Name: 설치류 태 반의 전 생체 관류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 배우세요 설치류 태반의 전 생체 관류 기법을 통해 약리학적 물질과 이물질의 태반 투과 메커니즘을 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 태반 생리학 연구와 독성학적 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 환경 보건 과학 연구소 (R00-ES024783), 럿 거 스 센터 환경 노출과 질병 (P30 ES005022), 트 러 거 스 공동 대학원 독성 학 프로그램 (T32)에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 마이클 고 드 켄, 마리 안 Polunas, 페드로 루로가 기술 전문성을 보유 하 고 있으며, 아담 박사는 관류 회로도 설계에 대 한 호의를 베 고 싶습니다 (그림 5).

모든 실험 절차는 럿 거 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험 전 준비
참고: 이러한 단계는 실험 일/주 전에 수행 될 수 있습니다.
<ol><li>용기 챔버를 수정 합니다. 참고: 도 1a, B 는 변형 된 단일 용기 챔버를 나타낸다.<ol>
<li>서미스터 센서를 클립 아래에서 이동 하 고 관류 욕에 자유롭게 달려 있도록 굽 혀 냅니다 (그림 1b).</li>
		<li>표준 루어 연결 허브, 1 25 g 및 1 23 g을 가진 2 개의 4 인치 무딘 팁 스테인리스 스틸 바늘을 서미스터 클립 아래에 설치 하 고 3 방향 스톱 콕을 추가 하 여 배꼽 구조를 조절 합니다 (그림 1b). 참고: 서로 다른 게이지 크기의 루어 연결은 색상으로 구분 됩니다. 이것은 실험 도중 및 후에 혈관의 쉬운 식별을 용이 하 게 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두 개의 70-100 µm 유리 마이크로 피 펫을 설치 합니다. 이러한 절차에 대 한 자세한 내용은 다음 참조10,11을 검토 하십시오. 참고:이 실험에서 일반적으로 사용 되는 팁 지름은 70-100 µm의 범위에 있습니다. 팁 직경이이 범위 보다 크면 칸 형성 공정에 어려움이 있을 수 있으며, 팁 직경이 60 µm 미만인 경우에는 혈관 벽에 구멍을 뚫을 수 있습니다.</li>
	<li>멸 균 된 나일론 봉합 사 (자 궁 동맥의 근 위 및 말단 말단 용)와 블랙 꼰 실크 비 멸 균 봉합 사 (탯 줄 용기)에서 넥타이를 준비 합니다. 앞에서 설명한 바와 같이, 정사각형 매듭을 시작 하거나 신발을 묶는 것 처럼 봉합을 반복 하여 단일 넥타이를 만드십시오. 참고: 단일 넥타이는 일반적으로 만든 하 고 스티커 배경 작업을 돕기 위해 실리콘 고무의 작은 층으로 채워진 페 트리 접시에 보관.</li>
	<li>2 L의 생리 식 염 용액 (PSS)을 준비 하 고, 129.8 염화 나트륨, 5.4 KCl, 0.5 na2po4, 0.83 mgso4, 19 나 코를포함 하는 1.8 cacl2및 5.5 포도 당. 용액에 산 (1m 염 산) 또는 염기 (1 N 수산화 나트륨)를 서서히 첨가 하 여 pH를 7.40 ± 0.02로 조정 하 고 조정 된 pH 측정을 읽기 전에 적어도 20 초를 기다리십시오. 냉장고에서 사용할 준비가 될 때까지 PSS를 보관 하 여 오염을 줄이고 2 주 이상 보관 하지 마십시오.</li>
	<li>각 시점에서 "모성" 및 "태아" 폐수를 수집 하는 마이크로 원심 분리기 튜브, 즉 "MBaseline, M10, M20 ..." 최대 180 최소 타임 포인트. 태아 폐수 (FBaseline, M10, M20 등)에 대해 동일한 것을 준비 합니다.</li>
	<li>자 궁을 유지 하는 것과 관련 된 순환 목욕 온도 및 혈압 모니터를 포함 하 여 시스템 내에서 사용 되는 모든 장비를 교정 (80 mmHg) 및 배꼽 (50 mmHg) 관류 압력.</li>
	<li>실리콘 고무의 층 (< 0.25 ")을 충 진 하 여 해 부 챔버 (지름 x 1" 깊이) 또는 순환 히터 접시를 준비 합니다. 이 수정은 사전에 수행 해야 하며 고무 건조에 대 한 12-24 시간을 걸릴 것입니다. 참고: 순환 히터/냉각 접시를 사용 하는 것은 요리가 움직이지 않고 조직이 일정 한 온도를 유지 하므로 초보 외과 의사에 게 권장 됩니다.</li>
</ol>2. 수술 역의 준비 및 장비의 평형 화
<ol><li>관류 시스템을 지 원하는 모든 장비를 켜서 적절 한 기능을 확인 합니다. PSS를 냉장에서 꺼내어 실 온으로 따뜻하게 합니다. PSS는 관류와 중첩으로 사용 됩니다.</li>
	<li>작은 버블 링 스톤을 배치 하 여 가스 혼합물을 슈퍼 푸 게이트 저수지에 전달 합니다. 일반적으로 사용 되는 혼합물에는 21% o 2, 8% o2,3% 및 0% o2가 포함 됩니다. 가스를 켜서 작은 기포를 초 푸 레이트 용액에 공급 하십시오. 튀는 것을 방지 하기 위해 가스의 전달을 조정 합니다.</li>
	<li>마 취를 확인 하 고, 수술 장비를 배치 하 고, 봉합 사 관계를 준비 하 여 동물 해 부 역을 준비 하십시오. 하 부 핀을 수집 하 고 냉각기 (또는 얼음을 검색)를 켜고 차가운 PSS로 하 부 챔버 (고무 실리콘으로 안 감)를 채워 색인 챔버를 준비 합니다.</li>
	<li>따뜻한 PSS로 모든 챔버, 바늘, 유리 마이크로 피 펫, 튜빙 및 저수지를 조심 스럽게 채우고 미세한 팁 전달 파이 펫으로 흡입 하 여 기포를 신중 하 게 관찰 하 고 제거 하십시오. 파이 펫의 방향을 향하도록 "off"로 모든 3 방향 스톱 밸브를 돌려 파이 펫 내에서 유체를 고정 하십시오.</li>
	<li>자 궁 칸을 위해 준비 된 두 개의 유리 마이크로 피 펫과 탯 줄을 위해 지정 된 두 개의 무딘 팁 바늘에 단일 넥타이를 놓습니다. 챔버 이동 중 손실을 방지 하기 위해 파이 펫 및 무딘 팁 바늘과의 관계를 확보 합니다 (그림 1c).</li>
</ol>3. 태 반 수확
<ol><li>임신 한 여성 쥐에 게 5%의 아이 소 루 레인을 약 4 분 동안 또는 동물이 전시 된 호흡을 할 때까지 마 취 시켰다. 마 취를 유지 하기 위해 코 콘으로 동물을 이동 하 고 2.5%-3% 아이 소 루 레인을 관리 할 수 있습니다. 발가락 핀치 반사의 부족에 의해 무 의식 확인. 참고: 임신 일 20에서 쥐의 사용이이 프로토콜에 제시 되어있다. 그러나 실험 조건에서 태 반 평가가 임신 초기에 진행 되어야 하는 경우에는 동일 하 게 프로토콜을 유지 합니다.</li>
	<li>선택의 자 궁 경적을 확인 하 고 분리 (오른쪽 또는 왼쪽) 밖으로 해제 하 고 쥐 시체 밖으로 긴 방법을 확산. 꼰 실크 봉합 사를 사용 하 여, 난소 말단과 혼의 질 끝에서 자 궁 동맥을 묶어. 자 궁 경적으로 봉합 사의 난소 내부를 포함 시키십시오.</li>
	<li>외과가 위를 사용 하 여 자 궁 경적을 양 끝에 있는 봉합 사와 함께 묶여 자 궁 경적을 남겨 두는 질 넥타이의 난소 넥타이와 말단 부의 근 위부 측에 인하를 만들기로, 떨어져 소비 합니다. 자 궁 경적을 실리콘 고무로 늘어선 하 부 접시로 옮겨 차가운 (4°c) PSS로 채웁니다. 오른쪽 또는 왼쪽 경적이 선택 되어 있는지 여부에 관계 없이 일관성을 위해 각 실험에서 동일한 쪽을 선택 하도록 유지 합니다. 참고: 태아 마 취를 위해, 새끼는 얼음 차가운 PSS에 보관 됩니다. 따라서 해 부 챔버 내의 PSS 온도는 냉각 된 순환 욕 또는 해 부 챔버에 의해 유지 되어 얼음에 보관 되어야 한다. 참고:이 시점에서 마 취 된 담는 실험실 IACUC 프로토콜 승인 당 안락사 될 수 있다. 이 경우 안락사는 기 흉 (다이어 프 램을 절단 하 여)과 모계 심장의 제거를 통해 발생 합니다.</li>
	<li>자 궁 경적을 통해 해 부 핀을 실리콘 고무로 부드럽게 밀고 난소 측을 왼쪽으로, 질 쪽을 오른쪽으로 밀어 자 궁 맥 관 구조를 시각화 합니다. 이것은 자 궁을 안정 시키고 태아 구획의 해 부 도중 조직의 움직임을 방지 합니다. 산 모-태 반 태아 단위를 선택 하 여 경적을 중심으로 하 고 자 궁 동맥과 정 맥을 외과가 위로 리 게이트 한다. 선택 된 태 반과 태아에 자 궁 근 근 위부 및 말단을 절단 한다. 자 궁 근육은 측면으로 당겨 후퇴 할 수 있습니다. 그것은 그대로 두고 하지만 태아 pup를 덮고에서 그것을 당겨 하는 것이 중요 하다. 참고: 임산부-태 반 태아 단위의 선택은 아치형 동맥의 양쪽에 있는 자 궁 동맥 세그먼트의 길이에 기초 해야 합니다. 더 긴 세그먼트는 더 성공적인 통조림을 허용 합니다.</li>
	<li>미세한 집게와가 위를 사용 하 여 태 반의 태아 표면에서 양수 막을 제거 하 고 탯 줄을 피하도록 주의 하십시오.</li>
	<li>태아 강아지를 분리 하는 탯 줄을 해명 하 고 ligate.</li>
	<li>탯 동맥 (두꺼운 용기)과 정 맥 (더 얇은 용기)을 확인 합니다. 탯 줄 보다 약간 짧게 절단 하 여 쉽게 식별할 수 있도록 배꼽 정 맥을 표시 합니다.</li>
	<li>배꼽과 정 맥을 서로 부드럽게 분리 합니다.</li>
	<li>자 궁 맥 관 구조, 자 궁 근육, 태 반 및 탯 줄을 포함 하는 전체 태 반을 절단 하 고 제거할 수 있다.</li>
</ol>4. 태 반 관류
<ol><li>해부학 적 혈 류를 유지 하 여 자 궁 동맥의 말단-근 위부 배 향을 교정 하 고, 태 반 장치 (자 궁 맥 관, 자 궁 근육, 태 반과 탯 줄로 구성)를 개 질 된 단 리 된 용기 챔버로 채워 넣습니다 따뜻한, 산 소화 PSS와 함께.</li>
	<li>한 쌍의 미세 집게를 사용 하 여 각 손에 자 궁 동맥의 근 위부 말단을 유리 마이크로 피 펫에 연결 합니다.</li>
	<li>미리 멸 균 된 나일론 봉합 사 넥타이를 이용 하 여 자 궁 동맥을 단단하게 고정 시켜 마이크로 피 펫 상에 고정 시켰다. 참고: 2 타이 루프 (매듭)가 필요할 수 있습니다. 그러나 단일 tie 루프가 더 큰 조정이 가능 합니다.</li>
	<li>대 바늘 23g(큰) 니 들 위에 배꼽 동맥 (태아와 산 모의 혈 류)을 통조림으로 만들고 검은 땋은 실크 봉합 사로 고정 시킵니다.</li>
	<li>배꼽 정 맥 (임산부와 태아의 혈 류)을 25g의 무딘 바늘에 대 고, 검은 색 꼰 실크 봉합으로 고정 합니다.</li>
	<li>태 반 관류 역으로 이동 하 고 기포를 방지 하기 위해 모든 저지대와 호스를 백필. 그림 2에 따라 모든 호스를 연결 합니다.</li>
	<li>산 모의 자 궁 동맥의 말단 칸에 작은 계량 보트를 배치 하 고 절차 중에 출현 하는 유출 물을 잡기 위해 태아 탯 줄의 바늘 칸을 넣습니다.</li>
	<li>연동 펌프, 압력 컨트롤러 및 압력 모니터를 켜고 압력 트랜스듀서를 향해 튜브를 통과 하는 유체 흐름을 허용 하기 위해 모양을 열고, 하지만 아직 태 반에. 압력을 천천히 80 mm Hg로 늘립니다.</li>
	<li>천천히 개방 하 고 챔버 내부와 넥타이 주위에 누출을 보고 태 반에 모양을 돌립니다. 참고: 연동 펌프가 고속으로 실행 되는 경우, 유체 누출에 대 한 근 위 자 궁 칸과 타이를 재평가 하십시오. 식별 된 경우 누출을 해결 해야 합니다. 또한 평균 자 궁 동맥 압력이 일정 하 게 유지 되지만 (80 mmHg로 설정), 유체 유 속은 혈관 및 태 반 생리 적 반응에 따라 가변적 일 수 있다. 유체 흐름의 정량화는 xenobiotic 노출에 반응 하 여 실험적 변수로 서 식별 될 수 있다.</li>
	<li>배꼽으로의 유체 흐름을 허용 하기 위해 모양을 돌립니다. 압력을 약 50 mmHg로 설정 하 여 연동 펌프 (그림 3) 또는 정 압 칼럼으로 구현할 수 있습니다.</li>
	<li>모든 저장소 (자 궁, 배꼽 및 초 푸 레이트)를 리필 하 여 실험 전체에 걸쳐 체액 부피를 유지 합니다. 참고: 관류가 시작 되 고 실험이 진행 되 고 나면, 해 부 접시에 남아 있는 마 취 된 새끼는 신경학 적 반응을 유도 하기 위해 핀셋으로 새끼를 만져 생존 가능성을 평가할 수 있습니다. 새끼의 exsan구타는 자 궁 경적의 자 군 절제술을 통해 발생 합니다; 추가적으로 안락사는 승인 된 IACUC 프로토콜을 통해 완료 될 수 있습니다. 이 경우, 콜드 PSS에서 양 낭을 열고 갈비뼈를 절단 하 여 기 흉을 만듭니다.</li>
</ol>5. 모의 실험
<ol><li>PSS 관류의 통조림 및 개시 후, 조직이 새로운 유체 흐름에 적응할 수 있도록 30 분 동안 조직을 평형 화 시켜 준다. 피 펫에의 한 유출 수를 흡입 하 고 그에 상응 하는 라벨링 된 마이크로 원심 분리기 튜브에 저장 합니다.</li>
	<li>평형 화 후, 마이크로 원심 분리기 튜브에 있는 양 계량 보트에서 10 분 동안 폐수를 수집 하 여 기준선 관류를 확립 하 고 자 궁 동맥 및 배꼽 정 맥을 통해 나오는 유체의 부피를 측정 합니다.</li>
	<li>말단 자 궁 동맥 및 배꼽 정 맥 으로부터 폐수를 수집 하 여 10 분 간격으로 시료 채취를 시작 합니다. 예를 들어, 900 µ L 볼 루스로 다 민 표지 된 폴리스 티 렌 나노 입자 (8×1014 입자 /m l)를 투여 한 라인 관류에 0.01% 계면 활성 제에 부유 하 여 자 궁 동맥을 사용 하 여 엑 시 바이오 틱의 시간 경과 과정을 규명 한다. 태 반 장벽을 가로질러 나노 입자. 참고:이 배출물 샘플은 유체 내 오염 물질 (xenobiotic, 약리학 적 또는 대사 산물 중 하나)을 측정 하 고 자 궁 동맥을 통해 또는 태 반을 가로질러 그리고 태아 구획으로 유체 흐름의 속도를 제공 할 것입니다 ( 그림 4).</li>
	<li>볼 루스 주입 후, 주입 후 총 180 분 동안 말단 자 궁 동맥 및 태아 탯 줄 정 맥 으로부터 10 분 마다 샘플을 수집 한다.</li>
</ol>6. 장비 청소
<ol><li>각 실험 후, 파이 펫에서 태 반 유닛을 제거 하십시오. 모든 봉합은 향후 실험에서 재사용 될 수 있습니다. 태 반 조직은 추가 조직학 또는 기계 론 적 연구를 위해 저장 될 수 있다.</li>
	<li>70% 에탄올과 증류수 및 진공 건조로 관류 시스템의 모든 호스 링 및 캐 뉼 라스를 청소 하십시오. 참고: 튜빙 또는 파이 펫이 변색 되거나 손상 된 것으로 나타나기 시작 하면 다음 실험 전에 교체 하십시오. 또한 실험 코 호트가 완료 된 후 (예: 단일 오염 물질에 관한 모든 연구) 교차 오염을 방지 하기 위해 챔버 내의 모든 호스를 교체 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Troen, P., Gordon, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+studies+of+the+human+placenta.+I.+Effect+of+estradiol+and+human+chorionic+gonadotropin+on+citric+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Perfusion studies of the human placenta. I. Effect of estradiol and human chorionic gonadotropin on citric acid metabolism.</a> Journal of Clinical Investigation. 37, 1516-1523 (1958).</li>
<li>Alexander, D. P., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep%3A+the+influence+of+concentration+gradient+upon+the+rates+of+hexose+formation+as+shown+in+umbilical+perfusion+of+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The placental transfer of sugars in the sheep: the influence of concentration gradient upon the rates of hexose formation as shown in umbilical perfusion of the placenta.</a> Journal of Physiology. 129, 367-383 (1955).</li>
<li>Alexander, D. P., Andrews, R. D., Huggett, A. S., Nixon, D. A., Widdas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placental+transfer+of+sugars+in+the+sheep%3A+studies+with+radioactive+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The placental transfer of sugars in the sheep: studies with radioactive sugar.</a> Journal of Physiology. 129, 352-366 (1955).</li>
<li>Dancis, J., Money, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+sodium+and+iodo-antipyrine+across+guinea+pig+placenta+with+an+in+situ+perfusion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Transfer of sodium and iodo-antipyrine across guinea pig placenta with an in situ perfusion technique.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 80, 215-220 (1960).</li>
<li>London, W. T., Money, W. L., Rawson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Transport+of+I-131-Labeled+Thyroxine+and+Triiodothyronine+in+the+Guinea+Pig%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Placental Transport of I-131-Labeled Thyroxine and Triiodothyronine in the Guinea Pig.</a> Endocrinology. 73, 205-209 (1963).</li>
<li>Stulc, J., Stulcova, B., Svihovec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+calcium+across+the+dually+perfused+placenta+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transport of calcium across the dually perfused placenta of the rat.</a> Journal of Physiology. 420, 295-311 (1990).</li>
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<li>Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+isolated+skeletal+microvessel+preparation+for+investigation+of+vascular+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ex vivo isolated skeletal microvessel preparation for investigation of vascular reactivity.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 3674(2012).</li>
</ol>

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이러한 관류 법은 자 궁 혈관 구조 및 트로 포 블 라스트 층의 태 반 장벽 및 생리 적 기능에 대 한 신속한 평가를 가능 하 게 한다. 모계 자 궁 동맥의 원 위부 말단에 근 위를 관류 하는 것은 태아에 혈액을 보내는 것을 담당 하는이 주요 혈관을 통해 모계 혈액 흐름의 생리학을 시뮬레이션 한다. 이 방법론은 고립 된 모성, 태 반 및 배꼽 조직에 대 한 생리 적 평가를 허용 하며, 따라서 생리학의 변화는 혈관 병리학으로 확인 될 수 있습니다. 면역 및 신경 자극은 전 생체 절차에서 제거 됩니다. 따라서 적절 한 평가를 위해 용기 벽에 눈물 이나 구멍을 뚫 지 않고 기포를 제거 하지 않도록이 용기를 조심 스럽게 분리 하는 것이 중요 합니다. 가스 색 전 혈관의 내 피 층에 손상을 일으킬 수 있습니다. 해 부 동안 자 궁, 태 반 및 태아 사이의 혈관 연결을 유지 함으로써, 태아에 대 한 유체 및 트랜스 로케이션의 평가가 관찰 될 수 있다. Xenobiotic의 투여와 함께,이 경우 20 nm 폴리스 티 렌, 자 궁 동맥의 말단 부 및 태 반을 통해 태아 구획에 대 한 반응 속도는 180 분의 시간 과정에 걸쳐 폐수의 분석에 의해 평가 될 수 있다.
이중 관류 모델을 설명 하 고이 문서에서 산 모의 입자와 체액을 태아 구획으로 이송 하는 동안, 평가는 또한 태아에서 산 모 구획으로 역으로 이루어질 수 있다. 여기에서 설명 되는 방법의 한 가지 제한은 말단 자 궁 정 맥이 통조림 또는 샘플링 되지 않은 것 이다. 향후 연구에서, 특히 태아와 모계 간의 전이에 초점을 맞춘, 말단 자 궁 혈관을 통조림 화 하 고 샘플링 하는 것이 중요할 것 이다. 이 모의 실험에서 취해진 폐수는 엑 시 놀 틱 전달을 평가 하는데 사용 되었다; 그러나 내 분 비 및 분자 태 반 기능 또는 태아 영양과 관련 된 다양 한 평가가 수행 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 강점은 사소한 제한 보다 훨씬 큽니다. 준비는 실험 조건을 평가 하기 위하여 전체 기관의 생리 적인 구조 그리고 완전성을 유지 합니다. Ex vivo 태 반 관류는 생식 위험 평가를 제대로 결정 하기 위해 세포 기반 시험관 내에서 전체 동물 노출로의 과학적 진행입니다. 이것은 태 반 약리학 적 약물 처분, 약 동학, 독성 학, 생리학 및 모성 태아 의학을 평가 하는 연구를 위한 귀중 한 기술로 간주 될 수 있습니다.

형태 학적 구조 및 생리 적 반응성을 유지 함으로써, 장기 관류는 수용 된 시스템-또는 신진 대사 기능을 분석 하기 위한 조직 기반 접근. 이러한 관류 기술은 다양 한 약리 및 기계적 자극에 대 한 온전한 조직 반응의 전 생체 내 검사를 허용 한다. 인간 태 반의 관류는 초기에 1958에서 설명 하였으며, 구 연산 사이클의 대사 활성에 대 한 호르몬 효과를 확인 하는 단계; 이전에 조직 균질 화에서 확인 된 데, Troen과 고 든은 새로운 생리 적 접근법을 사용 하 여 내 분 비 활동을 명확히 할 필요성을 인식1. 같은 시대에, 단일 관류 (모계에서 태아 또는 태아를 산 모) 전략을 큰2,3 및 작은4 동물 모델에 설명 했다 설탕의 태 반 이동, 염, 및 안티 피 린 약물. 생체 내 및 전 생체 이중 관류 (배위 된 모성 및 태아 관류) 기술 들은 생체 내5 및 전 생체 내6,8 방법론을 이용 하 여 태 반 전달을 특성화 하기 위해 기술 되었다. 트랜스 미션 및 주사 전자 현미경의 기술적 진보는 연구원 들이 관류 후 인간 태 반 조직의 구조적 및 기능적 완전성을 검증할 수 있게 했습니다.
인간 태 반 조직과 개인 자 엽의 관류가 가장 관련성이 있지만, 약리학 적 제제 및 환경 오염 물질의 급속 한 발달은 제 노 생체의 조기 스크리닝을 위한 동물 관류 모델의 사용을 필요로 한다 태 반 장벽을 가로질러 이동 합니다. 이 태 반 관류 방법은 더 쉽게 달성 하 고 생리학적으로 관련 된 쥐 태 반을 사용 하 여 태 반 장벽에 걸쳐 전달의 평가를 허용 한다. 또한, 노출 후 일정 시간에 걸쳐 태 반 장벽을 가로지르는 유체 흐름은 배꼽 으로부터 유입 되는 관류 량의 부피를 측정 함으로써 평가 될 수 있다. 산 모의 및 태아 순환 둘 다에서 태 반 관류를 허용 하는 것에 의해,이 이중 유동 전체 기관 접근법은 현재 시험관 내 및 생체 내 접근법에 비해 유리할 수 있다. 이 방법은 산 모의 측면을 통해 서에 노 바이오 틱을 투여 하는 것은 배꼽 정 맥을 통해 태 반을 가로질러 나온다, 또는 그 반대의 경우에서 측정 될 수 있다. 여기에 제시 된 프로토콜은 모성 자 궁 동맥에서 태아 구획으로 20 nm 폴리스 티 렌 (식품 및 의료 제품에 사용 되는 일반적인 나노 플라스틱)의 전달을 설명 하기 위해 태 반을 가로질러 유체 흐름의 관련 감소를 기술 할 것 이다 임산부 및/또는 태아의 흐름에 영향을 미치는 태 반 전달, 신진 대사 및 생리 적 변형을 평가 하기 위해 여러 생리 적, 약리학 적 및 독성 학적 설정에서이 방법을 사용 합니다.

<table><tbody><tr><td>검은 꼰 실크 비 흡수성 외과 봉합사 비 멸균</td><td>외과 전문 AACO805</td><td></td><td></td>미세</tr><tr><td>집게</td><td>FST Dumont Switzerland</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>FST by Dumont Switzerland</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>유리 캐뉼라 팩</td><td>생활 시스템 계측 (LSI)</td><td>GCP-75-100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브 2.0mL 폴리 프로필렌 눈금 튜브 잠금 뚜껑 MIXED</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-299</td><td></td></tr><tr><td>톱니 모양이없는 미세 곡선 마이크로 serrefine 클램프</td><td>InterFocus</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>관류액 펌프</td><td>ISMATEC</td><td>ISM795C</td><td></td></tr><tr><td>압력 모니터</td><td>생활 시스템 계측 (LSI)</td> <td>모드 PM-4</td><td></td></tr><tr><td>자체 발열 단일 용기 챔버</td><td>리빙 시스템 계측 (LSI)</td><td>CH-1</td><td></td></tr><tr><td>서보 펌프</td><td>리빙 시스템 계측 (LSI)</td><td>모델PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 무딘 바늘 23 게이지</td><td>부품 공급 유한</td><td>04651-01</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 무딘 바늘 25 게이지</td><td>부품 공급 유한 업체</td><td>07116-01</td><td></td></tr><tr><td>STERILE 나일론 봉합사</td><td>AROsurgical Instruments Corporation</td><td>T04A00N07-13</td><td></td></tr><tr><td>마개</td><td>진정 리소스</td><td>6-205-04</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절기</td><td>생활 시스템 기기(LSI)</td><td>모델 TC-09S</td><td></td></tr></tbody></table>

설치류 태 반의 전 생체 관류

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

태 반은 임신 중 태아에 대 한 장벽 역할을 하 고 폐기물에 대 한 영양분 교환을 중재 하는 주요 기관입니다. 분석은 여기에 고립 된 쥐 태 반을 완료 하 고 생체 이물질 ex vivo의 모성 대 태아 전 좌를 평가 하기 위하여 여기에 기술 됩니다. 또한, 이러한 방법론을 통해 태아 및 태 반 대사에 대 한 유체 흐름과 같은 생리 적 과정의 평가가 진행 될 수 있다. 이 기법은 제약 후보 또는 환경 오염 물질의 모계-태아 동역학을 평가 하는 데 적합 합니다. 현재의 대안적 접근법과는 대조적으로,이 방법론은 분리 된 모계 태아 맥 관 구조의 평가를 가능 하 게 하 고, 전신 신경 또는 면역 침범을 제거 하 고, 생리 적 기능에서 관찰 된 변화를 허용 한다 격리 된 조직 내의 지역 요인에 기인 합니다.

그림 5 는 우리에 게 시스템을 테스트 하 고 적절 한 유체 및 태 반 장벽 기능을 시각화 하 고 태아 구획에 포함을 방지 하기 위해 우리를 허용,에 반의 청색 염료를 사용 하 여 원리 증명 실험을 보여줍니다. 에 반의 청색 염료에 도달 하 고이 시스템 내에서 태 반 조직을 사용 하였다 (도 5a). 추가 조사에의 하면,에 반 청색 염료가 태아의 배꼽 정 맥 (도 5b)에 들어가지 않는 것이 분명 하 고,이는에 반 청색 염료가 알 부 민에 결합 되는 것으로 예상 된다.
그림 6 은이 프로토콜에 설명 된 모의 실험에 대 한 데이터를 보여줍니다. 유출 샘플은 자 궁 동맥 및 태아 탯 줄의 말단 부에서 볼 루스 투여 후 시간 경과에 따른 유체 흐름을 평가 하기 위해 각 10 분의 분절에서 산 모의 자궁내 동맥에 투여 하였다 (도 6). 폴리스 티 렌 주입이 확인 된 후 10 분 이내에 태아 구획으로의 체액 전달을 감소 시켰다. 시간 과정 동안에 폴리스 티 렌을 태아 격실에 양도 하는 것을 정량화 하기 위해, 96 웰 플레이트에 각 시점 으로부터의 관류 액의 25 µ L을 복제 하 여 샘플 형광을 측정 하였다. 형광은 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용 하 여 546/575 nm (ex/em)에서 분 광학적 판독에 의해 결정 되었다. 태아 구획에 폴리스 티 렌 전달은 10 분 이내에 발생 하 고 20 분 동안 뾰 족 하 고 90 분 동안 계속 되었다 (도 6b).
관류 된 태 반 조직의 서브셋은 조직 병리학 및 형태학 적 평가를 위해 저장 되었습니다. 상기 조직은 포 르 말린-고정 및 헤 마 톡 실린 및에 오신을 염색 하 고 보드 공인 수의학 병리학 자에 의해 검토 하였다. 이러한 전문가 들은 구조적 이상이 없는 것으로 확인 했습니다 .로 다 민 라벨이 부착 된 폴리스 티 렌의 볼 루스 용량으로 PSS 또는 PSS에 의해서만 사용 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig1.jpg"> 도 1: 개 질 된 단일 용기 챔버. (A) 수정 된 챔버의 개요. (B) 상기 용기 챔버 내에 고정 된 무딘 팁 바늘의 클로즈업 이미지. 적색 화살표는 탯 줄을 위해 바늘을 제자리에 고정 시키기 위해 변경 된 서미스터 클립을 나타냅니다. (C) 조직 통조림을 위해 제조 된 4 개의 캐 뉼 라스의 대표적인 이미지 이다. 빨간색 화살표는 4 개의 캐 뉼 라스 각각을 가리킵니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig2.jpg"> 도 2: 태 반 관류 챔버의 면밀 한 시야. (A)이는 압력 트랜스듀서에 부착 된 튜빙을 나타내고 근 위 모성 자 궁 동맥 또는 "유입"을 표로 작성 한다. 압력은 문헌에 의해 정의 된 바와 같이 일정 한 80 mmHg로 설정 된다. (B) 이것은 관류 동안 태 반 조직을 둘러싼 초 푸 레이트의 챔버 드레인 포트를 나타낸다. (C)이는 관류 중에 데워 진 PSS로 태 반을 목욕 시키기 위한 초 푸 레이트의 챔버 유입을 나타낸다. (D) 이것은 자 궁 관류 로부터의 배출물 들이 수집 될 수 있는 말단 모성 자 궁 포트를 나타낸다. (E) 이것은 실험 전반에 걸쳐 일정 한 온도를 유지 하기 위해 용기 챔버가 온도계 및 히터에 부착 될 수 있는 온도 포트를 나타낸다. (F) 이것은 대 동맥 칸 형성을 나타낸다. 배꼽 동맥은 50 mmHg에 가압 되어 태 반의 수준에서 역류 흐름을 허용 합니다. (G) 이것은 배꼽 정 맥 유출 물 수집을 나타낸다. 관류 중 태아 구획을 향해 흐르는 유체는 여기에서 수집 됩니다. (H) 이것은 관류 시스템의 중심 이며, 여기서 태 반은 관류에 걸쳐 보존 되 고 유지 된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig3.jpg"> 도 3: 태 반 관류 시스템의 도면. (A 와 B) 자 궁 동맥을 통해 관류의 80 mmHg를 모니터링 하 고 유지 하기 위해 사용 되는 압력 제어 시스템. (C)이는 관류 챔버의 열 조절을 나타낸다. (D) 현미경. (E) 관류 챔버. (F) 50 mmHg에서 중력 사육 배꼽 관류 세트. (G) 태 반 초전도 PSS를 채우고 배수 하는 데 사용 되는 연동 펌프. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig4.jpg"> 도 4: 태 반 관류 시스템의 개략. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig5.jpg"> 그림 5:에 반 파랑 염료를 사용한 원리 증명 실험의 대표 이미지. (A 와 B)에 반의 청색이 자 궁 맥 관 구조, 자 궁 근육 및 태 반을 사용 하지만 알 부 민 결합으로 인 한 태 반 장벽을 교차 하지 않는다는 것을 증명 하는 원리. 녹색 화살표는 태 반에서 산 모의 순환으로 다시 블루 정 맥 배수를 나타냅니다. 적색 화살표는 탯 줄 정 맥 배출물을 태아 구획 쪽으로 가리킨다. 청색 염료의 부족을 유의 하십시오. (C) 배꼽 정 맥 으로부터 배수 되는 배출물 들을 수집 하는 대표적인 이미지. 빨간색 화살표는 수집 전에 낙하 형성을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59412/59412fig6.jpg"> 그림 6: 모의 실험에서 파생 된 데이터입니다. 로 다 민 라벨 폴리스 티 렌 나노 물질의 형광 측정은 (A) 자 궁 동맥 및 (B) 태아 배꼽 정 맥의 수집을 통해 기준선 형광으로 정상화 된다. 기준 형광 ± 표준 오차 (SE)로 정규화 된 것을 의미 한다. 분산 분석 (ANOVA)을 통해 p &lt; 0.05 및 T: p &lt; 0.1 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59412/59412fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기에 전 생체 모성 태아 혈관 관류의 프로토콜이 제시 되어 모계의 혈관 조직으로 시험 물품의 투여를 가능 하 게 하 고, xenobiotic 입자 또는 약리학 적 제제의 변경 이외에의 태 반 전달을 평가할 수 있도록 태 반 생리학.

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

이러한 기술의 성공적인 적용은 약리학적 시험의 운동 평가 또는 형태학적으로 그대로 태반을 통해 제노바이오틱 오염 물질의 통과를 허용할 것이다. 설치류 태반 관류 기술은 여러 화합물이 단일 댐의 조직을 사용하여 평가 될 수 있기 때문에 약리학적 또는 독성 연구의 더 높은 처리량을 허용합니다. 이 기술을 시연하는 것은 제 실험실에서 대학원생인 Jeanine D'Errico가 될 것입니다.절차를 시작하기 전에 모든 챔버, 바늘, 유리 마이크로 파이프, 튜브 및 저수지를 따뜻하게 생리용염 용액 또는 PSS로 조심스럽게 채우고 필요에 따라 미세한 전달 파이펫으로 기포를 조심스럽게 제거하십시오. 파이펫 내의 유체를 고정하기 위해 3방향 스톱콕을 모두 오프 위치로 돌립니다. 자궁 캐니네이션을 위해 준비된 두 개의 유리 마이크로피펫과 배꼽 캐니네이션으로 지정된 두 개의 무딘 팁 바늘에 하나의 넥타이를 놓습니다.그런 다음 챔버 이동 중에 손실을 방지하기 위해 관계를 확보하십시오. 마취 임신 일에 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후 20 여성 임신 쥐, 복부에서 하나의 자궁 경적을 들어 올려 동물 외부에, 먼 곳에서 뿔을 확산. 편조 실크 봉합사를 사용하여 자궁 뿔이 있는 봉합사 내부의 난소를 포함하여 뿔의 질과 난소 끝에 있는 자궁 동맥을 묶습니다.외과 가위를 사용하여 난소 넥타이의 근근 면과 질 넥타이의 탈경면을 절개하십시오. 자궁 경적을 실리콘 고무가 늘어선 해부 접시에 옮기고 차가운 PSS로 채워져 있습니다. 난소 면이 왼쪽과 질의 측면을 오른쪽으로 누르면 자궁 경적을 통해 해부핀을 실리콘 고무로 부드럽게 밀어 자궁을 안정시합니다.경적 의 중심에 모계 태반 태아 단위를 선택합니다. 미세 한 집게와 가위를 사용 하 여, 탯줄을 피하기 위해 주의 태반의 태아 표면에서 양수 막을 제거. 태아 새끼를 분리하기 위해 탯줄을 풀고 리디칭하십시오.배꼽 동맥과 정맥을 식별 한 후, 부드럽게 분리하고 배꼽 혈관을 리게이트합니다. 그런 다음 탯줄 정맥을 탯줄 동맥보다 약간 짧게 잘라 식별의 용이성을 위해. 그리고 자궁 동맥과 정맥을 외과 가위로 장식하십시오.자궁 동맥 해부학 혈류의 올바른 방향을 유지, 해부 현미경에서 따뜻한 산소 PSS로 채워진 수정 된 고립 된 혈관 챔버에 태반 단위를 배치. 각 손에 미세 집게 한 쌍을 사용하여, 유리 마이크로 파이프에 자궁 동맥의 근위 및 탈구 끝을 누를 수 있습니다. 이전에 배치 된 멸균 나일론 봉합사로 동맥을 단단히 고정하십시오.23 게이지 무딘 바늘에 배꼽 동맥을 캐누레이하고 고정하십시오. 그런 다음 25 게이지 무딘 바늘에 배꼽 정맥을 캔누킹하고 고정하고 기포를 방지하기 위해 모든 스톱콕과 튜브를 백필합니다. 시스템의 공기 볼루스가 세포 고민으로 이어지고 태반 내의 카운터 전류 흐름을 제거하기 때문에 모든 스톱콕, 카누라 및 기포 튜브를 확인하는 것을 기억하십시오.그림에 따라 모든 튜브를 연결합니다. 작은 계량 보트를 모계 자궁 동맥의 단경 수액 아래에 놓고 태아 배꼽 정맥의 바늘 캐너레이션 아래에 배치하여 절차 과정에서 나타날 유출물을 잡으세요. 나중에 분석을 위해 유출물을 위해 수집 플레이트를 준비합니다.스톱콕을 열어 튜빙을 통해 태반쪽으로 유체가 흐를 수 있도록 하고 연동 펌프, 압력 제어 및 압력 모니터를 켭니다. 압력 모니터에서 판독된 수은80mm로 천천히 압력을 증가시면 됩니다. 자궁 동맥에 유체 흐름을 허용하기 위해 스톱콕을 천천히 엽니다.실험 전반에 걸쳐 유체 부피를 유지하기 위해 모든 저장소를 리필합니다. 조직이 30분 동안 평형화한 후 혈관이 새로운 유체 흐름에 적응할 수 있도록 하고, 두 배 모두에서 10분 동안 유출물을 수집하여 기준관류를 확립한다. 자궁 동맥과 배꼽 정맥을 통해 나타나는 유체의 양을 측정합니다.기준선 수집 기간이 끝나면 자궁 동맥내로 실험적 치료를 투여한다. 그런 다음 주입 후 총 180 분 동안 10 분마다 황산 자궁 동맥 및 태아 배빌레 정맥 유출물에서 샘플을 수집합니다. 유체 샘플 내의 오염 물질을 측정합니다.에반스 블루 염료가 있는 관류는 시스템을 테스트하고 태아 구획으로의 오염물질 전달을 방지하기 위한 적절한 유체 및 태반 장벽 기능을 시각화하여 염료가 이 시스템 내의 태반 조직에 도달하고 퍼펙트한 것으로 나타났습니다. 자세히 조사하자마자 에반스 블루 염료가 태아 배꼽 정맥에 들어가지 않은 것은 분명하며, 에반스 블루 염료는 알부민에 묶여 있기 때문에 예상됩니다. 본 대표적인 실험에서, 폴리스티렌 주입 후 10분 이내에 태아 구획으로의 감소된 유체 전달이 확인되었다.폴리스티렌은 태아 구획으로 옮겨진 후 20분 만에 최고조에 달해 90분 동안 계속되었습니다. 캐니옹 중에 기억해야 할 가장 중요한 것은 천천히 가는 것입니다. 파이펫과 조직은 매우 섬세하며 쉽게 깨지거나 찢어질 수 있습니다.이 방법론은 응용을 계량함으로써 태반 생리학뿐만 아니라 물질 전좌를 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 간 세포를 분리하기 전에 콜라겐 분해 효소 용액을 사용하여 문맥을 통한 마우스 간 관류 절차를 설명합니다.

In vivo Murine Liver Perfusion: 문맥을 통해 설치류 간에 용액을 주입하는 방법

태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

우리는 장기간 생체 내 생체 태반 생리를 연구하기위한 상세한 방법을 제시합니다. 이 방법은 태아의 모체 및 태아 측에 유입 및 유출 혈관으로부터의 혈액 샘플링을 부피 혈류 및 태반 조직 샘플링의 초음파 측정치와 결합시킨다.

인간 태반 생리학의 통합 연구에 대한 4 혈관 샘플링 접근법<em&gt; In Vivo</em

우리는 안전 및 태 반 대상 약물 전달의 효과 평가 하기 위해 세 가지 방법을 사용 하는 시스템을 설명: vivo에서 이미징 나노 축적, 태 반 및 태아 개발을 모니터링 하 고 주파수 초음파를 모니터링 하 그리고 조직에 약물 전달 척도를 HPLC.

3 보완 방법을 사용 하 여 태 반 대상 약물 전달의 안전과 효율성의 종합 평가

프로토콜은 방광, 전립선, 성기관, 뼈, 근육 및 발 피부를 포함한 마우스 하반신의 시상 수혈에 대해 설명된다.

마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립

여기에서는 생체 내에서 마우스 태반의 중요한 발달 경로를 효과적으로 조작하는 시간별 방법을 설명합니다. 이것은 배아 12.5일째에 임신한 댐의 태반에 CRISPR 플라스미드를 주입하고 전기천공하여 수행됩니다.

Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

여기에서 우리는 쥐 모델에서 정상 체온 상피 보존 후 이종 국소 이식된 심장의 평가 프로토콜을 제시합니다.

Normothermic Ex-Situ 관류 이종 심장 이식의 쥐 모델

정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.

마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

저산소 조건(자간전증의 한 측면 모델링)에서 배양된 태반 외식에서 분리된 소형 EV(sEV)가 임신하지 않은 성인 암컷 마우스의 혈액-뇌 장벽을 파괴하는지 여부를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

저산소성 인간 태반의 작은 세포외 소포에 의한 생쥐 혈액-뇌 장벽의 파괴

다음은 일정한 흐름 조건에서 태반 외식을 배양하기 위한 프로토콜입니다. 이 접근법은 동적 생리학적 환경의 복제를 가능하게 하여 기존의 정적 융모 배양 시스템을 향상시킵니다.

Ex Vivo (체외 주행) 태반 이식 유동 배양 - 자궁의 동적 조건 모방

이 프로토콜은 바이러스 감염 연구를 위해 공기-액체 경계면에서 배양한 인간 태반 조직 제거 식물을 준비하는 과정을 설명합니다.

엑스빅 빅 모체-태아 경계면을 통한 바이러스 전파 연구를 위한 인간 태반 이식 배양

배우세요 설치류 태반의 전 생체 관류 기법을 통해 약리학적 물질과 이물질의 태반 투과 메커니즘을 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 태반 생리학 연구와 독성학적 연구에 활용됩니다.

설치류 태 반의 전 생체 관류

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