전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석
April 17th, 2019
우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.
이 방법을 사용하여 마우스 배아의 추가 실험 조작 없이 심장 관 형성, 루핑 및 전체 챔버 형성을 직접 검사할 수 있습니다. 비록, 우리는 예를 들어 MLC-2v-tdTomato 마우스를 사용하지만, 이 간단한 방법은 널리 다른 형광 기자 마우스 라인과 함께 사용될 수있다. 이 프로토콜의 주요 장점은 매우 간단하며 복잡한 기술이나 장비가 필요하지 않다는 것입니다.
일반 랩 설정에서 수행할 수 있습니다. 남성 마우스와 여성을 짝짓기 후, MLC-2v-tdTomato 8 받는 사람 10 주, 매일 아침 질 플러그댐을 확인. 임신 한 댐을 누워, 다른 일에 안락사 후 coitum, supine 위치에 70 %에탄올로 복부를 스프레이.
날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 피부와 복벽의 절개에 의해 복강을 엽니 다. 복강의 등쪽 에서 양측 자궁 뿔을 찾은 후, 날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 자궁 전체를 분리하여 양쪽의 oviducts 위로 조심스럽게 자른다. 해부된 자궁 전체를 얼음 차가운 PBS가 있는 10센티미터 페트리 접시에 놓습니다.
날카로운 수술 가위와 집게를 사용하여 자궁 경적을 따라 각 양수 주머니를 조심스럽게 분리하십시오. 핀셋을 사용하여 각 배아를 얼음 차가운 PBS로 채워진 35mm 배양 판으로 옮춥습니다. 날카로운 외과 가위와 집게를 사용하여 양수 주머니를 열고 탯줄을 잘라각 배아를 노출한 다음 배아를 손상시키지 않고 가능한 한 많은 배아 조직을 다듬습니다.
광섬유 현미경 조명기를 가진 해부 현미경의 밑에, 태아의 머리를 잘라 내고 1.5 밀리리터 의 완충 A를 가진 1.5 밀리리터 관으로 전송하는 것은 나중에 지노티핑을 위한 epifluorescent 화상 진찰의 결과와 상관관계를. 미세 한 집게를 사용 하 여 배아의 가슴을 엽니다. 날카로운 수술 가위와 집게로, 폐와 혈관에서 멀리 심장을 제거합니다.
핀셋을 사용하여 해부된 배아 심장을 PBS를 사용하여 35밀리미터 배양 판으로 옮기습니다. 상형광 해부 현미경 아래에 마우스 배아 심혼으로 접시를 놓습니다. 심실개발이 심사관을 마주하고 있는 것과 같은 배아 심혼을 배치하기 위하여 미세한 집게를 사용하십시오.
밝은 필드 모드에서 0.63배의 목표를 사용하여 초점을 조정합니다. 밝은 필드 노출을 취하고 여러 이미지를 캡처합니다. tdTomato 발현을 시각화하려면 광섬유 현미경 조명기를 끄고 적색 형광필터를 설정합니다.
필요한 경우 이미지 의 초점을 재조정하고 밝기와 대비를 조정하고 적색 형광 노출을 취하고 여러 이미지를 캡처합니다. 배아 지노피의 경우 이전에 분리된 헤드 샘플을 완충 A에서 섭씨 100도에서 30분 동안 끓입니다. 11, 360회 G.Transfer 20 마이크로리터에서 버퍼 B와 혼합20 마이크로리터가 있는 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 2분간 원심분리기를 합니다.
혼합 된 상체체의 4.5 마이크로 리터를 DNA 템플릿으로 사용하고 10 마이크로 몰라 특정 전방 및 반전 프라이머 각각의 0.5 마이크로 리터, 2x pre혼합 폴리머라제 및 반응 버퍼의 10 마이크로 리터와 결합한 다음 총 20 마이크로 리터에 물을 추가하십시오. 원고에 설명된 대로 PCR을 실행합니다. 완성된 반응을 100개의 베이스 페어 DNA 사다리에 1%아가로즈 젤에 적재하고 1x TAE 버퍼에서 25분 동안 140볼트로 실행한다.
완성된 젤을 UV 트랜길루미나이터에 놓고 UV 광을 켜면 DNA 밴드를 식별합니다. MLC-2v는 심장 발달 도중 심실 챔버 사양을 위한 초기 마커로 여겨됩니다. MLC-2v-tdTomato 기자 노크인 마우스에서, E8.0에서 선형 심장 관에서 tdTomato의 상대적으로 약한 발현은 배아의 전체 마운트 에피플루센트 이미징을 사용하여 나타난 바와 같이 E8.5에서 강해진다.
해부된 심혼의 전체 마운트 에피플로스테센트 이미징을 사용하여 마우스 심장 발달 시 심실 챔버 형성을 쉽게 결정할 수 있습니다. E10.5에서 전체 마우스 배아로부터 해부된 심혼에서 MLC-2v-tdTomato 리포터 발현은 유입로, 유출로 또는 미래의 아트리아가 아닌 심장의 심실 부에서 나타났다. E12.5에서 E13.5까지, tdTomato 리포터는 4챔버 심장의 심실에서 독점적으로 표현됩니다.
유사한 심실 특이적 발현 패턴은 E16.5에서 해부된 마우스 배아에 나타났다. 전체 이미징 후, 배아의 유전자형은 PCR 유전자노티핑을 위한 프라이머 2세트를 사용하여 결정되었으며, tdTomato 노크인 알렐, 이종수구및 야생형 배아를 운반하는 동형제 배아를 확인한다. 이 방법은 매우 간단하고 수행하기 쉽습니다.
중요한 단계는 배아 심혼을 해부하는 것입니다. 심장 발달 도중 심장 해부학을 이해하는 것은 전체 태아에서 심혼을 성공적으로 격리하기 위하여 필요합니다.
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개요
이 기사는 MLC-2v-tdTomato 리포터 노크인 마우스를 사용한 전체 마운트 형태의 형광 현미경을 통한 마우스 심장 발달 검사 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 복잡한 조직화학 기법 없이 심실 형성 단계를 직접 시각화할 수 있게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 발달 생물학
- 심혈관 연구
배경
- 심장 발달은 발달 생물학의 중요한 연구 분야입니다.
- 심장 형태를 연구하는 기존 방법은 노동 집약적일 수 있습니다.
- 형광 리포터 마우스는 심장 구조를 시각화하는 새로운 접근 방식을 제공합니다.
- MLC-2v-tdTomato 마우스는 이러한 연구에 유용한 모델로 사용됩니다.
연구 목적
- 심장 발달 단계를 시각화하는 간단한 방법을 제공합니다.
- 발달 연구에 형광 리포터 마우스의 유용성을 시연합니다.
- 복잡한 기법 없이 연구를 용이하게 합니다.
사용된 방법
- 전체 마운트 형태의 형광 현미경.
- MLC-2v-tdTomato 리포터 노크인 마우스의 사용.
- 발달의 다양한 단계의 배아 해부.
- 일반 실험실 환경에 적합한 간단한 실험 설정.
주요 결과
- 심장 튜브 형성 및 루핑의 성공적인 시각화.
- 전체 챔버 형성의 명확한 관찰.
- 다른 형광 리포터 마우스 라인에 적용 가능한 방법.
- 프로토콜은 표준 실험실 환경에서의 사용 용이성을 입증했습니다.
결론
- 제시된 방법은 심장 발달 연구를 간소화합니다.
- 복잡한 절차 없이 중요한 단계를 시각화할 수 있게 합니다.
- 이 접근 방식은 심장 형태 형성에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of ventricular chamber formation in mouse embryos using fluorescent reporter lines, supporting early-stage target validation in cardiovascular drug discovery. By simplifying heart morphology assessment without complex histochemistry, it enhances mechanistic de-risking of developmental pathways. The approach provides predictive confidence for evaluating compound effects on cardiac morphogenesis in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular specification mechanisms using MLC-2v as an early marker for chamber development.
- Operational Value: Supports functional target validation by directly linking genetic reporters to structural heart formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline ventricular morphology.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible whole-mount epifluorescent imaging across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for studying conserved cardiac morphogenesis pathways across vertebrates.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating tdTomato expression with ventricular chamber maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling direct assessment of cardiac structural phenotypes following genetic or pharmacological perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting heart tube looping and chamber septation.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts to compare ventricular formation across experimental conditions.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based measurements of tdTomato expression to evaluate ventricular specificity.
- Translational Research: Connects early ventricular patterning to preclinical continuity through conserved developmental mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple fluorescent reporter lines beyond MLC-2v-tdTomato.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in ventricular chamber formation assessment.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized dissection and imaging protocols in regular lab settings.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on cardiac structural phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying developmental liabilities in lead compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection and cardiac anatomy identification.
- Dependent on epifluorescent microscopy with appropriate filter sets for tdTomato detection.
- Necessitates standardization of embryo staging and heart isolation procedures across users.
- Involves adaptation considerations when applying to different fluorescent reporter lines with varying expression patterns.
- Limited by the need for embryonic tissue access, restricting use to ex vivo developmental studies.
