Name: 과분극 1-13C 피루바테의 스핀 격자 이완 자기장 의존도 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 배우세요 과분극 [1-13C]피루바테의 스핀 격자 이완 시간을 저자기장에서 정확하게 측정하는 방법을. 고속 자기장 순환 이완 측정법을 사용하여 MRI 스캐너로 운송 중 극화 손실을 추정합니다.

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저자는 암 연구를 위한 온타리오 연구소, 화상 진찰 번역 프로그램 및 이 연구 자금을 위한 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구 위원회를 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 알버트 첸, GE 헬스케어, 토론토, 캐나다, 지아니 페란테, Stelar s.r.l., 이탈리아, 윌리엄 맨더, 옥스포드 인스트루먼트, 영국과 유용한 토론을 인정하고 싶습니다.

1. 견본 준비
참고: 1.1-1.8단계는 한 번만 수행됩니다.
<ol><li>생체 내연구1,2,5,6,15 mmol/L의 트리아릴메틸 라디칼로 구성된 생체 내 연구에 널리 사용되는 13C 농축 피루빅 산 용액 1 mL을 준비 [1- 13세 C]피루빅산(재료 표참조). 이 스톡 솔루션의 Aliquots는 개별적으로 편광되고 이어서 다른 자기장에서 이완측정을 받는 샘플에 사용됩니다. [1-13C]의 피루브산 분자의 표현은 도 1에도시되어 있다.</li>
	<li>동적 핵 편광판 소프트웨어 인터페이스(재료 표참조)에서 재사용 대기 버튼을 클릭하여 가변 온도 인서트를 VTI(1.4K)로 낮춥니다.</li>
	<li>DNP가 원하는 온도에 도달하면 샘플 컵에 스톡 솔루션의 10 μL을 로드하고 터렛 도어를 열고 이 작업을 위해 특별히 설계된 삽입 지팡이를 사용하여 컵을 VTI에 삽입합니다.</li>
	<li>그 후, 신속하게 지팡이를 추출하고 컵이 해제되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 포탑 도어를 닫고 VTI의 온도가 1.4 K로 돌아가는 동안 다음 단계를 계속합니다.</li>
	<li>재고 솔루션의 과분극에 대한 최적의 RF 주파수를 찾기 위해 DNP가 마이크로파 스윕을 실행하도록 준비합니다.<ol>
<li>분광계(DNP 시스템의 일부)를 제어하는 컴퓨터에서 이전에 적절한 직렬 통신으로 구성된 HyperTerminal 아이콘을 두 번 클릭하여 분광계와 DNP 제어 소프트웨어 간의 통신을 설정합니다. 매개 변수.</li>
		<li>통신이 설정되면 RINMR 소프트웨어를 실행하고 명령줄에 입력합니다. 하이퍼센스NMR,다음 을 누릅니다.</li>
		<li>그런 다음 새 창이 화면에 표시되고 구성 번호 필드에 숫자 1(1)을 입력합니다. 그런 다음 구성 선택 단추를 클릭합니다.</li>
		<li>버튼을 클릭하십시오 전자 레인지 청소를 수행하십시오. 분광계가 준비되었음을 나타내는 초의 내림차순 카운터가 있는 작은 창이 시작되며, DNP 제어 소프트웨어에서 나오는 주기적인 트리거 신호를 기다리며 편광을 샘플링합니다.</li>
		<li>DNP 제어 소프트웨어에서 캘리브레이트 탭을 선택하고 생성 버튼을 클릭합니다.</li>
		<li>교정 설정 창을 사용하여 시작 주파수 = 94.117 GHz, 최종 주파수 = 94.137 GHz, 단계 크기 = 1 MHz, 단계 지속 시간 = 300초, 전력 = 50mW, 액체 헬륨 레벨 = 65%, 온도 = 1.4 K.</li>
		<li>설정 창을 닫고 원하는 전자 레인지 스윕을 수행하는 데 필요한 단계 수와 시간을 표시하는 교정 탭으로 돌아갑니다 생성버튼을 클릭합니다.</li>
		<li>원하는 VTI 온도가 달성되면 활성화 버튼을 클릭한 다음 전자레인지 스윕 프로세스를 초기화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로웨이브 스윕이 끝나면 샘플을 회수하고 최대 편광이 이루어지는 최적의 주파수를 기록합니다. 이 최적 주파수는 그림 2에나타난 바와 같이 최대 편광을 제공하는 편광 주파수로 정의됩니다. 이 주파수는 피루브산의 특정 재고 용액으로부터 얻어진 모든 양극질극화에 사용됩니다.</li>
	<li>40mmol/L 트리스 염기 용액, 염화나트륨 50mmol/L, 탈이온수에서 80mmol/L 수산화나트륨용액을 사용하여 250 mL의 재고 용해 매체를 준비합니다. 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 100 mg/L의 농도로 첨가하여 금속 이온 오염을 분리합니다. 피루브산 스톡 용액과 유사하게, 이 용해 배지는 편광될 모든 상이한 시료에 사용될 것이다. 사용되는 화학물질에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.</li>
	<li>또한 탈이온수에 용해된 100 mg/L EDTA로 구성된 500 mL의 재고 세척 용액을 준비합니다. 이 세정 용액의 약 10 mL는 DNP의 용해 경로를 청소하기 위해 각 편광 후에 사용된다. 참고: 단계 1.9-1.27은 각 개별 샘플에 대해 수행됩니다.</li>
	<li>DNP 메인 윈도우의 재사용 대기중 버튼을 눌러 [1-13 C] 피루브 산 샘플을 과극화하는 제조과정에서 DNP 장치를 1.4K로 냉각시다.</li>
	<li>분광계에 사용된 소프트웨어가 구성 1을 선택한 상태로 이미 활성 상태인 경우 다음 단계를 진행합니다. 그렇지 않으면 1.5.1에서 1.5.3 단계까지 수행한 다음 다음 단계를 계속합니다.</li>
	<li>DNP의 분광계를 제어하는 창에서 구성 1이 선택되었는지 확인한 후 솔리드 빌드 업 버튼을 클릭합니다.</li>
	<li>파일 이름 SSBuilupXXX를 입력합니다. 이 번호는 소프트웨어에 의해 자동으로 증가됩니다. 그런 다음 확인을클릭합니다. 마이크로파 스윕 케이스와 마찬가지로 분광계가 준비되었음을 나타내는 내림차순 카운터가 있는 작은 창이 시작되며 DNP 제어 소프트웨어에서 나오는 주기적인 트리거 신호를 기다리며 편광을 샘플링합니다. .</li>
	<li>피루빅산을 사용하여 - 1.1단계에서 제조된 OX063 스톡 용액을, 샘플 컵에서 30 mg의 무게를 측정하였다.</li>
	<li>원하는 VTI 온도가 달성되면 (1.4 K) 삽입 샘플을클릭한 다음 일반 샘플을 선택한 다음 다음을클릭합니다. 화면에 표시된 안전 주의 사항을 따라 이 작업을 위해 특별히 설계된 긴 지팡이를 사용하여 차가운 DNP 장치에 컵을 삽입하십시오.</li>
	<li>컵을 삽입하면 지팡이가 제거되고 DNP 문이 닫히면 다음을 클릭한 다음 완료합니다. 이 시점에서 과편광시스템은 샘플 컵을 부분적으로 채워진 조사 챔버로 낮춥니다(65%). 액체 헬륨과 함께.</li>
	<li>온도가 1.4K로 돌아올 때까지 기다린 다음 편광 샘플 버튼을 클릭합니다.</li>
	<li>새 팝업 창에서, 1.6단계에서 마이크로웨이브 스윕으로부터 얻어진 주파수 값을 설정한다. 같은 창에서 전력을 50mW로 설정하고 샘플링 시간을 300초로 설정합니다. 참고: 편광이 시작되면 DNP 제어 소프트웨어는 300s마다 트리거 신호를 생성하여 분광계에 작은 팁 각도를 사용하여 분광계를 샘플링하도록 지시합니다. 이렇게 하면 분광계 소프트웨어는 고체 자화 곡선에 샘플 포인트를 추가하여 분광계 소프트웨어와 DNP제어 소프트웨어에 모두 표시됩니다. 4 번째 샘플 및 그 후 모든 샘플 후, 분광계 소프트웨어는 양식의 기하 급수적 인 성장 기능에 곡선을 맞습니다 : S = A * exp (-t/Tp) + y0 여기서 A는 편광 진폭이고, 임의 의 단위에서 t는 샘플링 시간이고, Tp는 편광 시간 상수(초 모두)이고 y0은오프셋입니다. 장착된 매개 변수를 기반으로 소프트웨어는 해당 시점까지 달성된 백분율 편광을 계산하며 DNP의 편광 상태 탭에도 표시됩니다.</li>
	<li>고체 자화의 축적이 최대 (약 1 시간)의 95 % 이상에 도달 할 때까지 편광.</li>
	<li>샘플이 편광되는 동안 아래 섹션 2에 설명된 대로 빠른 필드 사이클링 완화계를 준비합니다.</li>
	<li>원하는 편광이 달성되면 실행 용해를 클릭하고 방법에서 Pyruvic 산 테스트를선택합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.</li>
	<li>화면의 지침에 따라 DNP 포탑 도어를 열고 섹션 1.5에서 제조된 용해 배지의 ~ 4.55 mL로 장치 상단에 가열 및 가압 챔버를 적재하여 80 mmol/L 피루바테의 농도를 생성합니다. ~ 7.75의 pH및 ~ 37 °C의 온도에서 용해.</li>
	<li>복구 지팡이를 올바른 위치에 놓고 포탑 문을 닫은 다음 컴퓨터에서 다음을 클릭한 다음 완료를클릭합니다. 이 시점에서 용해 매체는 압력이 10 bar에 도달 할 때까지 과열됩니다.</li>
	<li>10 bar 압력에 도달하면 냉동 및 극극화 된 피루베이트는 액체 헬륨 욕조에서 자동으로 들어 올려지고, 빠르게 혼합되고 과열 된 용해 매체로 해동되고 모세관 튜브를 통해 배 모양의 플라스크로 배출됩니다. 과분극 화된 피루베이트/용해 매질 혼합물이 배출되는 동안, 균일한 혼합물을 보장하기 위해 플라스크를 지속적으로 소용돌이치게 한다.</li>
	<li>모든 혼합물이 배출되면, 액체의 1.1 mL을 주사기로 빠르게 그리고, 미리 온난(37°C) 10 mm 직경의 NMR 튜브로 옮기고, 필드 사이클링 릴렉시오미터로 빠르게 이송한다(단계 2.2.12 참조).</li>
	<li>모든 피루브식 용해의 남은 알리쿼트(재료 표참조)로 분배하여 가능한 체계적인 실험 효과를 확인합니다.</li>
	<li>깨끗한 용해 배지를 사용한 후 에탄올을 사용하여 DNP 유체 경로를 즉시 세척하십시오. 유체 경로를 통해 헬륨 가스를 날려 나머지 세척액을 제거하고 산소의 경로를 제거합니다. 모든 유리 제품을 청소하십시오.</li>
	<li>각 측정 후, 벤치 상단 분광계와 필드 사이클링 이완계 모두에서 샘플의 pH를 기록합니다. 참고: 각 T1 측정은 DNP 장치로부터 별도의 극극화 용해이므로 시료 조성물의 측정 대 측정 재현성을 보장하기 위해 주의가 필요합니다. 이는 최종 극극화 솔루션의 정확하고 재현 가능한 준비를 보장하기 위해 0.1 mg의 정밀도로 모든 제제와 용매를 계량함으로써 달성됩니다.</li>
</ol>2. 이완측정
참고 다음 단계에서 설명한 다른 매개 변수의 선택 및 사용에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. 용해되기 전에 이완계 플립 각도를 계산해야 하며 이분계는 극극화 용액의 측정을 위해 설정및 준비되어야 합니다(아래 참조).
<ol><li>플립 앵글 보정
	<ol>
<li>NMR 튜브에 1 mL의 깔끔한 [1-13 C]pyruvic 산을 준비하고 가돌리늄 조영제를 추가하여 13C 핵의 T1을 200 ms 미만의 값으로 50 ms 이상으로 감소시킴을 량.</li>
		<li>NMR 튜브를 밀봉하여 교정 표준으로 여러 번 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>이력계의 깊이 게이지를 사용하여 NMR 튜브의 삽입 깊이를 적절한 높이로 설정하여 샘플이 이완계 RF 코일의 중심에 위치하도록 합니다.</li>
		<li>13C피루베이트 교정 표준의 삽입 깊이를 접착제 테이프로 표시하여 반복성을 보장합니다.</li>
		<li>NMR 튜브의 깊이 스토퍼를 테이프로 표시된 위치에 놓고 이 교정 표준을 필드 사이클링 완화계의 보어에 삽입합니다. 무게를 사용하여 NMR 튜브를 제자리에 유지하십시오.</li>
		<li>계측기 에어 밸브를 열고 릴리소미터 전면 패널에서 온도 컨트롤러를 37 °C로 설정합니다. 즉, 실험 중에 가열 된 공기를 사용하여 37 ° C (± 0.5 ° C)에서 샘플의 온도를 유지합니다.</li>
		<li>필드 사이클링 이완계 하드웨어를 설정하여 13C핵 신호를 수집합니다. 여기에는 외부 심 코일 설치 및 에너자이징(재료 표참조), RF 코일을 8MHz(13C 핵의 경우 ~0.75T)로 튜닝 및 일치시키고, 적절한 λ/4 케이블을 사용하는 것이 포함됩니다.</li>
		<li>계측기 소프트웨어에서 다음 단계를 수행합니다.<ol>
<li>기본 파 탭 선택</li>
			<li>레이블 실험 옆에 있는 셀을 클릭하고 팝업 창에서 아래로 스크롤하여 펄스 시퀀스 "13CANGLE을 선택합니다. FFC ".</li>
			<li>다음 수집 매개 변수 를 설정합니다: RFA = 5; SWT = 0.005, RD = 0.5, BPOL = 30MHz, TPOL = 0.5.</li>
			<li>Acq. 파 탭을 선택한 다음 기본 하위 탭을 선택합니다.</li>
			<li>레이블 Nucleus 옆에 있는 셀을 클릭하고 팝업 창에서 아래로 스크롤하여 13C를선택합니다.</li>
			<li>그런 다음 다음 매개 변수를 설정합니다: SF = 8MHz, SW = 1000000, BS = 652, FLTR = 100000, MS = 32.</li>
			<li>Conf 하위 탭을 선택합니다.</li>
			<li>다음 매개 변수를 설정합니다: RINH = 25, ACQD = 25.</li>
			<li>nDim 하위 탭 선택</li>
			<li>설정 NBLK = 32, BINI = 2, 굽힘 = 62.</li>
			<li>평가 탭을 선택한 다음 매개 변수 하위 탭을 선택합니다.</li>
			<li>다음 매개 변수를 설정합니다: EWIP = 10, EWEP = 128, EWIB = 1, EWEB = 32.</li>
			<li>그런 다음 획득 시작 아이콘을 클릭하여 펄스 시퀀스를 실행합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수집이 완료되면 데이터를 저장하고 평가 대화 상자 아이콘을 선택하고 분석 메뉴에서 WAM 창: 절대 크기선택 . 그런 다음 보고서 시트, 그래프 및 내보내기 파일을 선택하고 마지막으로 실행을클릭합니다.</li>
		<li>보고서 창에서 최대 진폭을 제공하는 RF 펄스 폭을 찾아 표시된 그래프에서 커서의 도움으로 값을 미세 조정하는 것은 그림 3의맨 아래 행에 표시된 플롯과 유사합니다. 이러한 펄스 폭은 다음 실험의 파라미터 PW90에 사용된다.</li>
		<li>F1 아이콘을 클릭하여 완화계의 주파수 이동을 조정합니다. 참고: WAM 창: 절대 크기는 EWIP에 의해 정의된 지점에서 EWEP및 블록에서 지정한 지점까지 단일 또는 자유 유도 붕괴 획득(FID)의 크기를 통합하는 절차입니다. EWIB에서 EWEB에서지정한 블록에 정의합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>T1-측정
	<ol>
<li>외부 심 코일이 설치되고 활성화되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>계측기 소프트웨어에서 다음 단계를 수행합니다.<ol>
<li>기본 파 탭 선택</li>
			<li>레이블 실험 옆에 있는 셀을 클릭하고 팝업 창에서 아래로 스크롤하여 그림 4에표시된 펄스 시퀀스 HPUB/S를선택합니다.</li>
			<li>다음 수집 매개 변수 를 설정: RFA = 25, T1MX = 3과 5 사이의 값; SWT = 0.2, RD = 0, BRLX = MHz에서 원하는 이완 필드 (양성자 Larmor 주파수).</li>
			<li>Acq. 파 탭을 선택한 다음 기본 하위 탭을 선택합니다.</li>
			<li>레이블 Nucleus 옆에 있는 셀을 클릭하고 팝업 창에서 아래로 스크롤하여 13C를선택합니다.</li>
			<li>그런 다음 다음 매개 변수를 설정합니다: SF = 8MHz, SW = 1000000, BS = 652, FLTR = 50000.</li>
			<li>Conf 하위 탭을 선택합니다.</li>
			<li>다음 매개 변수를 설정합니다: PW90단계 2.1.10, RINH = 25, ACQD = 25에 있는 값과 같습니다.</li>
			<li>펄스 하위 탭을 선택하고 PW = 5를 설정합니다.</li>
			<li>nDim 하위 탭을 선택하고 NBLK = 100을 설정합니다.</li>
			<li>데이터 수집을 시작하기 위해 초분화 된 솔루션을 받을 준비를하십시오.</li>
			<li>샘플을 완화계에 삽입하기 직전에 콘솔에서 펄스 시퀀스를 수동으로 시작하여 샘플을 null 자기장에 삽입하지 않도록 하십시오. 이러한 이유로 데이터 분석 중에 첫 번째 자유 유도 디감(FID)을 무시하는 것이 중요합니다.</li>
			<li>수집이 완료되면 저장 단추를 클릭하여 데이터를 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>분석 소프트웨어를 사용하여 각 FID 신호의 크기를 통합하여 시간 함수로 샘플 자화로 구성된 데이터 계열을 생성합니다.</li>
		<li>상용 분석 소프트웨어에 구현된 표준 비선형 최소 제곱 피팅 알고리즘을 사용하여 3개의 매개변수 지수 모델에서 스핀 격자 이완 시간을 추출합니다(재료 표참조)에 대해 가중치를 가정합니다. 모든 데이터: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59399/59399eq1.jpg"> A가 초기 신호 진폭(y-intercept)인경우,T1은 스핀 격자 이완 시간, TR은 반복 시간이며, 이는 공지된 값이며, y0은 신호입니다. 오프셋 및코스(n-1)(α)는플립 각도, α에대한 nth측정에서 세로 자화의 손실에 대한 보정이다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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DNP를 사용하여 신호 수집을 향상시키는 것은 동물 주사에 사용되는 것과 같이 제한된 농도에서 13C 핵에서 사용할 수있는 불충분한 자기 공명 신호에 대한 기술적 인 해결책이지만 다른 실험 적 과제를 제시합니다. 도 7에 나타낸 각 이완 측정은 재측정을 위해 용해 후 재편분화될 수 없기 때문에 고유하게 준비된 샘플의 측정을 나타낸다. 이것은 필연적으로 샘플의 계량 및 용해 매체 의 무게 또는 용해 공정 자체의 변화, 예 : 불완전한 추출 및 시료의 철저한 혼합과 같은 샘플 준비의 사소한 차이로 인해 실험 적 가변성을 유도합니다. 용해 매체와 함께. 이러한 가변성은 이완 후 각 피루브액의 pH를 측정하여 부분적으로 평가될 수 있다. 에 관계없이 육수 pyruvate / 라디칼 혼합물및 용해 매체의 주의 깊은 계량에 관계없이 밀리그램보다 더 나은 DNP 장치에 삽입하기 전에, 우리의 실험에서 pHs는 5.5에서 8.3까지 범위. 우리는 pH 범위 7.6 ~ 8...

자기 공명 분광 화상 진찰 (MRSI)는 분광 화상 진찰에 의해 검출된 대사 산물의 공간 지도를 생성할 수 있습니다, 그러나 그것의 실제적인 사용은 수시로 그것의 상대적으로 낮은 감도에 의해 제한됩니다. 생체 내 자기 공명 영상 및 분광법의 이 낮은 감도는 체온과 합리적인 자기장 강도에서 달성 할 수있는 핵 자화의 작은 정도에서 비롯됩니다. 그러나 이러한 한계는 동적 핵 분극(DNP)을 사용하여 액체 기판의 체외 자화를 크게 향상시키고, 이후에 MRSI1,2를 사용하여 생체 내 대사를 프로브하기 위해 주입되는 것을 크게 향상시킴으로써 극복될 수 있다. , 3개 , 4. DNP는 제로 핵 스핀으로 대부분의 핵의 자화를 향상시킬 수 있으며 피루베트5,6,중탄산염과 같은 13 C 농축 화합물의 생체 MRSI 감도를 높이는 데 사용되었습니다. 7,8, 화분9,락테이트10,글루타민11,그리고 그 외 는 진도12의4 개 이상의 순서로 . 그것의 응용프로그램은 혈관 질병13,14,15,기관 관류13,16,17,18,암의 화상 진찰을 포함합니다 검출1,19,20,21,22,종양 준비23,24,및 치료 반응의 정량화2 , 6개 , 23세 , 24세 , 25개 , 26.
느린 스핀 격자 이완은 MRSI를 통해 생체 내 검출에 필수적입니다. 수십 초의 순서로 스핀 격자 이완 시간(T1s)은 용액의 작은 분자 내에서 낮은 자이로 자기 비율을 가진 핵에 대해 가능합니다. 몇몇 물리적 요인은 핵 스핀 전이와 그 환경(격자) 사이의 에너지 전달에 영향을 미치며, 자기장 강도, 온도 및 분자형태(27)를포함하는 이완으로 이어진다. 양성자가 직접 부착되지 않은 탄소 위치에 대한 분자에서 이극이 감소되고 용해 매체의 증정은 분자 간 이극성 이완을 더욱 감소시킬 수 있습니다. 불행하게도, deuterated 용매는 생체 내에서 이완을 확장하는 제한된 능력을 가지고 있습니다. 탄산염 또는 카르복실산(예: 피루브산)의 이완증가는 화학적 시프트 이방성으로 인해 높은 자기장 강도에서 발생할 수 있습니다. 편광 후 용해 시 유체 경로에서 파라마그네틱 불순물이 존재하면 급격한 이완이 발생할 수 있으며 킬레이터를 사용하여 피하거나 제거해야 합니다.
스핀 격자 이완이 상당히 빠를 수 있는 낮은 필드에서 13C함유 화합물의 이완을 위한 데이터는 거의 존재하지 않습니다. 그러나, 과분극 조영제는 일반적으로 가까운 또는 지구의 DNP 장치에서 분배되기 때문에, 생체 내 이미징에 사용되는 에이전트의 준비 중에 이완을 이해하기 위해 낮은 필드에서 T1을 측정하는 것이 중요합니다 필드. 13C 농축 기판 농도, 용액 pH, 완충제 및 온도와 같은 추가물리적 인자도 이완에 영향을 미치며, 결과적으로 제제의 제형에 영향을 미친다. 이러한 모든 요소는 DNP 용해 공정을 최적화하는 데 핵심 파라미터의 측정과 DNP 장치에서 이미징 자석으로 샘플을 수송할 때 발생하는 신호 손실의 크기를 계산하는 데 필수적입니다.
핵 자기 공명 분산 (NMRD) 측정, 즉, T 1 측정, 자기장의 함수는 일반적으로 NMR 분광계를 사용하여 획득된다. 이러한 측정값을 획득하기 위해,시료가 먼저 분광계에서 셔틀링되는 곳에서 자석28,29,30의 프린지 필드에서의 위치에 의해 결정된 일부 필드에서 이완되는 경우 shuttling 방법을 사용할 수 있습니다. NMR 자석으로 빠르게 다시 이송하여 남은 자화를 측정합니다. 자기장의 동일한 지점에서이 과정을 반복하지만 이완 기간이 증가하면 이완 곡선을 얻을 수 있으며, 이를 분석하여 T1을추정할 수 있습니다.
우리는 우리의 NMRD 데이터를 취득하기 위하여 빠른 필드 사이클링이완31,32,33로 알려져 있는 대체 기술을 이용합니다. 우리는 과극화 된 13C 핵을 포함하는 용액의 T1 측정에 대한 상업용 필드 사이클링 완화계 (재료 표참조)를 수정했습니다. 셔틀 방식과 비교하여 필드 사이클링을 통해 이 이완계는 더 작은 자기장 범위(0.25mT ~ 1T)에 걸쳐 NMRD 데이터를 체계적으로 수집할 수 있습니다. 이는 자기장의 샘플 위치가 아니라 자기장 자체를 빠르게 변화시킴으로써 달성됩니다. 따라서, 시료는 높은 전계 강도에서 자화될 수 있고, 낮은 전계 강도에서 "이완"되고, 그 후 고정된 필드(및 Larmor 주파수)에서 자유 유도-감쇠를 획득하여 측정하여 신호를 최대화할 수 있다. 즉, 측정 중에 시료 온도를 제어할 수 있으며, NMR 프로브는 전체 자기장 범위에 걸쳐 자동 수집을 촉진하는 각 이완 장에서 조정할 필요가 없습니다.
낮은 자기장에서 극극화된 용액을 분배하고 운반하는 효과에 초점을 맞추고, 이 작품은 빠른 속도로 극극화된 13C-pyruvate의 스핀 격자 이완 시간을 측정하는 상세한 방법론을 제시합니다. 0.237 mT ~ 0.705 T의 범위에서 자기장에 대한 필드 사이클링 완화. 이 방법론을 사용하는 주요 결과는 이전에[1-13C]pyruvate34 및 13C 농축 나트륨 및 세슘 중탄산염35에 대해 제시되었으며, 여기서 급진적 인 농도 및 용해 pH와 같은 다른 요인이 있습니다. 또한 공부 했다.

<table><tbody><tr><td>[1-13C]피루브산</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>677175</td><td></td></tr><tr><td>10mm NMR Tube</td><td>Norell, Inc., Morganton NC, USA</td><td>1001-8</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 이수화물(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>HyperSense Dynamic Nuclear Polarizer</td><td>Oxford Instruments, Abingdon, UK</td><td></td><td>는 다음을 포함한다: 전체 DNP 편광자를 제어하고 모니터링하기 위해 사용되는 "DNP-NMR Polarizer" 소프트웨어; 고체 상태 편광 레벨을 모니터링하기 위해 사용되는 "RINMR"; 고체 상태 편광 레벨을 모니터링하는 RINMR 소프트웨어와 DNP 소프트웨어를 통신하는 데 사용되는 "HyperTerminal". 또한 자체 RINMR 소프트웨어</td></tr><tr><td>MATLAB R2017b</td><td>MathWorks, Natick, MA</td><td></td>와 함께 액체 상태 분광을 모니터링하는 MQC 벤치 탑 분광계가 포함되어 <td>있습니다. 시간 경과에 따른 자화 붕괴의 비선형 피팅 및 과분극 피루브산의 T1 NMRD 분석을 위한 스크립트를 포함합니다.</td></tr><tr><td>OX063 트리아릴메틸 라디칼</td><td>옥스포드 인스트루먼트, Abingdon, 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기 - SympHony</td><td>VWR International, Mississauga, ON., Canada</td><td>SB70P</td><td></td></tr><tr><td>ProHance</td><td>Bracco Diagnostics Inc.</td><td></td><td>Gadoteridol, Gd-HP-DO3A</td></tr><tr><td>순수 에탄올 (100% 순수)</td><td>상업용 알코올, 토론토, 온타리오, 캐나다</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Shim Coil</td><td></td><td></td><td>자체 개발</td></tr> 염화<tr><td>나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>S8045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SpinMaster FFC2000 1T C/DC</td><td>Stelar s.r.l., Mede (PV) Italy</td><td></td><td>실험 매개변수를 설정하고, RF 코일의 튜닝 및 매칭을 모니터링하고, 다른 펄스 시퀀스를 로드하고, 플립 각도를 보정하고, 데이터 수집 및 곡선 피팅을 수행하는 데 사용되는 소프트웨어 "AcqNMR"이 포함되어 있습니다. 또한 깊이 게이지, 일부 무게 및 깊이 스토퍼가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Trizma Pre-Set Crystals (pH 7.6)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T7943</td><td></td></tr></tbody></table>

과분극[1-13c] 피루바테의 스핀 격자 이완 자기장 의존도 측정

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

과분극 13C 농축 화합물의 생체 내 이미징 응용 프로그램에 대한 기본 제한은 유한 스핀 격자 이완 시간입니다. 버퍼 조성, 용액 pH, 온도 및 자기장과 같은 다양한 요인이 이완 속도에 영향을 미칩니다. 이 마지막 점에서, 스핀 격자 이완 시간은 임상 필드 강도에서 측정 될 수있다, 하지만 낮은 필드에서, 이러한 화합물은 편광판에서 분배하고 MRI로 이송, 이완은 더 빠르고 측정하기 어렵다. 수송 도중 손실된 자화의 양을 더 잘 이해하기 위하여는, 우리는 ~ 0.75 T에서 13C 핵의 자기 공명 검출과 함께 빠른 필드 사이클링 이완을 사용했습니다, 핵 자기 공명 분산을 측정하기 위하여, 과분극 [1-13C]피루바테의 스핀 격자 이완 시간. 용해 동적 핵 편광은 80 mmol/L 및 생리적 pH(~7.8)의 농도에서 피루브의 극극화된 샘플을 생성하는 데 사용되었다. 이러한 솔루션은 빠른 필드 사이클링 완화계로 빠르게 전달되어 시료 자화의 이완을 보정된 작은 플립 각도(3°-5°)를 사용하여 시간 함수로 측정할 수 있습니다. 피루바테의 C-1 분산을 매핑하기 위해 0.237 mT와 0.705 T 사이의 다양한 완화 필드에 대한 데이터를 기록했습니다. 이 정보를 통해 언급된 자기장 범위 내에서 극극화된 기판의 스핀 격자 이완을 추정하는 경험적 방정식을 결정했습니다. 이러한 결과는 운송 중에 손실되는 자화량을 예측하고 신호 손실을 최소화하기 위한 실험 설계를 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 2는 피루빅산을 위한 고해상도 풀레인지 마이크로웨이브 스윕의 예를 제시한다. 제시된 경우, 최적의 마이크로파 주파수는 그림 삽입에서 강조 표시된 94.128GHz에 해당합니다. 당사의 DNP 시스템은 일반적으로 93.750GHz ~ 94.241GHz 의 범위에서 작동할 수 있으며, 스텝 크기는 1MHz, 최대 600초의 편광 시간 및 최대 100mW의 전력입니다. 모든 주파수 범위는 새로운 기판에 대해서만 조사됩니다. 그러나 13C-피루브산에 대한 이전 경험을 바탕으로 최적의 주파수는 약 94.127GHz가 될 것으로 예상됩니다. 따라서 94.117GHz에서 94.137GHz 사이의 스캔 범위(1MHz의 스텝 크기와 50mW의 전력을 가진 300초의 샘플링 시간)가 일반적으로 사용됩니다.
그림 3의 왼쪽 기둥은 [1-13 C] pyruvic aci...

우리는 빠른 필드 사이클 이완을 사용하여 동적 핵 편광에 의해 과분극 13C 농축 화합물의 스핀 격자 이완 시간의 자기장 의존성을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 구체적으로, 우리는[1-13C] pyruvate로 이것을 입증했습니다, 그러나 프로토콜은 그밖 과극화한 기판으로 확장될 수 있었습니다.

과분극[1-13C] 피루바테의 스핀 격자 이완 자기장 의존도 측정

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

우리는 서로 다른 자기장을 통과할 때 과극기 익스플로이징 장비에서 MRI 스캐너로 운반하는 동안 과극형 용액의 편광 손실을 추정하고자 합니다. 우리의 기술은 높은 정확도로 낮은 자기장에서 과극화 솔루션의 스핀 격자 이완 시간을 추정합니다. 이 방법은 동적 핵 편광에 국한되지 않으며 파라수소 유발 편광을 포함한 다른 편광 방법의 스핀 격자 완화 시간을 추정하는 데 사용할 수 있습니다.이 기술을 수행할 때, 과극화 된 샘플이 교차하거나 모든 기간 동안 제로 필드 영역에 머무르지 않도록하십시오. 1-13C 피루빅 산에 용해된 삼각메틸 라디칼리터 당 15밀리몰로 구성된 생체 내 연구에 널리 사용되는 탄소-13 농축 피루빅 산 용액 1밀리리터를 준비한다. 동적 핵 편광기 소프트웨어 인터페이스에서 재사용 대기 버튼을 클릭하여 가변 온도 인서의 온도를 1.4 켈빈으로 낮춥니다.DNP가 원하는 온도에 도달하면 샘플 컵에 스톡 용액의 10 마이크로리터를 적재하십시오. 포탑 도어를 열고 이 작업을 위해 특별히 설계된 삽입 지팡이를 사용하여 컵을 VTI에 삽입합니다. 지팡이를 빠르게 추출하고 컵이 방출되었는지 확인합니다.그런 다음 포탑 도어를 닫고 VTI의 온도가 1.4 켈빈으로 돌아갈 수 있도록 합니다. 한편, 주식 용액의 과극화를 위한 최적의 무선 주파수를 찾기 위해 DNP를 전자레인지 스윕을 실행할 수 있도록 준비한다. 전자 레인지 스윕의 끝에서 샘플을 복구합니다.그런 다음 시스템을 유휴 상태로 설정하고 최대 편광이 달성되는 최적의 주파수를 기록합니다. 이 최적의 주파수는 최대 편광을 제공하는 편광 주파수로 정의됩니다. 이 주파수는 피루빅 산의 특정 스톡 용액에서 얻은 모든 알리쿼트를 과극화하는 데 사용됩니다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 250 밀리리터의 재고 용해 매체를 준비하고, 모든 금속 이온 오염을 격리하기 위해 리터당 100 밀리그램의 농도로 EDTA를 추가합니다. 또한, 탈이온화물에 용해된 리터 EDTA 당 100밀리그램으로 구성된 500밀리리터의 스톡 클리닝 솔루션을 준비합니다. 이 세척 용액의 약 10 밀리리터는 각 편광 후 DNP의 용해 경로를 청소하는 데 사용됩니다.DNP 메인 윈도우에서 재사용 대기 버튼을 선택하여 1-13C 피루빅 산 시료를 과극화하는 준비를 하여 DNP 장치를 1.4 켈빈으로 냉각시하십시오. 샘플 컵에 준비된 피루빅 산 스톡 용액의 30밀리그램을 계량합니다. 원하는 VTI 온도가

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

용해 동적 핵 분극(DNP)이 제공하는 감도 향상으로 NMR 및 MRI에 의해 실시간으로 대사 과정을 수행할 수 있습니다. 효소 반응 연구를 위해 설계된 전용 용출 DNP 설정의 특성과 성능에 대해 설명합니다.

NMR에 의해 실시간 효소 반응 속도 측정을위한 해산 동적 핵 편광 계측

다중 구획 동적 팬텀은 hyperpolarized magnet resonance agents를 사용하여 대사 연구를 위한 일부 관심 생물학을 시뮬레이션하는 데 사용됩니다.

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전자 상자성 공명 영상을 이용하여 다공성 미디어에서 고객 분자의 확산의 제자리 모니터링에

후속 샘플 용해를 통한 동적 핵 분극은 생물학적 시스템의 신진대사에 대한 실시간 연구를 가능하게 했습니다. 과분극[1-13C]피루브산은 in vitro에서 전립선 암종 세포주에서 젖산 탈수소효소 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.

과분극 (13) C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

우리는 연속 관류 모드에서 과분극된 13C표지 대사산물을 분리된 관류된 마우스 심장에 투여하기 위한 실험 설정을 설명합니다. 전용 13C-NMR 획득 접근법을 통해 대사 효소 활성을 실시간으로 정량화할 수 있었고, 다중모수 31P-NMR 분석을 통해 조직 ATP 함량 및 pH를 측정할 수 있었습니다.

과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사

이 프로토콜은 맞춤형 생물반응기 시스템을 과분극 ¹³C NMR 분광법과 통합하여 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사를 측정함으로써 대사 연구 및 약물 스크리닝 응용 분야의 재현성과 운동 정확도를 개선합니다.

과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

절차는 지방과 미세한 자기 공명 elastography (μMRE)를 사용하여 기계적 성질의 비침 투 현지 심사를 통해 osteogenic 조직 공학 구조의 공학 결과를 모니터링하기위한 자기 공명 elastography의 방법론을 보여줍니다.

조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

배우세요 과분극 [1-13C]피루바테의 스핀 격자 이완 시간을 저자기장에서 정확하게 측정하는 방법을. 고속 자기장 순환 이완 측정법을 사용하여 MRI 스캐너로 운송 중 극화 손실을 추정합니다.

과분극^[1-13C] 피루바테의 스핀 격자 이완 자기장 의존도 측정

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