Name: 면역의 혼합된 공상 모델에 Photoactivation에 의해 개별 Autoreactive 어린 싹 센터 질문 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 배우세요 혼합 골수 키메라 모델에서 광활성화를 이용한 자가면역 생식 중심 연구 방법입니다. 이 기술은 세포 위치와 분자 분석을 연결하여 자가면역 질환 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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SE Degn Lundbeckfonden 동료 이며 칼 재단 고유 동료. 이 작품 또한 일부 NNF 생명 부여 (SE Degn)에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+World+Incidence+and+Prevalence+of+Autoimmune+Diseases+is+Increasing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Celiac+Disease%22%5BJournal%5D)">The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing.</a> International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+behavior+of+individual+cells+in+developing+organotypic+brain+slices+revealed+by+the+photoconvertable+protein+Kaede%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede.</a> Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+%E2%80%9CKaede%E2%80%9D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+quantification+of+dendritic+cell+migration+and+antigen+trafficking+between+the+skin+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes.</a> Scientific Reports. 4, 6030(2014).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels%2C+exit+the+node%2C+and+colonize+distant+organs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li>
<li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+single-molecule+photoswitching+in+the+GFP-like+fluorescent+protein+Dronpa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Degn, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Evolution+of+Autoreactive+Germinal+Centers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers.</a> Cell. 170 (5), 913-926 (2017).</li>
<li>Berland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+7-dependent+loss+of+B+cell+tolerance+in+pathogenic+autoantibody+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice.</a> Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).</li>
<li>Chatterjee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C4+maintains+peripheral+B-cell+tolerance+in+a+myeloid+cell+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner.</a> European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).</li>
<li>Toubai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+acute+GVHD+by+sex-mismatched+H-Y+antigens+in+the+absence+of+functional+radiosensitive+host+hematopoietic-derived+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+germinal+centers+in+autoimmune+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice.</a> Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).</li>
<li>Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+through+mixed+chimerism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance through mixed chimerism.</a> Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

면역의 murine 모델의 큰 수를 사용할 수 있습니다, 그리고 많은 자발적인 어린 싹 센터16와 함께 제시. 그러나, 사용 가능한 모델의 많은 복잡 한 유전 배경 또는 돌연변이 중앙 레 귤 레이 터에서 림프 구 증식 또는 활성화, 저조한 intercrossing 기자 라인과 정상적인 림프 구 동작의 연구에 적합 한 그들을 렌더링의 항구 면역에 각각. 현재 모델, 그와 반대로, autoreactive 야생 유형 파생 어린 싹 센터 B 세포로 표현 하는 현재의 경우에서 transgenes, 노크-아웃 및 기자, 원하는 조합을 사용 하 여 심층 분석 하는 ' 플러그 앤 플레이 ' 접근 허용 photoactivatable GFP입니다. Vivo에서 레이블 전략을 사용 하 여, 단일 어린 싹 센터 explanted 림프 조직에 그들의 세포 성분 photoactivated 2 광자 현미경을 사용 하 여 구상 될 수 있습니다. 다음 단일 본 원 센터에서 Photoactivated 세포는 단일 셀 또는 대량에서 분석 또는 정렬 흐름 cytometrically를 될 수 있습니다. 이 세포 면역의 분야에서 새로운된 통찰력을 제공 하기 위해 추가 다운스트림 분자 및 기능 분석 이후에 받게 수 있습니다.
이 절차의 성공적인 성능에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 대표 결과, 방사선에 의해 같이 (1100 Rad) 기증자 골 재구성 성공적으로 B 세포 구획에 가까운 완전 한 chimerism를 양보 받는 사람 골 구획 대체. 이것은 중요 한 포인트, 잔여 받는 파생 B 세포는 어린 싹 센터의 하위 집합 '어두운' 렌더링. 조사에 사용 되는 소스에 방사선의 복용량/타이밍 동물에 최소한의 부수적인 조직의 손상 최대한 myeloablative 효과를 최적화할 수 있다. 재구성에 대 한 뼈 호감 프로토콜 및 20 백만 총 기증자 세포와 재구성 튼튼하게 수익률 높은 재구성도 발견 되었습니다. 살 균 및 냉/얼음 골 추출에 대 한 작업 골 수 기증자의 높은 생존 능력을 보장 합니다. 도달 하기 위해 원하는 기증자 골 비율, 계산 자체 계산 및 계산에 대 한 골 수의 subsample 밖으로 데리고 때 셀의 aliquots 주의 운동에 필수적 이다. 혼합 및 공동 기증자 marrows 대신 centrifuging와 별도로 resuspending 하 고 다음 혼합 산 기증자 비율 계산 셀 다음에 어떤 스큐를 방지 하기 위해 제공 합니다.
프로토콜의 혼합된 골 키메라 생성, 혼자 설 수 있습니다 하 고 원하는 기자, transgene 또는 노크 아웃 autoreactive 어린 싹 센터와 키메라의 세대 수 있습니다. 그러나,이 1 개의 제한은 histocompatible 기증자를 사용 하는 필요입니다. 564Igi 긴장 C57Bl/6J congenic 배경에 그리고 결과적으로, 다른 donor(s)와 한다 H-2b congenic 배경 (또는 양자 택일로, 564Igi 긴장 원하는 긴장과 면역 표현 형을 backcrossed 해야 새로운 배경에서 확인). 조사 절차 tolerogenic 환경17, 선호 하는 경향이 있다 그리고 몇 가지 작은 조직 적합성 항 원 불일치를 용납 수 있습니다. 그러나,이 부분 고려 되어야 한다 철저 하 게, 남성과 여성의 기증자 또는 받는 사람, 남성 제한 Y 항으로 여성 반응성에 대 한 잠재력을 혼합 하는 경우에 특히.
마찬가지로, 프로토콜의 photoactivation 측면, 혼자 서 있을 수 있다 그리고 많은 다른 문맥에서 사용 될 수 있습니다. 그러나, PA GFP 기자는 현재만 아니라 stromal 세포 하지만 모든 조 혈 계보 세포에서 활성화 되어 UBC promotor. 소개에서 설명 했 듯이, 다른 photoactivatable, photoswitchable, 또는 photoconvertible 기자 변종 사용할 수 있으며 실험 조건의 적절 한 조정으로 PA-GFP에 대 한 대체 될 수 있습니다.
900 이상 레이저를 유지 하 여 바람직하지 않은 분야의 실수로 photoactivation를 방지 하는 것이 중요 하다 때 이미징,이 파장은 하지 photoactivate PA-GFP로 nm. Photoactivation 자체, 레이저 파워 및 픽셀 망설임 시간 등의 특정 설정을 사용 하 고, 특정 조직의 조직과 이미징 시스템에 깊이에 따라 달라 집니다 및 각 응용 프로그램은 특정 이미징 시스템 사용에 대 한 최적화. 주의 해야 하지 photodamage에 셀, 하지만 필수적인 다운스트림 분석에 대 한 활성화 된 셀의 충분 한 대표를 얻기 위하여는 스택을 통해 효율적인 photoactivation을 동시에. 어린 싹 센터 B 세포 일반적으로 구성 어디서 나 0.5%에서 ~ 2%, 비장 또는 피부 림프 노드 B 세포의 그리고 대표 결과 (그림 5)에서 볼 수 있듯이 photoactivated 단일 어린 싹 센터 B 세포 총의 ~ 1%를 할 수 있습니다. 인구는 단일 비장 조각에. 따라서, 성공적인 분석 또는 셀의 상당수의 정렬 많은 수의 이벤트를 처리 해야 합니다.

자가 면역 질환의 발병 률 특히 서양 사회에서에서 지난 수십 년간에서 급속 하 게 상승 했다. 오늘, 자가 면역 질환의 병 적 상태와 사망률1서방 세계 가장 널리 퍼진 원인의 목록에 3 계급. 개발 및 자가 면역 질환의 진행에 관한 근본적인 질문은 답이 남아 있다. 기본 질병 메커니즘 및 세포 역학의 우리의 이해에 있는 전진에 대 한 요구 사항 중 하나는 다운스트림 분자 또는 기능적인 분석 셀 하위 집합의 microanatomical 위치의 정확한 커플링. 지난 10 년간에서 정확한 microanatomical 라벨 및 추적 휴대의 안정적인 photoconvertible, photoactivatable, 또는 photoswitchable 생물 fluorophores 기자 긴장에 그들의 통합의 숫자의 개발이 활성화 murine 모델에서 하위 집합입니다.
데, 돌 산호에서 발생 하는 photoconvertible 형광 단백질 보라 빛 또는 자외선 빛2노출 시 붉은 형광을 녹색 형광에서 돌이킬 수 없는 photoconversion를 겪 습. Organotypic 뇌 조각3개발에 개별 셀의 동적 동작을 따라 처음 고용, 세대의 노크 마우스 이후에 허용 vivo에서 세포 움직임을 모니터링 하는 데와 시스템의 분석에 적용 된 면역 세포는 림프절4에서 마이그레이션. 이 접근은 2 세대 기자5이후 세련 된 이었다. 유사한 기자 Dendra입니다6, 최근 vivo7림프절 전이 추적 하는 데 사용 했다.
첫 번째 photoactivatable 단백질 개발 녹색 형광 단백질 (GFP) 단일 지점 돌연변이 (T203H), 설계 된 550 nm8450에서 파장 영역에서 매우 낮은 흡 광도을 선도 했다. 보라색 빛에 의해 photoactivation, 후이 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (GFP PA) 스위치를 400 ~ 흡수 최대 ~ 500 nm, 저조한 대략 100 강도 증가 488의 파장 nm. 모든 조 혈 모 세포가 PA GFP를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 생성 허용, 처음으로, 어린 싹 센터9의 해부학 정의 빛과 어두운 영역에서 B 세포 선택의 심층 분석.
Photoactivation 형광 상태로 비 형광 상태에서 돌이킬 수 없는 변환 이며 photoconversion는 다른 1 개의 파장에서 단방향 전환, 반면 photoswitchable 단백질10 두 조건 사이 셔틀 수 있습니다. . 이 후자의 능력은 최근 단백질 활동11의 광학 제어를 무력화 됩니다.
PA GFP 기자를 활용 하 여, 우리 최근 자발적인 루 푸 스 같은 자가 면역12의 새로운 모델에서 단일 어린 싹 센터 B 세포 레파토리를 특징. 이 모델은 1 개 부품 골 autoreactive B 세포 수용 체 노크에는으로 ribonuclear-단백질 복합물 (564Igi13,14)에 대 한 2 개 부품에서 골 수를 함께 품고 함께 혼합된 키메라 기반 원하는 기증자입니다. 약 6 주 게시물 재구성에 항상성 조건 어떤 자발적인 autoreactive 어린 싹 센터 장과 피부 림프절에는 달성 된다. 특히, 어린 싹 센터 B 세포 인구는 거의 독점적으로 (~ 95%) 비 564Igi 구획에서 파생 된 셀으로 구성 하 고 이러한 야생 유형 파생 B 세포 autoreactive 되었다. 따라서, 모델, 사용 하 여 다양 한 transgenes 노크 아웃 기자 autoreactive 어린 싹 센터 B 세포의 분석에 대 한 ' 플러그와 플레이 ' 접근 수 있습니다. 여기, 우리는 자발적인 autoreactive 어린 싹 센터 PA GFP 기자를 운반 하는 림프 톨에 의해 채워집니다와 혼합된 키메라를 생성 하기 위한 절차를 설명 합니다. Vivo에서 레이블 전략을 사용 하 여, 단일 어린 싹 센터 explanted 림프 조직에 그들의 세포 성분 photoactivated 2 광자 현미경을 사용 하 여 구상 될 수 있습니다. 단일 본 원 센터에서 Photoactivated 세포 수 이후에 cytometry 분석 또는 형광 색소 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 정렬 되며 추가 다운스트림 분자 및 기능 분석을 복종. 단일 본 원 센터에서 autoreactive 세포를 분석 하는 능력 직접 면역의 분야에서 새로운된 통찰력을 제공 하기 위해 적용 될 수 있습니다 하지만 기술과 설명 하는 방법을 찾을 수 있습니다 또한 관련 응용 프로그램의 연구에 감염 증 그리고 종양 전이입니다.

<table><tbody><tr><td>항체, 9D11-A568</td><td>사내에서 생성된</td><td></td><td>9D11 하이브리도마, MC Carroll에서 친절하게 제공, 키트로 라벨링됨: Biotium 92255</td></tr><tr><td>항체, 9D11-A647</td><td>MC</td> Carroll에서 제공한 자체 생성 <td></td><td>9D11 하이브리도마, 키트로 라벨링됨: Nordic Biosite ABD-1031</td></tr><tr><td>항체, FITC 안티-마우스 CD45.1</td><td>Biolegend</td><td>110705</td><td></td></tr><tr><td>항체, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker)</td><td>Biolegend</td><td>144613</td><td></td></tr><tr><td>항체, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1)</td><td>Biolegend</td><td>142403</td><td></td></tr><tr><td>항체, PE/Cy7 anti-mouse CD38</td><td>Biolegend</td><td>102717</td><td></td></tr><tr><td>항체, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220</td><td>Biolegend</td><td>103235</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tube, 마일라로 감싼 헤파린 처리된</td><td>Fisher Scientific</td><td>211766</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기, 70 &마이크로; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 50mL</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립, 정사각형, 22x22mm, 0.13-0.17mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22X22-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>1,084,180,250</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 70%</td><td>VWR</td><td>8301.360</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기, FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기, LSRFortessa SORP</td><td>BD Biosciences-4</td><td></td> <td>레이저 (405 nm, 488 nm, 561 nm 및 640 nm)가 있는 특별 주문 제품</td></tr>그리스<tr><td>, 고진공, 다우 코닝</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>혈구계, Burker-T&uuml; rk</td><td>VWR</td><td>630-1544</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란, 이소플로 수의사.</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>림프구 분리 배지 (림프설라이트-M 세포 분리 매체)</td><td>Cedarlane</td><td>CL5035</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mL (Eppendorf)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.550</td><td></td></tr><tr><td>현미경, 이광자</td><td>Prairie Technologies(현재 Bruker)</td><td>-</td><td>특별 주문 Ultima In Vivo Two Photon Microscope</td></tr><tr><td>Mortar w. lip, unlazed, 75 ml</td><td>VWR</td><td>410-0110</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1063290500</td><td></td></tr><tr><td>바늘, 18 게이지</td><td>BD 의료</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>VWR</td><td>87,769,290</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마</td><td>d8537</td><td></td></tr><tr><td>유봉 균질기</td><td>VWR</td><td>47747-358</td><td></td></tr><tr><td>유봉, 유봉, 유약을 바르지 않은, 175 mm</td><td>VWR</td><td>410-0122</td><td></td></tr><tr><td>피펫, 혈청학적, 10 ml</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td></td></tr><tr><td>피펫, 전사, 플라스틱</td><td>Sarstedt</td><td>861,172,001</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 파라핀 필름(Parafilm M)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>플레이트, 96-well</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>수술용 겸자, 학생 Dumont #5 겸자</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>수술용 겸자, Student Dumont #7 겸자</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위, 학생용 가위, 스트레이트</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 10mL</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES1</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 20mL</td><td>Terumo</td><td>SS-20ES1</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 5mL</td><td>Terumo</td><td>SS-05S1</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 인슐린, 0.3cc</td><td>BD Medical</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>Tribrissen vet. 24% inj., 200mg sulfadiazin 및 40mg trimethoprim/ml</td><td>함유 MSD Animal health</td><td>431577</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>VWR</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>생존도 염료, eBioscience 고정성 생존도 염료 eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr></tbody></table>

면역의 혼합된 공상 모델에 photoactivation에 의해 개별 autoreactive 어린 싹 센터 질문

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

자가 면역 질환은 중요 한 건강 부담 제시. 개발 및 자가 면역 질환의 진행에 관한 근본적인 질문은 답이 남아 있다. 기본 질병 메커니즘 및 세포 역학의 우리의 이해에 있는 전진에 대 한 요구 사항 중 하나는 다운스트림 분자 또는 기능 분석; 셀 하위 집합의 microanatomical 위치의 정확한 커플링 전통적으로 달성 하기 어려운 목표. 안정적인 photoactivatable 생물 fluorophores 기자 긴장에 그들의 통합의 개발은 최근 정확한 microanatomical 라벨 및 murine 모델에서 세포 부분 집합의 추적 활성화 됩니다. 여기, 우리가 설명 어떻게 autoreactive 림프 구 단일 본 원 센터에서 분석 하는 능력 면역에 새로운 통찰력을 제공 하기 위해 도움이 될 수 있습니다 예를 들어 photoactivatable 기자와 면역의 소설 공상 모델의 조합을 사용 하 여 . 생성 하기 위한 절차 섞인 키메라 자발적인 autoreactive 어린 싹 센터 photoactivatable 녹색 형광 단백질 리포터를 운반 하는 림프 톨에 의해 채워진 설명 합니다. Vivo에서 레이블 전략을 사용 하 여, 단일 어린 싹 센터 수 구상 될 explanted 림프 조직에 그들의 세포 성분 photoactivated 2 광자 현미경 검사 법에 의해. 단일 본 원 센터에서 림프 톨 Photoactivated 다음 분석할 수 있습니다 또는 단일 셀 또는 대량, 흐름 cytometrically를 정렬 하 고 추가 다운스트림 분자 및 기능 분석을 받게 될 수 있습니다. 이 방법은 직접 면역의 분야에서 새로운된 통찰력을 제공 하기 위해 적용 될 수 있습니다 하지만 골 키메라와 photoactivation 프로시저 생성 하기 위한 절차 또한 전염병의 연구에서 광범위 한 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다, 종양 전이입니다.

혼합된 골 키메라의 세대
(대 한 통계적 의미 12를 참조 하십시오) 대표는 그림 1 에 표시 된 현재 프로토콜 튼튼하게 B 세포 구획에 가까운 완전 한 chimerism와 혼합된 골 키메라를 달성 한다. Serotyping 밝혀 정규화 된 B 세포 숫자 6 주 9D 11 (idiotype)의 낮은 주파수로 재구성 (그림 1A), 564Igi 구획 (그림 1B)에서 파생 하는 긍정적인 순환 B 세포 게시할 수 있습니다. 총 림프 구 게이트 내에서 잔여 받는 파생 셀 ~ 6%의 낮은 주파수는 CD45.1 (1 분기) ~ 94% (그림 1C)의 chimerism의 전반적인 정도 나타내는. 기증자에서 구획 (CD45.1-, 4 분기 + q 3) 564Igi의 비율 (4 분기) PA GFP를 (Q3)는 약 23% ~ 77%. 이 B 세포의 무거운 부정적인 선택에 의해 입력된 33% ~ 66% 비율 설명 보다 약간 낮은 564Igi 구획 12에서 파생. 그림 1D<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig6.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig6large.jpg" target="_blank"></a>

이 프로토콜 어떤 autoreactive 세포 photoactivatable 녹색 형광 단백질 (GFP PA) 기자를가지고 자연 면역 어린 싹 센터와 혼합된 murine 골 키메라의 생성을 설명 합니다. 이 다운스트림 분자 및 기능 분석 조직에 세포 위치를 연결 하는 기능을 제공 합니다.

면역의 혼합된 공상 모델에 Photoactivation에 의해 개별 Autoreactive 어린 싹 센터 질문

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain ...

자발적인 자가 활성 발아 센터의 이 생리학적으로 관련된 키메라 모델은 다운스트림 분자 분석과 생체 내에서 세포 국소화의 연결을 허용합니다. 자동 반응성 발아 센터의 혼합 키메라 모델의 주요 장점은 다재다능하고 한계성격이며, 사실상 원하는 세포 서브세트 또는 분자 경로의 심문을 허용합니다. 자가 면역 질병 발달의 이 모형의 생리적인 관련성은 새로운 치료의 발전을 도울 수 있는 새로운 통찰력을 가능하게 합니다.이 골수 키메라 모델은 면역학, 면역 종양학 및 줄기 세포 연구에서 사용될 수 있습니다. 광활성화 성분은 조직 국소화를 다운스트림 세포 분석에 연결하므로 광범위한 용도를 가지고 있습니다. 골수 제제와 재구성 및 생체 라벨링 및 조직 절제 단계는 모두 시각적 데모에 잘 빌려주는 기술적으로 복잡한 절차입니다.기증자 564Igi 마우스 대퇴골과 경골을 추출하려면 뒷두개 에서 피부를 제거하고 발을 강제로 당겨 무릎과 발목 관절을 튀어 나섭습니다. 발목 관절을 부러 뜨리기 위해 진행합니다. 그런 다음 경골을 들고 몸을 향해 발을 당겨 경골에서 힘줄과 근육을 제거합니다.경골을 풀어 놓기 위하여 무릎 관절을 끊고, 대퇴골에서 힘줄과 근육을 제거하기 위하여 대퇴골에 붙들고 있는 동안 뼈를 바디쪽으로 당깁니다. 그런 다음, 엉덩이 관절에 절개를하고, 엉덩이 소켓에서 대퇴골을 당기기 전에 힘줄을 잘라. 비슷한 방식으로 상반되는 뒷다리 뼈를 제거한 후 거친 종이 타월로 뼈를 조심스럽게 문지르면 남은 근육과 결합 조직을 제거하고 얼음처럼 차가운 골수 버퍼에서 벗겨진 뼈를 헹구는 다.그런 다음 Dumont 넘버 7 집게를 사용하여 뼈를 얼음에 새겨진 골수 버퍼 용기로 옮겨 보입니다. 골수 세포를 추출하려면, 얼음 차가운 골수 버퍼에 박격포를 헹구고, 신선한, 얼음 차가운 골수 버퍼의 10 밀리리터로 세척 버퍼를 대체하기 위해 10 밀리리터 세로지 피펫을 사용합니다. 집게를 사용하여 뼈를 박격포로 옮기고 유봉을 사용하여 뼈를 분쇄하고 갈아서 골수를 방출합니다.10 밀리리터 파이펫을 사용하여 골수 추출물을 수집한 후 70마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 얼음 위에 50밀리리터 원추형 튜브로 골수 용액을 전달합니다. 그런 다음, 신선한, 얼음 차가운 골수 버퍼의 추가 10 밀리리터와 박격포를 헹구어 세포의 완전한 회복을 보장합니다. 기증자 현탁액을 준비하기 위하여는, 50 밀리리터 원원형 관에 있는 광액성 GFP 및 564Igi 기증자 골수의 적당한 양을 혼합하고, 원심분리에 의하여 세포를 펠렛합니다.혼합 세포 펠릿을 10회 농도에서 얼음-차가운 골수 버퍼의 밀리리터 당 8개의 세포로 재보중단하고, 얼음 위에 미리 냉각된 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 세포를 옮춥니다. 다음으로, 마취CD45.1 수신자 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고, 적절한 재현탁을 보장하기 위해 기증자 골수 세포의 튜브를 쓸어. 골수 믹스 200마이크로리터를 0.3밀리리터, 30게이지 인슐린 주사기로 적재하고, 수령인과 함께 눈 위와 아래에 피부를 부드럽게 펴서 눈을 살짝 튀겨냅니다.주사기의 끝을 약 30도 각도로 눈 과 주변 조직을 피하기 위해 주의하십시오. 바늘의 끝이 눈 소켓 밑줄을 점안뼈에 닿으면, 기증자 골수를 천천히 주입하기 위해 꾸준한 압력을 사용하기 전에 약 0.5 밀리미터 의 바늘을 철회하십시오. 그런 다음 마우스를 전체 회복까지 모니터링하여 광고 리비툼 항생제 물로 케이지에 반환합니다.포플라이트 림프절에 라벨을 부착하려면, PBS의 18 마이크로리터에 물리에리스린 라벨쥐 CD169 항체의 2마이크로리터를 희석하고, 플라스틱 파라핀 필름의 조각에 항체의 2개의 10 마이크로리터 방울을 추가한다. 각 액적을 30 게이지 바늘로 단일 0.3 밀리리터 인슐린 주사기에 적재하고 마취된 수령인 동물의 풋패드에 항체 10 마이크로리터를 주입합니다. 림프절을 수확하기 전에 평평한 표면에 사각형 커버 슬립을 배치하고 진공 그리스로드 5 밀리리터 주사기를 사용하여 각 가장자리에서 약 1 ~ 2 밀리미터 의 그리스로 커버 슬립의 가장자리를 추적합니다.챔버를 차갑고 평평한 표면으로 옮기고 진공 그리스 챔버를 얼음처럼 차가운 골수 버퍼로 채웁니다. 포라이트 림프절에 액세스하려면 직진하고 미세한 가위를 사용하여 안락사 된 받는 동물의 무릎 구덩이 바로 아래에 피부에 절개를하고 햄스트링 라인을 따라 거의 엉덩이 관절까지 절단을 확장하십시오. Dumont 넘버 5 또는 넘버 7 포셉을 사용하여, 포라이트 포사에 있는 조직을 드러내기 위하여 피부의 노출된 플랩을 각각 바깥쪽으로 당기고, 포세이프를 사용하여 포사만 포사에 정중하게 입력합니다.엄지와 검지 손가락을 사용하기 전에 다리의 축을 따라 집게를 열고 닫고 앞면 근면에서 무릎까지 사두근 근육을 꼬집어 포사에서 림프절을 튀어 나오게합니다. 림프절 아래에 집게를 밀어 주변 조직에서 노드를 해방하고 진공 그리스 챔버에 놓습니다. 두 번째 림프절이 수집된 후 진공 그리스 림에 두 번째 커버슬립을 놓고 부드럽게 눌러 챔버를 닫고 모든 기포를 돌출합니다.수확된 비장 조직 샘플에서 발아 센터를 식별하려면 이미징 챔버를 2광광형 현미경의 단계에 배치하고 3.5 밀리리터 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 상부 커버슬립 위에 증류수 한 방울을 놓습니다. 접촉 지점까지 목표를 낮추고 전달된 빛을 사용하여 조직의 상단에 집중합니다. 어두운 모드와 두 광자 여기로 전환하고, 940 나노미터로 레이저를 조정합니다.조직의 표면 근처에 염색CD169에 의해 경계 개별 백색 펄프 영역을 찾아, 중앙 동맥과 관련된 두 번째 고조파 생성에 의해 periarteriolar 림프구 칼집을 식별합니다. periarteriolar 림프성 칼집과 한계 영역 사이의 영역에서, 높은 자동 형광의 존재를 식별, 활성화 된 가색 몸 대식세포및, 이러한 랜드 마크를 사용하여, 하나의 발아 센터 영역 주위에 관심의 영역을 그립니다. 이어서, 약 100 내지 150 마이크로미터깊이의 Z 스택을 설정하여 조직의 표면에서 시작하여 약 3 마이크로미터의 단계 크기를 사용하여 830나노미터 의 발동 파장으로 전환한다.모든 채널을 차단하거나 어둡게 하여 검출기의 광손상을 방지하고 스택을 이미지합니다. 이어서, 940나노미터 의 파장으로 돌아가 채널을 다시 열고, 스택을 통해 스캔하여 화상 스택 전체에 걸쳐 효율적인 광활성화 및 포토피해부재를 확인한다. 혼합 골수 키메라의 세로타이핑은 564Igi 구획에서 유래된 9D11 양성 순환 B 세포의 저주파와 함께, 6주 후 재구성에서 정규화된 B 세포 수를 나타낸다.총 림프구 게이트 내에서, 잔류 수령인 유래 세포의 저주파가 있었는데, 그 중 약 6%는 CD45.1 유래이며, 약 94%의 키머리즘의 전체적인 정도를 나타내며, B 세포 구획에서 사실상 완전한 키머리즘과 광액활성 GFP 골수 유래 B 세포의 우세가 있었으며, 이는 56I의 중음선택의 결과였다. 관찰된 바와 같이, CD169를 사용하여 생체 내 라벨링은 한계 영역의 강력한 시각화를 용이하게 합니다. 제2 고조파 신호는 관절염 림프구 칼집과 고도로 자동 형광, 발아 센터 활동과 관련된 활성화 된 가색 바디 대식세포의 중앙 동맥을 포함하여 콜라겐 함유 구조 요소 및 주요 선박에서 명백하다.종합하면, 이러한 데이터를 통해 단일 광액성 발아 센터가 포함된 관심 영역을 식별할 수 있습니다. 다운스트림 흐름 세포 측정 평가는 정규화된 B 세포 구획 수, 자발적발광센터 집단 및 광활성화 발아 센터 B 세포의 하위 집합의 존재를 더욱 확인한다. 충분한 세포 생존가능성을 보장하기 위해 박출, 광활성화 및 조직 처리 단계의 총 처리 시간을 4~6시간으로 제한하는 것이 중요합니다.상기 광활성화 세포는 단일 발아 센터의 B 세포 수용체 레퍼토리를 특성화하기 위하여, 예를 들어, 단일 세포 시퀀싱을 플로우 정렬및 복종할 수 있다. 혼합 키메라 모델은 새로운 깊이에서 자동 반응성 발아 센터 생물학의 탐구를 허용했습니다, 예를 들어, 에피토프 확산의 과정이 어떻게 전개되는지에 대한 통찰력을 제공. 2광자 현미경 검사용 광원은 눈을 심하게 손상시킬 수 있는 매우 강력한 펄스 클래스 4 레이저입니다.

interrogating-individual-autoreactive-germinal-centers

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

콜라겐 VII 200 아미노산 (AA 757-967)의 스트레치에 대한 IgG 항체를 정화, 우리의 현재 작업에 설명 된 동물 모델에서 젖어 표현형뿐만 아니라 인간을 특징 조직을과 immunopathological 기능을 재현 마우스에 반복적으로 주입 아르 epidermolysis bullosa acquisita...

과립에 따라 달라 Autoantibody 유발 피부 젖어

이 동영상은 면역학적 시냅스 형성으로 이어지는 동종 항원 운반 수지상 세포와의 상호 작용을 관찰하여 혼합 T 세포 집단에서 동종 반응을 평가하는 방법을 보여줍니다. 유세포 분석을 통한 시냅스 함유 이중항의 차등 염색 및 정량화는 T 세포 동질활성을 나타냅니다.

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이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

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