Name: 투과 형 Nomarski 타입 차동 간섭 콘트라스트 현미경을 사용 하 여 플라스 몬 Ic 나노 입자에 대 한 분광학 수행 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 DIC 현미경을 활용한 플라스몬 금 나노입자 단일 입자 분광학 방법입니다. 고해상도 측면 분해능과 얕은 피사계 심도로 복잡한 환경에서 나노입자를 정밀 관찰할 수 있습니다.

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앤서니 s. 스텐 더 박사는 오하이오 대학에서 나노 규모 및 양자 현상 연구소 (NQPI)를 통해 기술 지원을 인정 하고자 합니다. 이 문서는 오하이오 대학에 의해 박사 Stender에 제공 하는 시작 자금을 통해 가능 했다.

1. 표준 유리 현미경 슬라이드로 샘플 준비
<ol><li>샘플 증 착을 위한 유리 현미경 슬라이드를 준비 합니다. 참고: 어떤 경우에는 에탄올 대신 초순 수에 유리를 저장 하는 것이 더 적절할 수 있다. 그러나 물 이나 공기에 저장 하는 것은 시간이 지남에 따라 유리의 소수 성을 만든다.<ol>
<li>최상의 결과를 위해 유리 또는 석 영 현미경 슬라이드와 커버 유리를 구입 하십시오.</li>
		<li>스크라이브 펜을 사용 하 여 각 유리 커버 슬립의 중앙에 얕 고 짧은 스크래치 마크를 놓습니다.</li>
		<li>"사전 세척"을 구입 하더라도 모든 현미경 유리를 세척 하 여 유리 파편, 먼지, 분말, 유기 잔류물 및 이미징 품질 또는 시료 침착에 영향을 주는 기타 이물질을 제거 합니다. 참고:이 청소 방법은 아래에 설명 된 샘플 유형에 적합 하며 독한 화학 물질의 사용을 피합니다. 가혹한 화학 물질은 유리를 에칭 하 고 취급 및 폐기에 더 많은 주의를 기울여야 합니다.<ol>
<li>저장 선반에 현미경 유리를 넣고 비 커 또는 염색 항아리에 넣습니다. 현미경 유리의 각 조각 및 표면은 세제에 완전히 노출 되어야 하기 때문에, 비 커와 다른 실험실 유리의 바닥에 현미경 유리를 두지 마십시오.</li>
			<li>용기에 액체 세제 (재료 표) 1 mL를 붓고 물과 함께 용기에 넣습니다. 30 분 동안 초음파 처리 하십시오. 참고: 청소 프로세스가 시작 되 면, 유리에 지문 잔여물을 남기지 않도록 장갑을 끼고 유리를 다루십시오.</li>
			<li>세척 용기의 액체 내용물을 싱크대에 부 어 넣습니다. 초순 수로 용기를 여러 번 헹 구 어 세제의 모든 외관을 제거 합니다. 용기를 초순 수로 리필 하십시오. 다른 30 분간 현미경 유리를 사용 하 여 용기를 초음파 처리 하십시오.</li>
			<li>이전 단계를 한 번 이상 반복 합니다. 세제의 모든 흔적이 제거 되었다는 것이 명백 할 때까지 물에서 초음파 처리를 추가로 수행 하십시오.</li>
			<li>청소 용기의 내용물을 부 어 주세요. 초순 수로 용기를 헹 굽 니다. 용기를 에탄올로 리필 하십시오. 30 분 동안 초음파 현미경 유리.</li>
			<li>청소 용기의 내용물을 폐기 용기에 부 어 넣습니다. 에탄올로 리필 하십시오. 증발을 통해 에탄올의 손실을 방지 하기 위해 용기를 덮으 십시오. 실험 시간까지 현미경 유리를이 용기에 보관 하십시오. 슬라이드는 덮여 있는 용기 안에 에탄올에 잠긴 상태로 유지 되는 한 깨끗 하 고 사용할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나노 입자 용액의 제조
	<ol>
<li>마이크로 피 펫을 사용 하 여, 원래 저장 용기에서 0.05 밀리 그램/mL 금 나노 입자 용액의 100 µ L를 제거 하 고 용액을 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 꺼냅니다.</li>
		<li>6000 x g에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리기.</li>
		<li>과잉 계면 활성 제를 제거 하기 위해 마이크로 피 펫으로 상층 액을 제거 합니다.</li>
		<li>마이크로 피 펫을 사용 하 여 초순 수 100 µ L을 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 참고: 첫 번째 시도에서 모든 상층 액을 제거 할 수 없다면 원심 분리 및 소생 단계를 반복 하십시오.</li>
		<li>샘플을 간략하게 소용돌이 시켜 펠 렛을 소생 시켰다. 20 분 동안 즉시 초음파 처리 하 여 완전히 소생 하 고 나노 입자 응집 체를 분해 합니다. 참고: 샘플이 즉시 사용 되지 않으면 현미경 유리에 용액을 증 착 하기 전에 20 분 동안 다시 초음파 처리 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시료 침착
	<ol>
<li>보관 용기에서 세척 된 커버 미 끄 러 짐과 현미경 슬라이드를 제거 합니다. 가압 된 질소 또는 아르곤으로 유리를 불어 말립니다.</li>
		<li>마이크로 피 펫을 사용 하 여 1.2.5 단계부터 커버 슬립에 이르는 나노 입자 용액을 6 µ L 떨어 트로 캐스트 합니다. 방울을 고르게 분산 시키기 위해 두 번째 커버 슬립 또는 현미경 슬라이드와 같이 커버 슬립 상단에 두 번째로 큰 현미경 유리를 조심 스럽게 놓습니다. 유리 두 조각 사이에 기포가 갇 히 지 않도록 하십시오.<ol>
<li>샘플 기판을 위로 돌려 중간 용액의 증발을 방지 하기 위해 좁은 라인의 네일 폴리쉬로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 합니다.</li>
			<li>또는 샘플 "건식"을 이미지 하려면 원치 않는 유리 조각을 제거 하기 전에 용액이 커버 슬립에서 5 ~ 15 분 동안 방치 되도록 하십시오. 가압 된 질소 또는 아르곤으로 커버 슬립을 부드럽게 말립니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>가능 하다 면 준비 후 즉시 이미지 샘플을 작성 하십시오. 가능 하지 않은 경우, 이미징 될 때까지 페 트리 디쉬와 같은 커버 된 용기에 샘플을 저장 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DIC 이미징
<ol><li>목표 및 콘덴서를 정렬 합니다.<ol>
<li>샘플을 현미경에 배치한 후 샘플을 사용 하 여 초점 평면을 찾으십시오. 먼저 앞에서 만든 스크래치 마크를 찾아 초점을 맞춰야 합니다. 그런 다음 나노 입자가 시야에 올 때까지 초점을 미세 조정 합니다.</li>
		<li>콘덴서의 정확한 배치를 결정 하기 위해 Kohler 조명 방법을 활용 합니다. 높은 배율의 5 콜 러 조명 (80x, 100 배)은 보다 낮은 배율로 kohler 조명을 먼저 설정 하 여 더 쉽게 달성할 것입니다 (예: 20x). 참고: 일반적으로 Kohler 조명은 단일 샘플을 이미징 하는 동안 다시 조정할 필요가 없습니다. 그러나 새로운 현미경 슬라이드로 전환할 때 Kohler 조명이 제대로 설정 되었는지 확인 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대비 설정을 최적화 합니다.<ol>
<li>이미징 샘플 내에서 관심 영역을 선택 합니다. 카메라 시야에서 영역을 중앙에 맞추고 필요에 따라 초점을 조정 합니다.<ol>
<li>현미경은 데 세 나 르 몽 디자인을가지고 있는 경우, 최대 배경 소멸에 가까운 설정 편광자로 시작 하 고 점차 감소 배경 소멸 방향으로 편광자를 회전. 배경 강도가 점차 증가할 것입니다.</li>
			<li>현미경에 드 세 나 르 몽 디자인이 없는 경우, 최대 배경 소멸 시 설정 된 광학 트레인으로 시작 하십시오. 이 경우, 점차적으로 배경 소멸을 줄이기 위해 객관적인 프리즘 위치를 조정 합니다. 주: 나노 입자가 평균 로컬 배경 값에서 가장 큰 강도 차이 (예: 대조)에 도달 하면 이상적인 설정이 달성 됩니다. 혈장 나노 입자의 경우, 최적의 콘트라스트는 일반적으로 최대 배경 소멸 근처의 설정에 따라서, 상대적으로 어두운 배경으로 달성 된다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플을 이미지 합니다.<ol>
<li>실내 조명을 꺼서 이탈 조명이 프로세스와 상호 작용 하지 않도록 합니다.</li>
		<li>과학적 이미징 카메라로 나노 입자를 보는 동안 최적의 배경 수준을 결정 합니다. 주요 LSPR 파장에 위치 하는 중앙 파장의 최대 절반 (FWHM) 대역 통과 필터에서 10 nm의 전체 폭을 사용 하 여 관심 영역을 봅니다. 배경 레벨이 카메라 최대 용량 레벨의 15%-40% 범위에 있을 때까지 램프 강도 또는 노출 시간을 조정 하 고, 관심 영역 내의 어떤 객체도 카메라의 최대 강도 레벨의 90%를 초과 하는 신호 강도를 나타냅니다. 참고: 단계 2.3.2의 목표는 필터 사이를 전환할 때 센서 포화를 방지 하는 것입니다. 이상적인 배경 레벨은 샘플과 카메라에 따라 달라 집니다. 이 단계가 완료 되 면 노출 시간을 조정할 수 있지만 램프 강도는 조정 되지 않습니다.</li>
		<li>각각 10 nm의 FWHM을 가지 며 전체 파장 범위에 걸쳐 이미징을 가능 하 게 하는 일련의 대역 통과 필터를 사용 하 여 샘플을 이미지 합니다. 노출 시간을 조정 하 여 배경 강도가 이미지에서 이미지 (최대 5% 이내)와 일관 되 게 유지 되도록 합니다. 필터를 전환한 후 이미지 캡처 전에 샘플을 다시 초점을 맞춰야 합니다.</li>
		<li>모든 정보를 보존 하기 위해 이미지를 압축 되지 않은 TIFF 파일 및/또는 소프트웨어의 기본 파일 형식으로 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플을 회전 합니다.<ol>
<li>원래 위치에서 샘플의 이미지를 수집한 후, 샘플은 이제 라이트 경로의 추가 방향으로 회전 및 이미징 할 수 있습니다. 180 ° 또는 360 ° 범위에서 일정 한 간격 (예: 10 ° 또는 15도)으로 회전을 수행 합니다. 주: 회전에는 회전식 샘플 스테이지가 필요 합니다.</li>
		<li>2.1-2.3 섹션에서와 같이 카메라 설정을 조정 하 여 이미지 간에 일관 된 배경 수준을 제공 합니다. 참고: Kohler 조명에는 조정이 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ImageJ를 사용 하 여 데이터 분석
참고: 다음 계산은 다양 한 소프트웨어 패키지에서 수행 될 수 있으며 때로는 이미지를 수집 하는 데 사용 되는 기본 프로그램에서 수행할 수도 있습니다. ImageJ는 건강의 국립 연구소에서 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어입니다 (NIH).
<ol><li>입자 대비 또는 강도를 계산 합니다.<ol>
<li>ImageJ와 이미지를 엽니다.</li>
		<li>[ 사각형 ] 도구를 선택 하 고 관심 있는 주요 영역 주위에 사각형을 그립니다.</li>
		<li>도구 모음에서 이미지, 확대/축소, 선택 항목을차례로 선택 합니다. 이미징 창이 선택 영역을 확대 합니다.</li>
		<li>도구 모음에서 이미지, 조정, 밝기/대비를 차례로 선택 합니다. 새 창이 나타납니다. 샘플 영역을 더 잘 볼 수 있도록 하려면 최소, 최대, 명도 및 대비의 네 가지 설정을 조정 합니다. 이러한 조정은 과학적 데이터를 변경 하지 않으며, 단지 샘플 영역에 대 한 더 나은 가시성을 가능 하 게 합니다. 참고: 단계 3.1.3 및 3.1.4는 역순으로 여러 번 수행 될 수 있습니다.</li>
		<li>사각형 도구를 다시 사용 하 여 측정할 첫 번째 나노 입자 주위에 상자를 그립니다. 상자는 나노 입자의 통풍이 잘되는 디스크 보다 약간 더 커야 합니다.</li>
		<li>도구 모음에서 분석, 측정을 차례로 선택 합니다. 선택한 상자 안에 있는 픽셀의 최소, 최대 및 평균 강도를 보고 하는 새 창이 나타납니다.</li>
		<li>나노 입자를 측정 하는 데 사용 되는 상자를 입자에 바로 인접 한 영역으로 드래그 하면 배경 대비가 상대적으로 균일 하 고 입자 또는 오염 물질이 존재 하지 않습니다. 상자의 원래 크기를 유지 합니다.</li>
		<li>측정 도구를 사용 하 여 배경 영역의 평균 강도를 결정 합니다.</li>
		<li>나머지 입자와 인접 한 배경 영역을 각각 측정 합니다.</li>
		<li>시리즈의 모든 이미지에서 각 파티클에 대해이 프로세스를 반복 합니다.</li>
		<li>데이터를 스프레드시트로 내보내 모든 파장 및 각도에서 각 입자의 명암 또는 강도를 계산 합니다.</li>
		<li>다음 식13,14,15를 사용 하 여 각 입자의 대비를 계산 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg"> 참고:이 방정식을 사용 하 여 입자 대비는 항상 0 &gt; 해야 합니다.</li>
		<li>측정 된 최대 입자 강도를 배경 평균으로 나누어 입자의 배경 조정 최대값을 계산 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
</li>
		<li>마찬가지로, 측정 된 최소 입자 강도를 배경 평균으로 나누어 배경 조정 최소값을 계산 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg"> 참고: 계산 된 대로 최대값은 1 보다 큰 값을 가져야 하 고 최소값은 1 보다 작을 것입니다. 평균 배경이 본질적으로 0이 고 최대값은 양수 값으로 표시 되 고 최소값은 음수 값16이 할당 되도록 각 값을 "1"로 빼서 사용할 수 있습니다. 후자의 접근법을 사용 하면 분석가가 각각의 편광 필드를 따라 발생 하는 것을 개별적으로 고려할 수 있으며이는 이방성 입자를 연구할 때 유용 합니다.</li>
		<li>주어진 나노 입자 위치에서 스펙트럼 프로 파일을 그래프로 작성 하려면 x 축을 따라 파장이 있는 데이터와 y 축을 따라 명암 또는 강도를 플로팅합니다.</li>
		<li>지정 된 파장에서 회전 프로 파일을 그래프로 작성 하려면 x 축을 따라 회전 각도를 플로팅하 고 y 축을 따라 대비 또는 강도를 플로팅합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPluta%2C+M+%22Advanced+Light+Microscopy%22">Advanced Light Microscopy</a>. 2, Elsevier. 146-197 (1989).</li>
<li>Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Gold+Nanorod+Geometry+on+Optical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response.</a> ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).</li>
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</ol>

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DIC 현미경으로 이미징 하는 경우 데이터를 수집 하기 전에 광학 부품을 최적화 하는 것이 중요 합니다. 실험 중간에 편광자를 약간만 조정 해도 최종 데이터6에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 다른 재료는 다른 편광자 설정이 필요 합니다. 편광 각도의 효과를 보여주기 위해 여기에 큰 스텝 사이즈를 활용 하였으나, 실제 실험에서는 최적의 콘트라스트 설정의 1 °-2 ° 내에서 편광자 설정을 최적화 하는 것이 필수적입니다. 편광판 설정은 추후 참조용으로도 기록해 야 합니다. 또한 항상 교차 편광자 (0 °) 점의 동일한 쪽에서 작업 하는 것이 좋습니다. 앞뒤로 전환 하는 것은 어떤 장점을 제공 하지 않습니다, 하지만 그것은 그림자 패턴의 반전으로 인해 혼란을 초래할 수 있습니다.
다음으로, 분광학을 수행할 때 배경 강도를 모니터링 하는 것이 중요 합니다. 이는 카메라 노출 시간을 조정 하거나 라이트 경로에 중립 밀도 필터를 추가 하 여...

1980 년대 이후, 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경은 주로 생물학적 과학 내에서 마이크로 스케일 개체를 위해 예약 된 중요 한 이미징 방법으로 간주 되었습니다. 그러나, 1950 년대와 1960 년대에 개발 하는 동안, 그것은 재료 과학1의 기술로 서 의도 되었다. 최근에는 플라스 몬 나노 입자와 관련 된 재료 과학의 발전과 함께 광학 현미경으로 재료의 특성화에 대 한 관심이 증가 했습니다.
많은 광학 기술은 나노 물질 특성화 (예: 어두운 분야, 명시 야, 편광, 형광 등)에 확실히 사용할 수 있습니다. 다크 필드는 나노 입자 연구에서 널리 사용 되지만 분산의 수집에만 의존 하 고 복잡 한 샘플2에 대 한 제한 된 정보를 제공 합니다. 형광은 유용할 수 있으 나 적절 하 게 염색 될 수 있는 샘플에만 사용 됩니다. DIC 현미경 검사 법은 나노 입자 분석을 위한 유용한 도구를 만드는 몇 가지 특성을가지고 있습니다. 다른 방법에 비해 및 플라즈마 나노 입자에 관해서 DIC의 가장 자주 언급 한 장점은: 아니 샘플 얼룩이 필요, 아무 후광 효과, 필드의 얕은 깊이 및 높은 측면 해상도3. DIC는 플라스 몬 나노 입자 연구에 가치 있는 추가 강점을가지고 있습니다. 우선, 두 개의 내재적 및 직교 분극 필드가 존재 하며 분 광 목적2에 대해 동시에 측정 할 수 있습니다. 둘째로, 나노 입자의 탈 편광 신호는 최종 이미지2에서 포착 되지 않으며,이는 어두운 분야 분광학 측정에서 심각한 우려를 유발할 수 있다.
이 기사의 목적은 투과-빛 Nomarski DIC 현미경 검사 법을 활용 하 여 플라스 몬 나노 입자에 대 한 분광학을 수행 하는 명확한 방법론을 제공 하는 것입니다. DIC는 매우 다양 한 물질에 적용 될 수 있는 강력한 기술 이지만, 나노 입자를 이미징 할 때 적절 하 게 작동 하는 데 큰 기술과 이해가 필요한 기술 이기도 합니다. 전송 기반의 Nomarski DIC 현미경 검사 법은 단지 여기에 간략하게 검토 할 복잡 한 빛 경로1 이 있습니다. 그림 1에서 DIC의 광 기차가 표시 됩니다. 광은 먼저 편광자를 통과 하 여 현미경을 투과 하 고 노 마 르 스키 프리즘을 투과 시켜 샘플 평면 상에 응축 기에 의해 초점을 맞추고 있다. 목표를 통과 한 후 빛은 검출기로 나가기 전에 Nomarski 프리즘과 분석기를 결합 하 여 빔을 발견 합니다. 두 개의 편광판과 Nomarski 프리즘은 DIC 이미지의 형성에 중요 하며 DIC의 두 직교 편광 필드 1을 생산 하는일을 담당 합니다. Nomarski DIC 현미경의 작동 원리 및 광학적 인 경로에 대 한 더 많은 것을 알고에 관심이 있는 독자를 위해, 또는 Nomarski DIC 및 DIC의 다른 스타일의 차이,이 주제에 대 한 다른 잘 작성 된 계정을 참조 하십시오1, 4 , 5 , 6 , 7.
그것은 Nomarski DIC, 어두운 필드, 또는 다른 현미경 기술을 가진 여부, 그들에 분광학을 수행 하기 전에 플라스 모나 시 나노 입자의 기본 특성을 이해 하는 것이 동등 하 게 중요 하다. 플라즈마의 분야에서, 나노 입자는 10-100 nm의 규모에 크기의 미 립 자로 정의 됩니다8,9. 나노 입자는 다양 한 모양 (예: 구, 막대, 별, 덤 벨 등)에 걸릴 수 있으며 대부분의 중요 한 특성은 전자기 스펙트럼의 자외선 가시 근 적외선 범위에서 빛과의 상호 작용에서 발생 합니다. 용어 "플라스 몬"은 나노 입자10에 한정 되지 않고; 그러나, 나노 입자를 논의 할 때, 국 소 표면 플 라 즈 몬 공명 (LSPR)을 참조 하 여 사용 된다. LSPR은 나노 입자의 전도 전자가 매우 특이 하 고 상대적으로 좁은 주파수 대역의 전자기 복사와의 쿨롱 상호 작용으로 인해 진동 하는 현상이 며8. 이 같은 주파수에서, 플라스 모나 닉 나노 입자는 빛의 증가 된 흡수 및 산란을 나타내며, 광학 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. 많은 경우에는, 콘덴서2보다는 대역 통과 필터를 배치 하면서 나노 입자를 관찰 하 고, 이미징 콘트라스트를 개선 하 고, lspr 효과를 유도 하지 못하는 빛을 제거 하는 것이 바람직하다. 또한 필터를 사용 하면 단일 입자 분 광 법 실험을 수행할 수 있습니다.
LSPR 관련 광학 거동은 나노 입자의 크기 및 형상에 크게 의존 하며, 많은 광학 현미경 기술로 조사 될 수 있다. 그러나, 이방성 (즉, 비 구형) 형상의 플라스 몬 계 나노 입자의 배 향 정보를 해독 하기 위해서는 광 필드의 편광을 활용 하는 것이 필요 하다. 편광 필드 또는 샘플 기판을 조금씩 조금씩 회전 시 킴으로써, 개별 나노 입자의 배 향 의존적 분 광 특성을 감시할 수 있다. 회전 및 분극은 또한 스펙트럼 기능이 나노 입자의 표면 전자의 디 폴라 또는 더 높은 순서의 발진으로 인 한 것인지 여부를 결정 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 등방성 (즉, 구형) 나노 입자의 경우, 스펙트럼 프로 파일은 편광 하에서 샘플을 회전할 때 본질적으로 변하지 않습니다.
DIC 현미경을 통해 볼 때 (그림 2), 나노 입자는 회색 배경에 대 한 그림자 캐스트 흰색과 검은색 모양으로 통풍 디스크. 구형 나노 입자는 회전 및 대역 통과 필터의 변화와 함께 이러한 외관을 유지 합니다; 그러나 필터의 중앙 파장이 구의 유일한 배위 lspr 파장 (11)에서 더 분리 되는 것 처럼 입자가 점차 시야에서 사라질 것입니다. 나노로 ds의 외형은 회전 된2로 매우 극적으로 변할 수 있습니다. 나노로 ds에는 나노로의 물리적 치수를 기반으로 하는 두 개의 lspr 밴드 (배위 동작)가 있습니다. 나노 od의 종 축이 DIC 편광 필드 중 하 나와 평행 하 게 배 향 되 면, 바람이 잘 통하는 디스크는 LSPR 파장에 연결 된 대역 통과 필터로 볼 경우 모든 흰색 또는 모두 검은색으로 표시 됩니다. 샘플을 90 ° 회전 한 후에는 반대 색을 취할 것입니다. 대안적으로, 나노 od의 횡 축이 종 축에 수직인 것 이기 때문에, 로드는 두 축의 LSPR 파장에 일치 하는 필터 들 사이를 전환할 때 반대 색을 취할 것 이다. 다른 방향 및 필터 설정에서 나노 로드는 구형 처럼 보일 것 이며 다양 한 섀도우 캐스트 에어리 디스크 패턴을 제시 합니다. 가로 축 &lt; 25nm의 나노로 ds의 경우 DIC 현미경을 사용 하 여 LSPR의 파장에서 신호를 감지 하는 것이 어려울 수 있습니다.
단일 입자 분 광 법을 수행 하려면 올바른 광학 구성 요소를 사용 하 고 올바르게 정렬 하는 것이 중요 합니다. DIC 현미경을 사용할 수 있는 대물 렌즈를 사용 해야 합니다. 단일 입자 실험의 경우 80 x 또는 100 배 오일 목표가 이상적입니다. Nomarski DIC 프리즘은 일반적으로 세 가지 종류로 제공: 표준, 고대비, 높은 해상도. 이상적인 유형은 실험의 목적과 나노 입자의 크기에 따라 크게 달라 집니다. 표준 프리즘 많은 실험에 대 한 괜 찮 아 요; 그러나 작은 나노 입자 (&lt; 50 nm)로 작업 할 때 입자가 크기11에서 감소 함에 따라 입자 대비가 감소 하므로 고대비 프리즘이 유리할 수 있습니다. DIC 콘트라스트 조정은 현미경 브랜드 또는 모델6에 따라 편광자를 회전 시키거나 dic 프리즘 중 하나를 번역 하 여 달성할 수도 있습니다.
Kohler 조명 및 편광자 설정을 설정한 후에는 분광학 데이터를 수집 하는 동안 이러한 설정을 재조정 하지 않는 것이 중요 합니다. 또한 필터와 각도 설정 사이를 전환 하는 경우에도 데이터를 수집 하는 동안 일정 한 평균 배경 신호가 항상 유지 되어야 합니다. 실제 이상적인 배경 값은 과학적 카메라의 동적 범위에 따라 다르지만 일반적으로 배경은 카메라의 최대 감지 레벨의 15%-40% 범위에 있어야 합니다. 이를 통해 최적의 입자 대비를 가능 하 게 하는 동시에 카메라 센서가 포화 될 가능성을 줄일 수 있습니다. 분광학 데이터를 수집 하기 위해서는 컬러 카메라가 아닌 흑백으로 이미지를 캡처하는 과학적 카메라로 작업 해야 합니다.
시료 전처리는 이미징 플라스틱 나노 입자의 또 다른 중요 한 측면입니다. DIC 현미경의 운영자는 샘플의 광학적 특성과 샘플의 기질에 대 한 이해가 필수적입니다. "사전 세척 된" 현미경 유리는 이미징 나노 입자를 충분히 준비 하지 않으며 샘플 증 착 전에 적절 하 게 재 세척 하 여 시료의 탁 트인 관찰을 보장 해야 합니다. 현미경 슬라이드에 대 한 많은 세척 프로토콜은 이전에 문서화 된12, 하지만 그것은 일반적으로 실험 연구에서 보고 하는 단계.
마지막으로, 데이터 분석 방법은 단일 입자 분 광 법의 최종 구성 요소입니다. 각 나노 입자의 최대 및 최소 강도는 현지 배경 평균 뿐만 아니라 측정 되어야 합니다. 관심 입자는 배경 이물질, 기판 결함 또는 고르지 않은 조명이 없는 영역에 위치 해야 합니다. 나노 입자의 스펙트럼 프로 파일을 결정 하는 한 가지 방법은 각 파장에서 입자 대비를 계산 하는 것으로 서,도13,도15이하의 수학식을 사용 하 여:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg">
또는, 단일 입자의 스펙트럼을 개별 최대 및 최소 신호 구성 요소로 분할할 수 있으며,이는 DIC의 두 편광 필드를 나타내며 동시에 수집 된 두 개의 방향 의존적 스펙트럼을 표시 합니다. 두 방정식을 통해:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg">

<table><tbody><tr><td>콘트라드 70</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>1002</td><td>현미경 유리 청소용, 많은 화학 공급업체를 통해 사용 가능</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A962-4</td><td>현미경 유리</td></tr><tr><td>유리 현미경 커버 슬립 세척 및 보관용 유리 현미경 커버 슬립</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Ted Pella</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>골드 나노로드</td><td>Nanopartz</td><td>DIAM-SPR-25-650</td><td></td></tr><tr><td>금 나노 구체 (80 nm)</td> <td>시그마 Aldrich</td><td>742023-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N / A</td><td>무료 소프트웨어 사용 NIJ</td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>니콘 Ti-E 현미경</td><td>니콘</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>질소 가스</td><td>에어 가스</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>오르카 플래시 4.0 V2 + 디지털 sCMOS 카메라</td><td>하마마츠</td><td>77054098</td><td></td></tr><tr><td>스크라이빙 펜</td><td>아마존</td><td>N/A</td><td>온라인에서 $10 미만으로 사용할 수 있는 다양한 옵션. 고가의 버전을 구입할 필요가 없습니다.</td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td><td>18메가옴</td></tr></tbody></table>

투과 형 nomarski 타입 차동 간섭 콘트라스트 현미경을 사용 하 여 플라스 몬 ic 나노 입자에 대 한 분광학 수행

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

차동 간섭 대비 (DIC) 현미경은 가시 범위 조명을 사용 하 여 마이크로 스케일 오브젝트를 이미징 하는 데 가장 일반적으로 사용 되는 강력한 이미징 도구입니다. 이 프로토콜의 목적은 플라스틱 나노 입자 샘플을 제조 하 고 DIC 현미경으로 단일 입자 분 광 법을 수행 하는 입증 된 방법을 상세히 설명 하는 것입니다. 반복 가능한 분 광 실험을 수행 하기 위해서는 몇 가지 중요 한 단계를 신중 하 게 따라야 합니다. 먼저, 랜드마크는 샘플 기판에 에칭 될 수 있으며,이는 실험 중 관심 영역을 추적 하 고 샘플 표면을 찾는데 도움을 준다. 다음으로, 기판은 샘플의 검사를 방해 하거나 모호 하 게 할 수 있는 이물질 및 오염 물질을 적절히 청소 해야 합니다. 샘플이 제대로 준비 되 면, 현미경의 광학 경로는 Kohler 조명을 사용 하 여 정렬 되어야 합니다. 표준 Nomarski 스타일 DIC 현미경, 샘플의 회전 필요할 수 있습니다., 특히 플라스 몬 ic 나노 입자 방향 의존적 광학 특성을 전시 하는 경우. DIC 현미경은 2 개의 내재 된 직교 분극 필드를가지고 있기 때문에 파장 의존적 DIC 대조 패턴은 막대 모양의 플라스 몬 나노 입자의 방향을 드러냅니다. 마지막으로 데이터 수집 및 데이터 분석을 신중 하 게 수행 해야 합니다. DIC 기반 분광학 데이터를 대조 값으로 표현 하는 것이 일반적 이지만, 강도 데이터로 제시 하는 것도 가능 합니다. 단일 입자 분 광 법에 대 한 DIC의이 데모에서는 구형 및 막대 모양의 금 나노 입자에 초점을 맞추고 있습니다.

육안으로 볼 수 있을 만큼 큰 샘플을 사용 하 여 작업 할 때 유리 기판에 랜드마크를 배치 하는 것은 일반적으로 필요 하지 않습니다. 그러나 나노 물질을 사용 하거나 샘플의 회전이 필요한 경우, 랜드마크는 샘플의 방향을 찾고 구별 하 고 추적 하는 쉬운 방법을 제공할 수 있습니다. 유리 기판17에서 랜드마크를 떠나는 데 더 정교한 기술을 활용할 수 있지만, 스크라이브 펜으로 유리를 긁는 것은 많은 상황에서 작동 하는 경제적이 고 간단한 방법입니다. 스크래치 표시는 데이터에 영향을 줄 수 있는 복잡 한 배경을 만들기 때문에 이러한 랜드마크 바로 옆에 있는 샘플 영역을 검사 하는 것을 피하는 것이 중요 합니다 (그림 3). 그러나 스크래치 마크의 끝에서 "거미 웹"은 종종 스크래치에서 바깥쪽으로 확장 됩니다. 이 라인은 랜드마크로 매우 귀중 한, 하지만 다시, 그들은 이러한 결함...

이 프로토콜의 목표는 혈장 나노 입자 샘플의 제조를 위한 입증 된 접근법을 상세히 설명 하 고 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용 하 여 단일 입자 분광학을 수행 하는 것입니다.

투과 형 Nomarski 타입 차동 간섭 콘트라스트 현미경을 사용 하 여 플라스 몬 Ic 나노 입자에 대 한 분광학 수행

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

DIC 현미경 검사는 복잡한 환경에서 이미징 플라스모닉 나노 입자의 암장보다 우수합니다. 그러나 DIC는 재현 가능한 결과를 얻기 위해 더 큰 지식과 기술이 필요합니다. DIC 현미경 검사는 높은 측면 해상도와 얕은 필드 깊이를 모두 제공합니다.이 두 특성은 세포 내 또는 복잡한 환경에서 나노 입자를 모니터링 할 때 매우 중요합니다. 먼저 스크리빙 펜을 사용하여 각 유리 커버슬립의 중앙에 얕고 짧은 스크래치 표시를 배치한 다음 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 유리를 청소합니다. 다음으로 마이크로파이프를 사용하여 원래 저장 용기에서 밀리리터 당 05밀리그램 골드 나노 입자 용액의 100 마이크로리터를 제거하고 용액을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 배출합니다.시료를 6, 000배에서 10분 동안 원심분리합니다. 완료되면, 나노 입자 용액에서 과도한 계면활성제를 제거하기 위해 마이크로 파이펫으로 상체를 제거합니다. 다음으로 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 초순수수를 추가합니다.샘플을 잠시 소용돌이쳐 펠릿을 분해한 다음 즉시 20분 동안 초음파 처리하여 나노입자 응고를 완전히 재보페합니다. 마이크로파이프를 사용하여 나노 입자 용액 6 마이크로리터를 세척 및 긁힌 유리 커버슬립에 떨어뜨립니다. 그런 다음 조심스럽게 커버 슬립을 뒤집어 현미경 유리의 두 번째 큰 조각 위에 배치합니다.드롭은 유리의 두 조각 사이에 균등하게 확산해야합니다. 유리의 두 조각 사이에 갇혀 기포를 피하기 위해주의하십시오. 좁은 매니큐어 라인을 사용하여 커버슬립의 가장자리를 밀봉하여 액체의 증발을 방지합니다.현미경 단계에 샘플을 배치하고 현미경의 목표와 응축기를 정렬합니다. 초점을 조정하여 샘플로 초점 평면을 찾고 이전에 만든 스크래치 마크를 찾습니다. 나노 입자가 볼 때까지 초점을 집중하고 초점을 미세 조정합니다.응축기의 정확한 배치를 결정하기 위해 20배 의 목표에서 시작하여 80배 또는 100x와 같은 높은 배율로 이동하여 Kohler 조명 방법을 활용하십시오. 다음으로, 이미징을 위한 샘플 내에서 관심 영역을 선택합니다. 카메라 의 시야에서 영역을 중앙 집중하고 필요에 따라 초점을 조정합니다.현미경이 드 세나르몬트 설계를 가지고 있다면, 최대 배경 멸종에 가까운 편광제로 시작하고 점차적으로 배경 멸종을 감소향해 편광기를 회전. 배경 강도가 점차 증가합니다. 이상적인 설정은 나노 입자가 로컬 배경 평균에 비해 가장 큰 강도 차이에 도달 할 때 달성된다.플라스모닉 나노 입자의 경우, 가장 큰 대조는 일반적으로 최대 배경 소멸또는 그 근처에서 비교적 어두운 배경으로 달성된다. 길 잃은 조명이 프로세스와 상호 작용하지 않도록 실내 조명을 끕니다. 관심 영역을 보기 위해 중앙 파장이 주요 국부화 표면 플라스몬 공명 파장과 공동 으로 위치한 반최대 반최대 대역 패스 필터에서 10 나노미터 의 전체 폭을 배치합니다.다음으로, 배경 수준이 카메라최대 용량 레벨의 5%~40%에 달할 때까지 램프 강도 또는 노출 시간을 조정합니다. 관심 영역 내의 어떤 물체도 카메라 최대 강도 레벨의 90%를 초과하는 신호 강도를 나타내야 합니다. 각각 10 나노미터의 절반 최대에서 전체 폭을 가지고 있는 일련의 밴드 패스 필터로 샘플을 이미지화하여 전체적으로 전체 파장 범위에 걸쳐 이미징을 가능하게 합니다.램프 전원이 아닌 노출 시간을 조정하여 이미지의 배경 강도가 서로의 5% 이내로 유지되도록 합니다. 필터를 전환한 후 이미지를 캡처하기 전에 샘플을 다시 초점을 맞춥니다. 모든 관련 정보를 보존하기 위해 이미지를 압축되지 않은 TIFF 파일 및/또는 소프트웨어의 기본 파일 형식으로 저장합니다.분석을 시작하려면 ImageJ로 이미지를 엽니다. 직사각형 도구를 사용하여 관심 있는 주요 영역 주위에 사각형을 그립니다. 그런 다음 도구 모음에서 이미지를 선택하고 확대/축소로 이동하여 선택하도록 선택합니다.이미징 창은 선택한 영역을 확대합니다. 다음으로 이미지를 선택하고 조정하고 밝기/대비를 선택합니다. 샘플 영역의 뷰를 개선하려면 이미지의 최소, 최대, 밝기 및 대비를 조정합니다.이러한 조정은 과학적 데이터를 변경하지 않으며 샘플 영역의 더 나은 가시성을 가능하게합니다. 이제 사각형 도구를 다시 사용하고 측정할 첫 번째 나노 입자 주위에 상자를 그립니다. 상자는 나노 입자의 통풍 디스크보다 약간 커야합니다.일단 선택되면 분석하여 측정값을 선택합니다. 선택한 상자 안에 있는 픽셀에 대한 최소, 최대 및 평균 강도를 보고하는 새 창이 나타납니다. 상자의 원래 크기를 유지하 되 고, 배경 대비가 상대적으로 균등한 입자에 바로 인접한 영역으로 상자를 드래그하고, 입자 나 오염 물질이 존재하지 않습니다.측정 도구를 다시 사용하여 백그라운드 영역의 평균 강도를 결정합니다. 계열의 모든 이미지에서 각 파티클에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 데이터를 스프레드시트로 내보내 모든 파장 및 각도에서 각 파티클의 대비 또는 강도를 계산합니다.다음 방정식을 입력하여 각 파티클의 대비를 계산합니다. 마지막으로 X축을 따라 파장을 사용하여 데이터를 플로팅하고 Y축을 따라 콘트라스트 또는 강도를 플로팅하여 지정된 나노입자 위치에서 스펙트럼 프로파일을 그래프로 지정합니다. 최적의 이미징 설정을 결정하기 위해 이러한 금 나노스피어는 여러 편광제 설정에서 이미지화되었습니다.0도에서 파티클은 주로 흰색으로 표시되고 중간 부를 가로질러 어두운 줄무늬가 실행됩니다. 이는 나노스피어 샘플에 대한 교차 편광을 나타냅니다. 편광자가 서로 다른 각도로 회전하면 파티클이 어두운 그림자를 한 쪽 모서리쪽으로 투사합니다.그러나 파티클 대비 값은 크게 변경됩니다. 이 샘플의 경우 최적의 이미징 설정은 편광기 시동이 10도입니다. 여기서 파장이 금 나노구의 대비에 대해 플롯됩니다.각 데이터 포인트는 각 입자 직경에 대해 평균 20 나노스피어를 나타냅니다. 각 파티클의 피크 콘트라스트는 크기에 따라 약간 이동합니다. 강도와 회전은 이 금 나노로드와 같은 이중성 모양으로 더욱 중요합니다.여기서 파장이 두 개의 서로 다른 편광제 설정에서 강도에 대해 플롯됩니다. 각각의 경우, 밝은 면의 강도는 어두운 면보다 훨씬 강하다. 스테이지 회전 시 국소화된 표면 플라스몬 공명 파장에서 단일 금 나노로드의 강도 프로파일은 샘플이 180도를 통해 회전할 때 어둡고 밝은 면 사이의 큰 강도 차이를 나타낸다.샘플 이미징은 매우 중요합니다. 그것은 현미경의 부분에 부지런함과 인내심을 모두 필요로한다. 일련의 일 동안 샘플을 다시 이미징해야 하는 실험을 수행하는 경우 스크래치 마크와 같은 랜드마크가 관심 영역을 이전하는 데 중요합니다.DIC 현미경 검사는 나노 입자를 연구하는 연구원에 의해 관심에서 성장하고있다, 특히 동적 및 세포 환경에서. DIC는 특히 복잡한 샘플링 환경에서 최적의 공간 해상도를 제공합니다.

performing-spectroscopy-on-plasmonic-nanoparticles-with-transmission

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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In Situ 표면 강화 라만 분광법 특성화를 위한 플라즈몬 나노입자의 광학 트래핑

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