Name: 전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 전체 산 에피플루오레센스 현미경법을 사용하여 MLC-2v-tdTomato 형광 리포터 마우스에서 심장 챔버 형성을 관찰하는 방법을. 이 간단한 프로토콜은 복잡한 장비 없이 심장 발생을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 NIH R03 HL140264에 의해 지원 되었다 (Y.-제이 N)와 길 르 앗 과학 연구 학자 프로그램 (Y.-제이 N)입니다.

모든 동물 절차 Vanderbilt 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인으로 수행 했다.
1. 마우스 배아 수집 및 해 부
<ol><li>친구 8 10 주 오래 된 여성 MLC-2v-tdTomato+ 마우스 8 10 주 오래 된 남성 MLC-2v-tdTomato+ 마우스를 MLC-2v-tdTomato+ +, MLC-2v-tdTomato+ 와 MLC-2v-tdTomato-/- 배아.</li>
	<li>매일 아침 질 플러그에 대 한 댐을 확인 하십시오. 질 플러그 감지 당일 정오 E0.5로 간주 됩니다. 참고: 질 플러그를 탐지 하기 위한 질 시험 (8-24 h 성행위 후), 내 아침에 수행 되어야 합니다 때문에 질 플러그 하루 동안 손실 될 수 있습니다.</li>
	<li>다른 일 게시물 coitum (예: E8.5, E10.5, 및 E12.5)에서 임신 댐 안락사 경부 전위 다음 공동2 흡입을 사용 하 여.</li>
	<li>부정사 쥐를 쥐 해 부 동안 마우스 머리 오염을 피하기 위하여의 복에 70% 에탄올을 스프레이.</li>
	<li>피부와 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 한 forcep 복 벽의 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다.</li>
	<li>복 부 구멍의 등 쪽 부분에 양측 자 궁 뿔을 찾습니다.</li>
	<li>날카로운 수술가 위를 사용 하 여 한 forcep 양쪽에는 oviducts 위에서 신중 하 게 절단 하 여 자 궁 전체를 구분 합니다.</li>
	<li>10 cm 배양 접시 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 전체 해 부 자 궁을 놓고 신중 하 게 날카로운 수술가 위를 사용 하 여 한 forcep 자 궁 경적 따라 각 amniotic sac를 분리 합니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트 전송 피 펫을 사용 하 여 얼음 처럼 차가운 PBS 가득의 개별 우물에 각 배아를 전송 합니다.</li>
	<li>해 현미경 amniotic sac를 열고 사용 하 여 날카로운 수술가 위는 forcep 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 6 잘 플레이트의 개별 잘에서 탯에서 절단 하 여 각 배아를 노출 합니다.</li>
	<li>날카로운 수술가 위를 사용 하 여 한 forcep 태아 손상 없이 가능한 여분의 배아 조직 밖으로 잘라. 참고: 전체 마우스 배아의 전체 마운트 epifluorescent 이미징 일반적으로 아래에 설명 된 개발 심장 해 부 하기 전에 수행 됩니다.</li>
	<li>유전형 epifluorescent 이미징의 결과와 상관 관계를 100 µ L 버퍼 A의 (25 m m NaOH와 0.2 m m EDTA)와 날카로운가 위를 수술과 forcep 1.5 mL 튜브에 사용 하 여 태아 머리를 잘라.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 태아의 가슴을 열고, 폐 맥 관 구조 날카로운 수술가 위, 집게를 사용 하 여에서 마음을 제거 하 고 전송 피 펫을 사용 하 여 PBS를 가진 해 부 배아 심장 12 잘 접시의 우물으로 전송. 섬유 광학 현미경 illuminator와 해 현미경으로 모든 해 부 절차 완료 됩니다. 참고: 그것은 기술적으로 어려운 그들의 매우 작은 크기와 깨지기 쉬운 구조 때문에 E8.0 또는 E8.5, 쥐 미 발달 심 혼을 해 부 했다. 초기 미 발달 심 혼 (E8.0 및 E8.5) 절 개 없이 전체 마운트 태아 내에서 시험 될 수 있다.</li>
</ol>2. 전체-마운트 epifluorescence 이미징
<ol><li>epifluorescent 해 부 현미경 아래 마우스 배아 마음으로 12 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>해 부 현미경 미세 집게를 사용 하는 epifluorescent에서 개발 심 시험관 가까이 되도록 배아 심장 위치.</li>
	<li>0.63 x 목표를 사용 하 여 이미지의 초점을 조정 (3.15 x와 18.9 사이 범위를 확대 x) 밝은 필드 모드에서.</li>
	<li>밝은 분야 노출 하 고 여러 이미지를 캡처하십시오. 이미지는 일반적으로 1 초 노출에 의해 얻은 했다. 그러나, 노출 시간 조명 및 카메라 specificationss을 따라 하 고 각 설정에 대 한 최적화 하는 데 필요한 수 있습니다.</li>
	<li>섬유 광학 현미경 illuminator 끄고 빨간 형광 (Ex545 nm/Em 605 nm) tdTomato 식 시각화에 대 한 필터를 설정.</li>
	<li>다시 필요한 경우에 이미지의 초점을 조정 합니다.</li>
	<li>밝기 및 대비 조정, 빨간 형광 노출 걸릴 하 고 여러 이미지를 캡처하십시오. 참고: 다음 이미지 설정에 일반적으로 사용 되었다: 1 s 노출 시간, 이득, 1.0 채도 및 1.0 감마 보정 x 2. 최적의 설정은 각 실험에 대 한 최적화가 필요 합니다. 최적의 설정은 결정 되 면 같은 설정을 전체 실험에 사용할 필요가 있다.</li>
</ol>3입니다. 유전형
<ol><li>1.12 100 ° c.에서 1 h 단계에서 샘플을 끓여</li>
	<li>(40 mM Tris HCl, pH 5.5) 11,360 x g, 버퍼 B의 20 µ L와 함께 상쾌한 새로운 1.5 mL 튜브에의 전송 20 µ L에서 2 분 동안 centrifuge과 그들을 믹스.</li>
	<li>DNA 템플렛으로 3.2 단계에서 혼합된 상쾌한의 4.5 µ L, 0.5 µ L의 특정 앞으로 각각의 결합 및 역방향 뇌관 (10 µ M), 미리 혼합된 중 합 효소와 반응 버퍼 (2 배)의 10 µ L ( 재료의 표참조), 다음 물 총 v에 추가 20 µ L. 뇌관 시퀀스의 olume는 아래에. F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3' R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3' F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3' R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3'</li>
	<li>다음 PCR 프로그램 (표 1 및 표 2) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 실행 합니다.</li>
	<li>샘플 및 DNA 사다리 140 V 25 분에 대 한 1 x TAE (트리 스-아세테이트-EDTA) 버퍼 (40mm 트리 아세테이트 및 1 mM EDTA)에 1 %agarose 젤에 PCR 밴드의 크기를 추정 100 bp DNA 사다리를 사용 PCR을 실행 합니다.</li>
	<li>DNA 젤을 DNA 밴드를 식별 하는 UV 빛 UV transilluminator에 놓습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial lineage development.</a> Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).</li>
<li>Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation.</a> Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).</li>
<li>Lee, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain-2+luciferase+transgenic+mice+reveal+distinct+regulatory+programs+for+cardiac+and+skeletal+muscle-specific+expression+of+a+single+contractile+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+requirement+of+myosin+light+chain+2v+in+embryonic+heart+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).</li>
<li>Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HF-1a%2FHF-1b%2FMEF-2+combinatorial+element+confers+cardiac+ventricular+specificity+and+established+an+anterior-posterior+gradient+of+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression.</a> Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).</li>
<li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber+formation+and+morphogenesis+in+the+developing+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart.</a> Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).</li>
<li>Wu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+identity+is+determined+by+a+COUP-TFII+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network.</a> Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).</li>
<li>Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irx4+identifies+a+chamber-specific+cell+population+that+contributes+to+ventricular+myocardium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development.</a> Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).</li>
<li>Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chamber-specific+gene+expression+in+the+developing+heart+by+Irx4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4.</a> Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).</li>
<li>Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O'Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber+specification+of+atrial+myosin+light+chain-2+expression+precedes+septation+during+murine+cardiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).</li>
<li>Bardot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TAF10-containing+TFIID+and+SAGA+transcriptional+complexes+are+dispensable+for+early+somitogenesis+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo.</a> Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., Nam, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+MLC-2v-tdTomato+knock-in+reporter+mouse+line%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line.</a> Genesis. , (2018).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li>
<li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+HCN4%2B+cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li>
<li>O'Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+specification+of+ventricular+myosin+light+chain+2+expression+in+the+primitive+murine+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 설명 하는 방법을 심 실 또는 심장 관련 구조 유전자 또는 단백질을 많은 실험을 수행 하지 않고 심 실 챔버 개발 검토를 상대적으로 간단 하다. 따라서,이 메서드는 immunostained 심장 섹션에서 종종 발견 된 기술 variabilities 최소화 합니다.
쥐의 배아 나이 그리고 미 발달 심 혼의 해 부의 정확한 평가 포함 하 여이 메서드를 성공적으로 수행 하기 위한 두 개의 중요 한 단계가 있습니다. 우리는 실질적으로 질을 식별 하 여 생쥐의 배아 나이 여성 쥐에 플러그 예상. 그러나, 질 플러그의 존재는 반드시 임신을 표시 하지 않습니다. 만 성교는 대략 8 ~ 24 h 기간 내 발생 했음을 나타냅니다. 질 플러그를 발견 하는 경우에 그것은 종종 마우스 실제로 임신 여부 10 월 11 일 때까지 게시물 coitum 여성 쥐의 복 부를 검사 하 여 결정 어렵다. 남성 및 여성 쥐의 여러 쌍을 사육 마우스의 예상된 나이 배아를 안전 번 식 전략 이다. 쥐 심 혼 그들...

챔버 형성 심장 개발 하는 동안 여러 형태학 상으로 다른 배아 단계1,2를 통해 전환 복잡 한 과정 이다. 심장 조상 인구 셀의 초승달 모양 선형 심장 튜브를 형성 하 고 신장 및 개발 중심의 나선형 모양을 형성에 반복을 겪 습. 그것의 septation 과정 후 개발 심장 4 연 발 심장으로 변화 됩니다. 이러한 프로세스의 중단 발달 심장 결함 발생합니다. 따라서, 챔버 형성 심장 개발 하는 동안 기본 분자 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 하다. 수많은 이전 연구 심장 발달에,에 불구 하 고이 복잡 한 과정의 우리의 이해 제한 된 남아 있습니다.
제자리 교 잡, immunohistochemistry, 및 베타-galactosidase 얼룩 LacZ 기자 마우스를 사용 하 여 널리 사용 된 특정 심장 또는 챔버 특정 구조 유전자의 라벨 마우스 심장 개발 동안 챔버 형성 연구 또는 단백질 (예를 들어, Nppa 쿠데타-TFII, Irx4, MLC-2a, MLC-2v)3,,45,6,7,8,9,10. 그러나, 이러한 실험 마우스 배아를 사용 하 여 필요 상당한 시간과 전문성, 여러 다른 실험적인 단계 될 필요가 있기 때문에11을 순차적으로 수행. 여기, 우리 개발 심 배아 MLC-2v-tdTomato 기자 노크 쥐12에서 해 부를 사용 하 여 시각화 하는 간단한 전체 마운트 epifluorescent 현미경 메서드를 설명 합니다. 이전에 사용한 방법에 비해이 방법의 장점은 종종 실험의 유사 콘텐츠를 만들 수 있습니다 복잡 한 실험 단계를 피하기 위해입니다. 이 프로토콜의 주요 목적은 마우스 배아와 마음을 개발 해 부 하 고 지루한 조직화 학적인 실험 없이 마우스 심장 챔버 개발의 각 단계를 검사 하는 방법을 설명 하는 것 이다. 이 방법은 심장 개발 초기 심장 마커 라벨 다른 다양 한 유전자 변형 마우스 라인을 사용 하 여 평가에 쉽게 적용할 수 있습니다 (예: Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre:로 사 산 /mG14, Nkx2-5Cre:로 사 산/mG14, Hcn4 eGFP15, Isl1Cre:로 사 산/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15및 TgMef2c-AHF-GFP16 쥐).

<table><tbody><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>MZ125</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder (100 bp)</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>epifluorescence dispirating microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green master Mix</td><td>Promega</td><td>M712</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine (master cycler)</td><td>Eppendorf</td><td>6336000023</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 산 epifluorescence를 사용 하 여 마우스 embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

이 프로토콜의 목표 마우스 태아의 해 부 및 배아 마우스 심 실 챔버의 심장 개발 심 실 특정 형광 기자 노크에서 마우스 (마우스 MLC-2v-tdTomato)를 사용 하 여 시각화 하는 방법을 설명 하는 것입니다. 심장 개발에는 선형 심장 관 형성, 루핑, 심장 관 및 4 챔버 septation 포함 한다. 이러한 복잡 한 프로세스는 매우 모든 척추 동물에 보존 됩니다. 마우스 배아 심장 심장 발달 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나, 그들의 매우 작은 크기로 인해, 마우스 미 발달 심 혼을 해 부 기술적 도전 이다. 또한, 종종 심장 챔버의 시각화 제자리 교 잡, 베타-galactosidase LacZ 기자 쥐, 또는 sectioned 미 발달 심 혼의 immunostaining를 사용 하 여 얼룩을 해야 합니다. 여기, 우리는 쥐 미 발달 심 혼 부 직접 심 실 챔버 형성 MLC-2v-tdTomato 마우스 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법으로 직접 검사 심장 관 형성 및 반복, 마우스 배아의 추가 실험 조작 없이 4 개의 챔버 형성 가능 하다. MLC-2v-tdTomato 기자 노크 마우스 라인은 사용 하지만이 프로토콜에 예를 들어,이 프로토콜 다른 심장 특정 형광 성 취재 원 유전자 변형 마우스 라인에 적용할 수 있습니다.

심장 개발, MLC-2v는 심 실 챔버 사양17에 대 한 초기 마커 간주 됩니다. 그림 1에서 같이, 우리가 마우스 전체 배아 및 배아 마음 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에서 마우스에서 해 부 하 고 MLC-2v-tdTomato 기자 식 심장 개발 중 시험. MLC-2v-tdTomato 쥐 노크에서 기자, 개발 마음에 제정 tdTomato 식 epifluorescence 전체 마운트 영상 통해 시각 이다 이르면 E8.012 (그림 2). E8.0에서 선형 심장 튜브에 tdTomato의 상대적으로 약한 표현이 된다 E8.5에 강한. E10.5에서 MLC-2v-tdTomato 기자 식 시연 했다 반복된 해 부 심장의 심 실 부분에 전체 마우스 배아에서 유입 관, 유출 관 또는...

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

이 방법을 사용하여 마우스 배아의 추가 실험 조작 없이 심장 관 형성, 루핑 및 전체 챔버 형성을 직접 검사할 수 있습니다. 비록, 우리는 예를 들어 MLC-2v-tdTomato 마우스를 사용하지만, 이 간단한 방법은 널리 다른 형광 기자 마우스 라인과 함께 사용될 수있다. 이 프로토콜의 주요 장점은 매우 간단하며 복잡한 기술이나 장비가 필요하지 않다는 것입니다.일반 랩 설정에서 수행할 수 있습니다. 남성 마우스와 여성을 짝짓기 후, MLC-2v-tdTomato 8 받는 사람 10 주, 매일 아침 질 플러그댐을 확인. 임신 한 댐을 누워, 다른 일에 안락사 후 coitum, supine 위치에 70 %에탄올로 복부를 스프레이.날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 피부와 복벽의 절개에 의해 복강을 엽니 다. 복강의 등쪽 에서 양측 자궁 뿔을 찾은 후, 날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 자궁 전체를 분리하여 양쪽의 oviducts 위로 조심스럽게 자른다. 해부된 자궁 전체를 얼음 차가운 PBS가 있는 10센티미터 페트리 접시에 놓습니다.날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 자궁 경적을 따라 각 양수 주머니를 조심스럽게 분리하십시오. 핀셋을 사용하여 각 배아를 얼음 차가운 PBS로 채워진 35mm 배양 판으로 옮춥습니다. 날카로운 외과 가위와 집게를 사용하여 양수 주머니를 열고 탯줄을 잘라각 배아를 노출한 다음 배아를 손상시키지 않고 가능한 한 많은 배아 조직을 다듬습니다.광섬유 현미경 조명기를 가진 해부 현미경의 밑에, 태아의 머리를 잘라 내고 1.5 밀리리터 의 완충 A를 가진 1.5 밀리리터 관으로 전송하는 것은 나중에 지노티핑을 위한 epifluorescent 화상 진찰의 결과와 상관관계를. 미세 한 집게를 사용 하 여 배아의 가슴을 엽니다. 날카로운 수술 가위와 집게로, 폐와 혈관에서 멀리 심장을 제거합니다.핀셋을 사용하여 해부된 배아 심장을 PBS를 사용하여 35밀리미터 배양 판으로 옮기습니다. 상형광 해부 현미경 아래에 마우스 배아 심혼으로 접시를 놓습니다. 심실개발이 심사관을 마주하고 있는 것과 같은 배아 심혼을 배치하기 위하여 미세한 집게를 사용하십시오.밝은 필드 모드에서 0.63배의 목표를 사용하여 초점을 조정합니다. 밝은 필드 노출을 취하고 여러 이미지를 캡처합니다. tdTomato 발현을 시각화하려면 광섬유 현미경 조명기를 끄고 적색 형광필터를 설정합니다.필요한 경우 이미지 의 초점을 재조정하고 밝기와 대비를 조정하고 적색 형광 노출을 취하고 여러 이미지를 캡처합니다. 배아 지노피의 경우 이전에 분리된 헤드 샘플을 완충 A에서 섭씨 100도에서 30분 동안 끓입니다. 11, 360회 G.Transfer 20 마이크로리터에서 버퍼 B와 혼합20 마이크로리터가 있는 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 2분간 원심분리기를 합니다.혼합 된 상체체의 4.5 마이크로 리터를 DNA 템플릿으로 사용하고 10 마이크로 몰라 특정 전방 및 반전 프라이머 각각의 0.5 마이크로 리터, 2x pre혼합 폴리머라제 및 반응 버퍼의 10 마이크로 리터와 결합한 다음 총 20 마이크로 리터에 물을 추가하십시오. 원고에 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 완성된 반응을 100개의 베이스 페어 DNA 사다리에 1%아가로즈 젤에 적재하고 1x TAE 버퍼에서 25분 동안 140볼트로 실행한다.완성된 젤을 UV 트랜길루미나이터에 놓고 UV 광을 켜면 DNA 밴드를 식별합니다. MLC-2v는 심장 발달 도중 심실 챔버 사양을 위한 초기 마커로 여겨됩니다. MLC-2v-tdTomato 기자 노크인 마우스에서, E8.0에서 선형 심장 관에서 tdTomato의 상대적으로 약한 발현은 배아의 전체 마운트 에피플루센트 이미징을 사용하여 나타난 바와 같이 E8.5에서 강해진다.해부된 심혼의 전체 마운트 에피플로스테센트 이미징을 사용하여 마우스 심장 발달 시 심실 챔버 형성을 쉽게 결정할 수 있습니다. E10.5에서 전체 마우스 배아로부터 해부된 심혼에서 MLC-2v-tdTomato 리포터 발현은 유입로, 유출로 또는 미래의 아트리아가 아닌 심장의 심실 부에서 나타났다. E12.5에서 E13.5까지, tdTomato 리포터는 4챔버 심장의 심실에서 독점적으로 표현됩니다.유사한 심실 특이적 발현 패턴은 E16.5에서 해부된 마우스 배아에 나타났다. 전체 이미징 후, 배아의 유전자형은 PCR 유전자노티핑을 위한 프라이머 2세트를 사용하여 결정되었으며, tdTomato 노크인 알렐, 이종수구및 야생형 배아를 운반하는 동형제 배아를 확인한다. 이 방법은 매우 간단하고 수행하기 쉽습니다.중요한 단계는 배아 심혼을 해부하는 것입니다. 심장 발달 도중 심장 해부학을 이해하는 것은 전체 태아에서 심혼을 성공적으로 격리하기 위하여 필요합니다.

analysis-cardiac-chamber-development-during-mouse-embryogenesis-using

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

심장 개발에 영향을 미치는 유전자 변경을 공부할 때 태아 및 perinatal 죽음은 일반적인 기능입니다. 고주파 초음파 이미징은 2-D 해상도를 개선하고 조기 심장 개발에 우수한 정보를 제공 할 수 있으며 죽기 전에 심장 구조와 기능에 미치는 영향을 감지 할 수있는 이상적인 방법입니다.

손쥐 태아 Echocardiography

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

우리는 광 클리어런스 및 초점 현미경이어서 표준 면역 염색 방법을 이용하여, E15.5까지 온 뮤린 배아 하트 관상 혈관의 분석 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 직렬 섹션 시간 소모 분석 할 필요없이 전체에 걸쳐 심장 혈관의 시각화를 가능하게한다.

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

Echocardiographic 시험 쥐에서 자주 사용 됩니다. 비싼 고해상도 초음파 장치가이 목적을 위해 개발 되었습니다. 이 프로토콜에서는 심장 형태를 결정 하는 조직학 형태학 분석 함께 저렴 한 echocardiographic 절차를 설명 합니다.

마우스의 심장 형태학의 echocardiographic 및 조직학 검사

여기, 우리는 전체 마운트 면역 형광 검사 및 초기 단계 마우스 배아의 양적 volumetric 분석 이미지 기반에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 질적 및 양적 개발, 심장 구조를 평가 하 고 다른 기관 체계에 광범위 하 게 적응할 수 있을 수 있습니다 제안에 대 한 강력한 접근으로이 방법을 제시.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

이 프로토콜에서는 선천성 심장 결함과 관련된 마우스의 발달 표현형을 정성적및 정량적으로 분석하는 절차를 설명합니다.

정성적 및 정량적 조직학적 방법을 사용하여 마우스 배아의 선천성 심장 결함 분석

고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

이 기사에서는 태아 심 초음파, 부검 및 episcopic confocal 현미경 (ECM)을 사용한 episcopic 형광 이미지 캡처 (EFIC)를 사용한 쥐 선천성 심장병 (CHD) 진단 방법에 대해 자세히 설명합니다.

태아 마우스의 구조적 심장 결함을 특성화하는 파이프라인

배우세요 전체 산 에피플루오레센스 현미경법을 사용하여 MLC-2v-tdTomato 형광 리포터 마우스에서 심장 챔버 형성을 관찰하는 방법을. 이 간단한 프로토콜은 복잡한 장비 없이 심장 발생을 연구하는 데 활용됩니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

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