를 조정합니다. 형광 비드의 이중 나선 점 확산 기능의 방향을 수직으로 설정합니다.이 수직 방향은 Z 교정의 시작점으로 정의됩니다. 50나노미터 단위로 시작 Z 위치 위와 아래 30단계를 스캔합니다. 노출 시간 0.03초를 사용하여 각 단계에서 10프레임을 기록합니다.자동화된 데이터 수집을 시작하려면 Z-교정 에서 이동을 클릭합니다. 원심분리기 는 실온에서 3 분 동안 5, 000 배 중력에서 열 충격 예르시니아 장골염 배양의 1 밀리리터 다음 문화를 제거하고 상체를 폐기합니다. M2G 미디어의 1 밀리리터로 펠릿을 세 번 씻으십시오.최종 헹구기 후, M2G 매체의 250 마이크로 리터에서 펠렛 박테리아를 다시 중단하십시오. 다음으로 형광 구슬을 추가하여 서적 마커로 사용할 수 있습니다. 형광 비드 용액은 현미경에서 볼 때 시야당 1 ~2 개의 구슬만 있도록 추가해야합니다.어떤 응집된 세포와 플레이트 1.5 마이크로리터를 M2G로 만든 1.5~2% 아가로즈 패드에 분리한 다음 패드를 반전시키고 오존 세척 현미경 커버 슬립에 놓음으로써 서스펜션을 부드럽게 혼합합니다. 현미경 목표에 침지 오일 한 방울을 추가하고 현미경 단계에 샘플 홀더를 배치하고 제자리에 고정합니다. 그래픽 사용자 인터페이스를 초기화하여 현미경의 카메라, 샘플 스테이지 및 흥분 레이저를 제어한 다음 카메라 소프트웨어를 초기화합니다.카메라 제어 섹션 아래의 캡처 탭에서 노출 시간을 0.025초로 설정한 다음 Live를 클릭하여 카메라의 라이브 피드를 시작합니다. 마이크로 포지셔닝 스테이지 섹션 아래의 XY 위치 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 X 및 Y 위치를 조정하여 시료 를 스캔하고 세균 세포의 적절한 밀도가 높은 인구로 시야를 찾습니다. 데이터 처리량을 최대화하려면 세포가 서로 겹치거나 닿지 않으면 커버 슬립의 세포 밀도가 가능한 한 높아야 합니다.시야는 또한 데이터를 획득하는 동안 단계 시프트를 측정할 수 있도록 적어도 하나의 형광 비드를 fiducial 마커로 포함시켜야 합니다. 다음으로 나노 포지셔닝 단계 섹션 아래의 Z 위치 화살표를 클릭하여 현미경 단계의 Z 위치를 조정하여 형광 구슬의 이중 나선 점 확산 기능 로브가 수직입니다. 그런 다음 시퀀스로 이동하여 스캔 설정을 선택합니다.프레임 수를 20, 000으로 변경합니다. 다음으로 세 개의 점으로 표시된 단추를 클릭하여 저장 대상 폴더를 선택합니다. 마지막으로 시작하려면 0.025초의 짧은 노출 시간을 사용하여 최대 20, 000 카메라 프레임을 수집합니다.완료되면 그래픽 사용자 인터페이스에서 적절한 레이저 닫기 버튼을 클릭하여 레이저 조명을 차단합니다. 그런 다음 동일한 노출 시간을 사용하여 200 프레임의 어두운 이미지를 수집합니다. Thorlabs LED 옆에 있는 상자를 확인한 다음 Toggle Mirror Up.This는 시편 위의 LED 조명을 켜고 형광 경로에서 위상 대비 경로로 현미경을 전환합니다.위상 대비 경로에서 데이터 수집 소프트웨어를 초기화하고 시작/중지 라이브 디스플레이 버튼을 눌러 카메라에서 라이브 피드를 볼 수 있습니다. 그런 다음 캡처를 클릭하고 이동하여 이미지를 저장하여 현재 시야에서 셀의 위상 대비 이미지를 수집합니다. 형광 비드에 맞게 서적 마커로 사용하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 템플릿 임계값을 사용하여 모든 지역화 및 모든 카메라 프레임을 찾고 맞춥시게 합니다. Easy-DHPSF GUI의 DHPSF SM 섹션의 로컬화 에서 실행을 클릭하여 단일 분자 신호에 맞게 한 다음 팝업 창에서 확인을 클릭하여 기본 설정을 유지합니다. 이 소프트웨어는 이중 나선 점 확산 기능을 닮은 단일 분자 형광 신호를 찾아 서 이중 가우시안 모델을 사용하여 착용하려고 시도합니다.스크립트가 실행되면 사용자는 원시 이미지 데이터의 표시와 성공적으로 장착된 단일 분자 신호의 재구성된 이미지를 볼 수 있습니다. MATLAB에서 사용자 지정 작성된 소프트웨어를 사용하여 단일 분자 지역화 데이터 및 셀 윤곽선 모두에서 동일한 5개의 셀의 셀 폴을 대략적으로 추정하고 클릭하여 팝업 창에서 5개의 제어점 쌍을 수동으로 선택하여 시작합니다. 10개 미만의 지역화가 포함된 셀을 삭제하고 시야 외부에 부분적으로 배치된 셀을 제거한 다음 셀 윤곽선 내부를 클릭하여 팝업 창에서 원치 않는 추가 셀을 삭제합니다.마지막으로 셀 의 윤곽선 경계 내에 있는 지역화를 해당 셀에 할당합니다. 셀 윤곽선 내에 없는 지역화를 폐기합니다. 이 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 중요한 요소는 단일 분자 신호가 서로 잘 분리되는지 확인하는 것입니다.동시에 세포에 하나 이상의 형광 분자가 있는 경우에, 그 때 현지화는 다른 분자의 궤적에 잘못 할당될 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 개 이상의 지역화가 동일한 셀에 동시에 존재하는 모든 궤적을 폐기하여 연결 문제를 제거하는 데 작동합니다. 따라서 단일 분자 신호가 너무 조밀한 경우 처리 중에 많은 양의 데이터가 자동으로 폐기됩니다.형광 표지 융합 단백질의 발현 수준에 따라, 세포당 약 200 ~ 3, 000국산화가 생성될 수 있다. 이러한 지역화는 10에서 150개의 궤적을 생성할 수 있습니다. 잘 샘플링된 분포를 생성하려면 많은 수의 궤적이 필요합니다.여기에 나타난 것은 형광 단백질 eYFP로 표지된 YscQ 의 80, 000의 단일 분자 궤적에 가까운 명백한 확산 계수의 히스토그램이다. YscQ는 막 에 박힌 주입에 결합하여 분자의 분수의 결과로, 검은 색으로 표시된 분포에 의해 표시된 바와 같이 확산되지 않는 약 24 %. 나머지 YscQ 분자는 사이토솔에서 자유롭게 확산됩니다.여기서 설명된 방법 동안, 언바운드 YscQ 분자가 적어도 3개의 뚜렷한 확산 상태에 존재한다는 것을 결정된다. 이러한 결론은 명백한 확산 계수의 분포를 알려진 확산 계수와 함께 시뮬레이션된 분포 라이브러리와 피팅하여 이루어졌습니다. 다중 확산 상태를 해결하려고 할 때, 수천 개의 단일 분자 궤적을 수집하여 명백한 확산 계수 분포가 매우 잘 샘플링되도록 해야 합니다.단일 분자 추적은 야생 형 세포 또는 유전 삭제 돌연변이에서 수행될 수 있어 분자 결합 파트너가 존재하는 경우에만 특정 확산 상태가 나타나는지 여부를 결정할 수 있습니다. 3D 단일 분자 추적을 사용하여 세포단백질과 단백질 복합체의 확산 상태를 해결함으로써 연구자들은 살아있는 세포에서 올리고메릭 단백질 복합체가 어디에서, 언제, 어떻게 형성되는지를 결정할 수 있습니다. 고전력 레이저 소스와 살아있는 인간 병원체와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있습니다.적절한 레이저 안전 및 생물 안전 프로토콜은 항상 따라야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

원자력 교통 단일 분자 이미징

다중 표적 추적은 살아있는 세포의 플라즈마 멤브레인 내에 개별적으로 분류된 분자를 추적용으로 개발된 수제 알고리즘입니다. 효율적으로 검출 nanoscale 멤브레인 역학을 조사하기 위해 사용자 친화적인, 포괄적인 도구를 제공하는 고밀도에서 시간에 따른 분자를 추정하고 추적.

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

학습하세요 3D 단일 분자 추적 현미경법을 활용하여 살아있는 세균 세포 내 형광 표지 단백질의 공간적 위치와 운동 궤적을 분석하는 방법을. 이 기술은 단백질 상호작용과 확산 행동을 연구하는 데 필수적인 도구입니다.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

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