쥐에서 외상성 뇌 손상 후 Caecum Microbiota에서 변경 을 조사
2019년 9월 19일
여기에 제시된 프로토콜은 직감 미생물군유전체 분석을 위한 케이쿰 함량의 수집에 이어 측면 유체 타악기 장치를 사용하여 확산 외상성 뇌 손상을 유도하는 프로토콜이다.
동시성 및 두뇌와 창 자 microbiota 사이 라인 상호 작용은 알 수 없는 남아. 이 기술을 사용, 마우스에 외상성 뇌 손상 후 창 자 microbiota에 변경 검사할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 효율적이라는 것입니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 웬동 유 (Wendong You)가 될 것입니다. 외상성 뇌 손상 유도의 경우 마취 된 마우스의 발가락 핀치에 대한 반응부족을 확인하고 동물의 눈에 연고를 적용하십시오. 면도 후, 적혈구평면에서 두피를 절개하기 전에 노출된 두피 피부를 70%에탄올로 소독합니다.
집게를 사용하여 양쪽의 절개를 철회하고 periosteum을 약간 분리합니다. 마커를 사용하여 중간선에서 2밀리미터 떨어진 두개골의 오른쪽 정수리 영역에 3mm 직경원을 그립니다. 전기 드릴을 사용하여 두라를 손상시키지 않고 조심스럽게 두개골을 관통하십시오.
뼈 플랩을 제거하여 3mm 의 뼈 창을 노출하고 두개 부호 에 플라스틱 부상 캐뉼라를 놓습니다. 치과 아크릴로 두개골에 캐뉼라를 시멘트 한 후, 5 밀리리터 주사기를 사용하여 캐뉼라를 멸균 0.9% 정상 식염수로 채우고 거품을 피하십시오. 오실로스코프와 앰프를 켭니다.
측면 유체 타악기 손상 장치의 고압 튜브가 기포가 없는지 확인하고 장치가 일정한 신호를 제공할 때까지 약 10개의 테스트 펄스를 전달합니다. 진자 시작 위치의 각도를 조정하여 약 2개의 표준 대기의 펄스 강도에 도달하고 부상 캐뉼라를 측면 유체 타악기 손상 장치에 연결합니다. 방아쇠를 당겨 진자 해제, 뇌 손상을 유도.
그런 다음 닫혀 있는 유체 로 채워진 튜브 시스템 전체를 통해 펄스를 두라로 전송합니다. 뇌 손상 유도 후, 캐뉼라를 제거하고 절개를 봉합합니다. 그런 다음 마우스를 외래가 될 때까지 모니터링하는 가열 패드에 마우스를 놓고 음식과 물에 대한 광고 리비도 액세스 할 수있는 가정용 케이지로 동물을 반환하십시오.
표시된 실험 시점에서 표준 프로토콜에 따라 내장을 노출하고 외상성 집게를 사용하여 다른 장과 caecum을 부드럽게 분리합니다. 조직이 발견되면, 날카로운 가위로 케이쿰을 자르고 수동으로 캐컴 함량을 멸균 드레싱에 추출하십시오. 그런 다음 미생물군유전체 분석전까지 영하 80도 저장을 위해 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 내용을 전송한다.
16S 재조합 DNA 염기서열분석은 외상성 뇌 손상 후 3일 후 마우스에서 케이쿰 미생물의 다양성 감소를 나타내며, 수치에 나타난 가짜 및 외상성 뇌 손상 그룹의 케이쿰 함량 내에서 가장 풍부한 taxa가 있다. 또한, 비메트릭, 다차원 스케일링은 외상성 뇌 손상 후 카이쿰 미생물의 조성에 변화를 나타낸다. 두개골을 드릴링 할 때 dura를 그대로 유지하고 다른 장과 caecum을 찾고 분리 할 때 부드럽게해야합니다.
이 절차에 따라, 헤마톡시린과 에오신 염색 및 분석은 외상성 뇌 손상 후 장내 조직학적 변화 및 염증 반응을 검사하기 위해 수행될 수 있다.
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개요
본 연구는 마우스에서 측면 유체 충격 장치를 사용하여 확산성 외상성 뇌손상(TBI)을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 손상 후, 분석을 위해 맹장 내용을 수집하여 장내 미생물군의 변화를 조사합니다. 이 접근 방식은 뇌 손상과 장내 미생물군 조성 사이의 상호작용을 규명하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 마이크로바이옴 분석
- 외상성 뇌 손상 연구
배경
- 뇌와 장내 미생물군집 간의 관계를 이해하는 것은 TBI 연구에서 매우 중요합니다.
- TBI가 장내 미생물군집에 어떤 영향을 미치는지에 대한 현재의 지식은 제한적입니다.
- 모델 생물로 생쥐를 사용하면 제어된 실험 조건을 설정할 수 있습니다.
연구 목적
- TBI를 유도하고 이후 장내 마이크로바이옴의 변화를 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발한다.
- 신경계 손상과 장내 미생물 군집 다양성 사이의 잠재적 상관관계를 조사한다.
- TBI가 전신 건강 및 마이크로바이옴 상호작용에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공한다.
사용된 방법
- 마취된 마우스의 TBI를 유도하기 위해 측면 유체 충격 장치를 사용하였습니다.
- 두개골 천공 및 캐뉼라 삽입을 포함한 정밀한 수술 절차를 수행하였습니다.
- 손상 후, 마이크로바이옴 분석을 위해 맹장 내용을 수집하여 적절하게 보관하였습니다.
- 미생물군의 다양성과 구성 변화를 확인하기 위해 16S rDNA 시퀀싱을 이용하였습니다.
주요 결과
- 분석 결과, TBI 후 3일 이내에 맹장 미생물군의 다양성이 감소한 것으로 나타났습니다.
- 비계량적 다차원 척도법(Non-metric multidimensional scaling)을 통해 손상 후 미생물군 조성에 유의미한 변화가 있음이 입증되었습니다.
- 본 연구는 조직 취급 시 주의와 멸균 상태 유지의 필요성을 강조합니다.
결론
- 본 연구는 TBI 상황에서 장-뇌 축을 탐구하기 위한 방법론을 정립합니다.
- 연구 결과는 TBI가 장내 미생물군집을 교란할 수 있으며, 이것이 회복에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다.
- 장-뇌 상호작용에 관한 지식의 확장은 향후 TBI 치료 전략 수립에 기여할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 부상 후 마이크로바이옴 변화를 평가할 수 있는 재현 가능한 모델을 제공함으로써, 외상성 뇌 손상 연구에서 마이크로바이옴-장-뇌 축의 기전적 리스크 제거(de-risking)를 가능하게 합니다. 이는 신경학적 외상과 맹장 마이크로바이옴 구성의 정량적 변화를 연결하여 표적 검증 및 바이오마커 발굴을 지원합니다. 또한, TBI 유도 및 마이크로바이옴 샘플링 워크플로우를 표준화함으로써 전임상 연구의 예측 신뢰도를 높입니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 통제된 TBI 유도 후 미생물군집 다양성 변화를 측정함으로써 장-뇌 축 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 실험군 전체에서 일관된 맹장 미생물군집 수집을 위해 표준화된 수술 및 샘플링 절차를 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 맹장 샘플의 미생물 조성 변화를 프로파일링하기 위해 정량적인 16S rDNA 시퀀싱 결과물을 생성합니다.
- 운영적 가치: 장 타겟 치료제 스크리닝 파이프라인에 통합될 수 있는 재현 가능한 마이크로바이옴 분석 워크플로우를 구축합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 마우스 모델에서 TBI 중증도와 마이크로바이옴 변화 사이의 상관관계를 분석하여 질병 관련 시스템 모델링을 지원합니다.
- 운영적 가치: 미생물군집 변화의 종단적 추적을 가능하게 하여 전임상 프로그램에서 위험 조정 기반의 추진 의사결정에 정보를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 TBI 유도 및 장내 마이크로바이옴 분석을 표준화하여 타겟 리스크를 완화함으로써, 발견 생물학(discovery biology)과 전임상 검증 사이의 가교 역할을 합니다.
- 발견 생물학: 조절된 손상 및 마이크로바이옴 프로파일링을 통해 마이크로바이오타-장-뇌 상호작용에 대한 가설 검증을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 후속 16S 시퀀싱 및 다양성 분석에 적합한 표준화된 맹장 마이크로바이오타 샘플을 제공합니다.
- 분석: 비계량 다차원 척도법(non-metric multidimensional scaling) 및 다양성 지표를 통해 미생물 조성의 정량적 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 전임상 연속성을 위해 신경학적 손상 모델을 마이크로바이옴 바이오마커와 연결합니다.
- 기업적 재사용: 신경계 질환 모델에서 장-뇌 축 조절을 연구하기 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: TBI 후 정량화 가능한 미생물군집 리드아웃을 제공함으로써 장-뇌 축 연구의 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 수술, 샘플링 및 시퀀싱 프로토콜을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: TBI 모델을 마이크로바이옴 기반 바이오마커 시그니처와 연결하여 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: TBI 회복 과정에서 장-뇌 상호작용을 표적으로 하는 화합물의 리스크 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
구현 고려 사항
- 마우스 수술 절차 및 무균 조직 취급에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 측면 유체 충격 손상 장치 및 16S rDNA 시퀀싱 인프라의 이용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 신경과학 및 마이크로바이옴 분석 팀 간의 교차 표준화가 필요합니다.
- 다양한 마우스 계통 또는 손상 모델에 따른 맹장 샘플링 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 오염 방지를 위해 장 조직 박리 과정 중 무균 기술의 적용이 필수적이며 이에 따른 제한이 있습니다.
