Name: Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 배우세요 단일 분자 RNA 형광 제자리 교잡법(SM-FISH)을 사용하여 생쥐 난모세포에서 mRNA를 정량화하고 위치를 분석하는 방법을. 이 기술은 재현성 높은 데이터와 낮은 변이성을 제공하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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설치 및 사용 자리 찾아서 추적 프로그램 13 의 confocal 현미경 이미징에 대 한 대학 네브라스카 링컨 현미경 코어의 기술 지원 그의 관대 한 도움에 감사 박사 다니엘 R. 라 슨 하 고. 이 연구는 네브라스카 농업 연구 부문, 링컨, 네브라스카 대학에의 기여도 나타냅니다과 UNL 해치 자금 (코-26-206/가입 번호-232435 및 코-26-231/승인 번호-1013511)에 의해 지원 되었다.

동물 절차 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 네브래스카 링컨의 대학에 의해 승인 했다 그리고 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 이 연구에 대 한 CD-1 outbred 쥐 정상적 설치류 차 우와 물; ad libitum 접근 했다 그들은 어두운 12시 12분에 유지 되었다: 빛을 주기.
1입니다. 필요한 미디어의 준비
<ol><li>기본 미디어 (OMM), 살 균 물 100 mL를 100 mM NaCl, KCl 5mm, 0.5 m m KH2포4및 1.7 m m CaCl2-2 H2O를 추가 합니다. 참고: OMM 매체는 1 개월까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>완전 한 미디어 (OMOPS)에 대 한 추가 20 m m 3-morpholinopropane-1-sulfonic 산 (MOPS), 1.2 m m MgSO4-7 H2O, 포도 당 0.5 m m, 6mm L-젖 산, 1mm ala-gln, 황소자리, 0.1 m m 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 0.01 m m ethylenediaminetetraacetic 산 ( EDTA), 10 µ M 알파 리 포 산, 10 µ g/mL undiluted gentamicin, 21 m m 1 M NaOH, 5mm NaHCO3, 0.2 m m Pyruvate, 0.5 m m 구 연산, 1시 10분을 4 mg/mL FAF BSA OMM 100 mL의 전체 볼륨에 대 한 살 균 물에 희석. 0.22 μ M 필터 매체를 소독. 참고: OMOPS 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>보유 매체 (HM)에 대 한 OMOPS를 5% 태아 둔감 한 혈 청을 추가 합니다. 마우스 당 2 mL HM을 확인 합니다.</li>
	<li>Hyaluronidase 솔루션 1 ml 흠 소 고환에서 파생 된 hyaluronidase의 0.1 mg/mL를 추가 합니다.</li>
	<li>고정 버퍼에 대 한 4% paraformaldehyde 0.1% 태아 학년 polyvinylpyrrolidone (PVP)14함께 1 x PBS의 10 ml에서을 결합 합니다.</li>
	<li>50ml 워시 버퍼 (WB)를 준비 하려면 0.1% 비 이온 계면 활성 제 및 0.1% 추가 PBS14x 1로 PVP.</li>
	<li>준비 10 mL permeabilization 버퍼에 1 x PBS141% 비 이온 계면 활성 제를 추가 합니다. 참고: 위에서 설명한 세척 및 permeabilization 버퍼 상용 키트에서 독점 버퍼를 교체 합니다.</li>
</ol>2. 여성 쥐에서 ovulated oocytes의 수집
<ol><li>준비:<ol>
<li>나이의 5-8 주에 5 IU 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG) 5 IU 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 44-48 h 뒤의 복 (IP) 주입에 의해 자극 하는 여성 쥐 나중15,16.</li>
		<li>35 mm 접시 포함 하는 37 ° C 온난 화 접시에 HM의 2 개 mL를 유지. 하나 플라스틱, 흠 있는 100 µ L 방울 희석 hyaluronidase 3, 60 mm 페 트리 접시에 hyaluronidase 없이 HM의 50 µ L 상품 이어서. 37 ° C 온난 화 포함 상품 사용 전에 접시는 접시를 놓습니다. 참고: hyaluronidase 방울 여야 한다 각 수 란 관 쌍의 해 부 직전 증발 및 또는 hyaluronidase 없이 HM의 구성의 집중을 방지 하기 위해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스, hCG의 IP 주사 후 16 h를 안락사, 자 궁 경부 전위 뒤 isoflurane 과량을 사용 하 여.</li>
	<li>70% 에탄올을 사용 하 여 마우스를 청소 하십시오. 복 부 구멍을 노출 하 고 여성 생식 관을 시각화. 집게와 난소를 누른 자 궁 인 대 및 난소 주위에서 과잉 지방 조직을 제거 합니다. 자 궁에서 수 란 관 고 35 mm 접시에 따뜻한 HM에 난소 수 란 관 쌍을 놓습니다.</li>
	<li>난소와 모든 주변의 지방 조직을 제거 합니다. ½ 인치 27 게이지 주사 바늘을 사용 하 여 수 란 관의 부 ampulla 눈물. 눈물의 사이트에는 수 란 관을 밀어 하 고 적 운 세포 oocyte 단지 (COCs) 퇴 학 될 것입니다. II (MII) HM 미디어 hyaluronidase 입 피 펫 (그림 2)를 사용 하 여 포함 하는 100 μ를 감수 분열의 분열에서 것으로 추정 되는 ovulated oocytes를 전송 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig2.jpg"> 그림 2 : Oocytes를 전송 하는 데 사용 하는 입 pipettor의 부분. (A) 입 음, (B) 0.22 조각 4 m m 필터 (C) 흡 인기 튜브 (D) 1000 μ 피펫으로 팁 (E) 9"파스퇴르 피펫으로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="5"><li>적 운 세포를 꺼내 려 입 피 펫과 HM를 포함 hyaluronidase에서 MII oocyte-적 운 세포 복합물을 아래로 플라스틱. 각 oocyte 전송, 일단 그들은 세척을 적 운 세포 없는 드롭 포함 HM만 입 피 펫을 사용 하 여. 각 세척 물방울에 대해 이것을 반복 합니다. 조각난 또는 투명 한 oocytes15를 전송 하지 않습니다. 참고: 그것은 가능한 작은 흠으로 함께 35 mm 접시에 각 드롭에서는 oocytes를 전송 하는 것이 중요입니다. 이것은 모든 전송 프로토콜에 대 한 사실입니다. MII oocytes hyaluronidase HM 매체를 포함 하는 1 분 이상에 남아 있지 해야 합니다.</li>
</ol>3. SM-물고기 Oocytes의 얼룩
<ol><li>고정 버퍼의 500 µ L을 포함 하는 6 잘 플레이트의 개별 잘에서 oocytes를 수정. 20 oocytes 잠수함 또는 우물에서 더 적은. 실 온에서 20 분 동안 품 어. 참고: 각 SM 물고기 착 단계 6-잘 원뿔 접시에 개별 잘 내에서 발생합니다. Oocytes 버퍼에 완전히 침수 및 버퍼 위에 하지 부동 인지 확인 합니다. 각 단계는 20 oocytes 함께 이하의 각 잘에서 해야 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼 (WB 단계 1.6에서에서 설명)의 500 μ 하 고정된 oocytes를 전송 10 분. 2 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 permeabilization 버퍼에 oocytes를 품 어. 참고: 단계 1.7에서에서 설명한 permeabilization 버퍼 예 permeabilization 버퍼를 대체 합니다.<ol>
<li>프로브 세트를 수집 하 고 신속 하 게는 microcentrifuge에서 그들을 아래로 회전. 각 프로브는 40 ° C 물 목욕 이나 인큐베이터에 10 분 동안 설정 따뜻한. 실내 온도에 냉각 하십시오. 참고:이 단계는 permeabilization 외피 동안에 수행 해야</li>
	</ol>
</li>
	<li>실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 씻어.</li>
	<li>프로 테아 제 III 버퍼 (키트에서 사용 가능)를 실 온에서 30 분 동안 1 X PBS에 희석된 1: 8의 80 μ에 oocytes를 전송. 참고: 80 µ L 볼륨 6 잘 플레이트에는 개별의 하단에 적절 하 게 다루고 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 씻어.</li>
	<li>따뜻하게 프로브 세트 Nanog, Pou5f1, 및 DapB (부정적인 제어 유전자)에 대 한 희석, 프로브 희석제에 1시 50분. 40 ° c.에서 2 시간 동안 대 본 특정 조사의 80 μ에 oocytes를 품 어 참고: 각 독점 프로브 세트는 3 개의 형광 채널 (C1, C2, C3) 중 하나에. Nanog 및 Pou5f1 프로브 C2 및 C3, 각각 태그 했다.</li>
	<li>독점, 앰프 1 (앰프 1), 증폭기 2 (AMP2), 증폭기 3 (AMP3)와 증폭기 4-형광 (앰프 4-플로리다) 실내 온도 따뜻하게. 참고:이 단계는 2-시간 대 본 특정 조사 인큐베이션 기간 동안 수행 되어야 합니다.</li>
	<li>WB의 500 μ 하 여 oocytes를 전송 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>증폭 버퍼에 순차적으로 oocytes를 품 어.<ol>
<li>80 µ L AMP1의 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 40 ° C. 전송 oocytes에서 30 분 동안에 oocytes를 품 어.</li>
		<li>40 ° c.에서 15 분 동안 AMP2의 80 µ L에 oocytes를 품 어 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 전송.</li>
		<li>40 ° c.에 30 분 동안 AMP3의 80 µ L에 oocytes를 품 어 실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 전송. 참고: 프로토콜의 나머지 부분에서에서 수행 됩니다 어둠 앰프-플로리다에 fluorophore를 포함 하기 때문에. 작업할 때 해 현미경, 빛을 최대한으로 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>40 ° c.에서 15 분의 AMP4 80 μ에 oocytes를 추가 참고: AMP4 층 버퍼 A 대체로 제공 됩니다 (Alt-A), Alt-B 또는 Alt-C 파장은 원하는 어떤 방출에 따라 AMP4 층 버퍼를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실 온에서 10 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 씻어. 80 µ L DAPI의 실 온에서 20 분 동안에 oocytes를 품 어. 실 온에서 5 분에 대 한 WB의 500 µ L에 oocytes를 씻어.</li>
	<li>시에 거품을 추가 하지 않고도 슬라이드의 중심에 안티-페이딩 설치 미디어의 12 µ L 플라스틱. 설치 미디어에 가능한 작은 WB로와 oocytes를 전송 하 고는 coverslip 적용.<ol>
<li>기울기 각도에 coverslip와 천천히 그리고 부드럽게 슬라이드에 액체 위에 놓습니다. 너무 열심히 oocytes 그리고 거품의 소개의 왜곡을 방지 하는 coverslip 눌러 하지 마십시오.</li>
		<li>실 온에서 건조 하룻밤 어두운 상자에 슬라이드를 저장 합니다. Coverslip 인감 투명 매니큐어의 슬라이드의 가장자리 코트.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표준 현미경을 사용 하 여 영구 표시와 함께 슬라이드에 동그라미 oocytes를 찾을. 참고:이 단계는 필요 하지 않습니다 하지만 슬라이드 찾기 oocytes를 향상 시킵니다. 최상의 결과 얻으려면 이미지 슬라이드 형광 신호 1 ~ 5 일 이내 페이드 시작 됩니다.</li>
</ol>4. 이미지 처리
<ol><li>3 차원 oocytes, z 단계 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지. 참고: 이미지를 정확 하 게 분석 하려면 각 z 단계는 1.0 µ m/조각 이어야 한다.</li>
	<li>압축된 nd2 또는 개별 confocal 이미지를 저장 합니다. 각 oocyte의 TIFF 파일입니다. 두 이미지 유형 오픈 소스 이미지 처리 프로그램, 피지와 호환 됩니다.</li>
	<li>다운로드 및 오픈 액세스 피지 소프트웨어 (https://imagej.net/Fiji/Downloads)를 설치.<ol>
<li>피지에 nd2 파일을 드래그 하 고 hyperstack을 선택 합니다. 만약 confocal 이미지로 저장 했다. TIFF 파일 4.4 단계로 건너뜁니다. 참고: 피지에 nd2 파일은 삭제 하는 때 hyperstack 드롭다운 표시 됩니다 자동으로.</li>
		<li>이미지 탭을 클릭 하 고 색상을 선택한 분할 채널 nd2 파일의 형광 채널 분리를 클릭 합니다.</li>
		<li>개별 생성 합니다. 각 z 슬라이스 각 형광 채널에서 oocyte의에 대 한 TIFF 파일. 이미지 탭을 클릭 하 고 선택한 스택, 이미지 스택을클릭 합니다. 이미지 탭을 클릭 하 고 선택한 형식, 각 z 슬라이스 개별 RGB 컬러 이미지를 변환 하려면 RGB 색상 을 클릭 합니다. 참고: RGB 색상 인공 이며 각 방출 파장에 대 한 선택으로 원하는 될 수 있습니다.</li>
		<li>각 변환 된 이미지를 저장 합니다. TIFF 파일입니다. 단계 바느질 (4.3) 혼동을 피하기 위해 새 폴더에 각 형광 채널에 대 한 단일 oocyte에서 이미지를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 정규화. Pou5f1 및 Nanog 부정적인 제어 이미지 (DapB)를 사용 하 여 TIFF 이미지. 참고: 정규화는 사진 편집 프로그램을 사용 하 여 수행 됩니다. 각 컨트롤 이미지에서 배경 형광의 동일한 수준을 제거 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>각 정규화 오픈. 함께 각 oocyte 각 파장에 대 한 모든 z 슬라이스를 피지에 TIFF 파일.<ol>
<li>플러그인 탭을 클릭 하 고 선택한 바느질, 그리드/컬렉션 (그림 3A) 클릭. 드롭 다운 메뉴에서 확인을 클릭 합니다 (그림 3B) 순차적인 이미지 를 선택 합니다.</li>
		<li>디렉터리를 검색 하 고 포함 하는 하나의 파장에서 개별 oocyte의 z 슬라이스 이미지의 모든 폴더를 선택 (단계 4.3.4 참조). 확인을 클릭 합니다.</li>
		<li>사용 파장에 대 한 적절 한 색상 채널에 맞춘된 이미지의 하단에서 슬라이더를 이동 하 고 최종 RGB 맞춘된 이미지 이미지, 종류, 선택을 클릭 하 여 만들고 RGB 색상을 클릭 합니다. 참고:이 이미지는 4.6 아래 단계에서 설명 하는 형광 정량에 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>32 비트 최대 예상된 그림에 맞춘된 이미지를 변환 합니다. 이미지를 클릭, 종류, 선택 하 고 32 비트 (그림 3C)을 클릭 합니다. 새로운로이 이미지를 저장 합니다. TIFF 파일입니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig3.jpg"> 그림 3 : 함께 oocytes의 confocal z-시리즈 이미지의 바느질. (A) 는 oocyte의 합성 이미지를 생산 하는 데 사용 된 피지에 플러그 인 그리드/컬렉션 도구를 보여주는 스크린샷. (B) 연속 이미지 형광 겹치는 순차를 사용합니다. 합성 이미지를 생성 하기 위해 TIFF 파일입니다. (C) 복합 이미지 32 비트로 저장 되었습니다. TIFF 파일입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="7"><li>다운로드 및 설치는 자리 찾기 및 추적 프로그램13, 라 슨 박사, 국립 연구소의 건강 국립 암 연구소 (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson)에 수 사관에 대 한 웹 사이트에서 사용할 수 있는. 다운로드 및 설치는 자리 찾기 및 추적 프로그램 (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf)를 실행 하는 데 필요한 대화형 데이터 언어 (IDL) 운영 체제에 대 한 오픈 액세스 가상 컴퓨터.</li>
	<li>자리 찾기 및 추적 프로그램에서 단계 4.6 (그림 4A)에서 생성 된 32 비트, 물 렸 다 이미지를 엽니다. Localize 드롭다운 을 선택 하 고 지 방화 (그림 4B), 이미지에 숫자 명소 계산을 클릭 합니다. 참고: 계산 각 자리는 개별 mRNA를 나타냅니다. 밴드 패스와 광자 임계값 설정 화면 (그림 4B)에 표시 됩니다. 이 프로토콜에 대 한 각 임계값 설정에 대 한 기본 사용 되었다. 긍정적인 대표 및 배경 명소 (그림 4C) 표시 됩니다.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig4.jpg"> 그림 4 : 자리 Finder를 사용 하 여 mRNAs의 정량화 및 추적. (A) 개별 z-시리즈 이미지 그림 3 에 설명 된 대로 함께 봉합 되었고 예상 32 비트 최대로 저장. TIFF 파일입니다. (B) 합성 이미지 스팟 파인더와 추적에 오픈 했습니다. 지역화 형광 명소 (빨간색 상자)을 계산 하는 데 사용 했다. 밴드 패스와 광자 임계값 파란색 상자에 의해 표시 됩니다. (C) 파란색 화살표 (임계값) 긍정적인 신호를 가리킵니다. 흰색 화살표는 형광 임계값 아래 자리 표시 하 고, 따라서 계산 되지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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</ol>

저자는 아무것도 선언 하

일련의 작은 단계 프로토콜 동안 mRNAs의 성공적인 형광 및 정확한 보장 합니다. 첫째, 프로토콜 수집과 oocytes의 고정 후에 즉시 수행 되어야 합니다. Note PVP oocytes 서로에 집착 하지 않도록 4 %paraformaldehyde 고정 버퍼에 추가 됩니다. 우리 컬렉션은 oocytes의 고정 후 즉시 실험을 수행 하는 데 필요한 발견. 어떤 지연 결과 훨씬 낮은 형광 신호를 녹취 록의 undercounting 귀 착될 것입니다. 이것은 때문에 RNA 저하 부분 이다. 더 이상 20 oocytes 6 잘 플레이트 한 우물을 한 번에 전송 해야 하 고 각 잘만 사용 해야 한 번. 부 화 시간 단축 또는 각 단계의 길이 없이 정확 하 게 따라 합니다 또한. 예외는 워시 버퍼 단계; oocytes 워시 버퍼에 장기간된 시간에 대 한 실험 결과 변경 하지 않고 남아 있을 수 있습니다. SM-물고기 프로브 C1, C2, 및 C3 3 형광 채널에서 사용할 수 있습니다. 다중화, 동일한 채널 태그가 프로브를 혼합 하지 마...

역전사 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) mRNA 정량에 대 한 황금 표준 되었습니다. 2 분석 실험, 디지털 PCR (dPCR)1 과 양적, 리얼 타임 PCR (정량)2 현재 사용 됩니다. 두 개의 PCR 기법, dPCR 그것은 단일 세포에서 mRNA 풍부를 측정 하는 데 사용할 수 제안 하는 정량 보다 더 큰 감도 있다. 그러나, 우리 손에 각 실험 샘플 당 5 ~ 10 oocytes의 수영장에서 낮은 풍부 mRNAs의 dPCR 분석은 생산 데이터 낮은 재현성 및 높은 변화3. 이 RNA 추출 및 반전 녹음 방송 효율성과 관련 된 실험적인 오류로 인해 높습니다. RNA 시퀀싱도 하나의 마우스와 인간의 oocytes4,5를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 기술은 가능성이 실험적인 그룹 내의 다양성을 증가 하는 라이브러리 생성에 필요한 cDNA 증폭 단계를 해야 합니다. 또한, 낮은 풍부 성적표 감지 하지 않을 수 있습니다. 시퀀싱 가격은 지난 몇 년 동안 추락, 비록 그것은 여전히 비용 생물 정보학 분석의 높은 비용 때문에 금지 수 있습니다. 마지막으로, mRNA 지역화 단백질 기능6에 기여 하는 공간 변경 동적 과정 이다. 따라서, 우리는 정확 하 고 재현 가능한 정량적 측정 및 단일 oocytes에서 개별 mRNAs의 지역화 생성 하는 기술 채택에 밖으로 설정.
분기 DNA 형광 제자리 교 잡에서에 결합 된 개별 셀 7,,89단일 mRNAs의 증폭 RNA/cDNA 활성화 탐지 보다는 형광 신호를 증폭 한다. 분석 결과 교 잡, 증폭 (분기 DNA를 사용 하 여), 및 형광 형광 신호7증폭 하기 위하여 단계를 라벨의 시리즈를 통해 수행 됩니다. 기술은 특정 mRNA3,,810를 보완 하는 18-25 베이스 oligonucleotide 조사 쌍의 바인딩으로 시작 합니다. 15 ~ 20 프로브 쌍 대상 성적에 대 한 각 사본 보장 특이성에 대 한 설계 되었습니다. MRNA 전용 하이브리드 프리 앰프 및 증폭기 프로브 분기 구성 구성 하 옵니다. 약, 400 라벨 fluorophores 개별 mRNAs (그림 1)11의 탐지를 허용 하는 형광에 8000-fold 증가 결과로 각 증폭기에 바인딩합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> 그림 1: SM 물고기 프로토콜의 도식. 대 본 특정 조사의 순차적 교 잡 DNA 증폭기 및 mRNA 표시 대상에 fluorophore 분기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
개별 뉴런12 에 인간 유 두 종 바이러스 DNA에 자 궁 경부 암 제자리 교 잡 (SM-물고기) 지역화 된 β-말라 mRNAs에 있는 단일 분자 형광을 사용 하 여 이전 연구 라인7세포. 자리 찾기는 컴퓨터 소프트웨어 및 추적 프로그램 개별 punctate 형광 신호를 식별 하 고 각 셀3,13mRNAs의 수 척도를 성공적으로 사용 되었습니다.
신경12mRNA 검색의 결과 바탕으로, 우리 SM 물고기 quantitate murine oocytes에서 배아 낮은 풍부 mRNAs를 포함 한 성적 수준에 유용한 도구를 증명할 것을 가정 했다. 그러나, 기술은 부착 고정된 셀과 함께 사용 하기 위해 최적화와 포름알데히드 파라핀 고정 임베디드 (FFPE) 조직 단면도. Oocytes 그들은 폴 리-L-리 신을 코팅 하는 경우에 슬라이드를 준수 수 없습니다. 또한, 그들은 체세포와 직물 단면도 세포 세포의 용 해 상용 키트3독점 버퍼의 일부를 받게 될 때의 결과 보다 더 약 합니다. 이러한 과제를 극복 하기 위해 oocytes는 고정 되었고 수동으로 버퍼의 방울 사이 전송. 또한, 키트에 permeabilization 및 워시 버퍼 세포 세포의 용 해를 감소 시키기 위하여 대체 되었다. 미리 디자인 된 프로브 물고기 키트와 함께 구입 또는 특정 성적 증명서를 요청할 수 있습니다. 각 독자적인 프로브 세트는 3 개의 형광 채널 (C1, C2, 및 C3) 다중화 허용 중 하나에. 현재 실험에 murine oocytes 듀얼 스테인드과 C2 Nanog 프로브와 C3 Pou5f1 프로브를 사용 하 여 계량 했다. 이 프로브 oocytes에서 배아 Nanog 와 Pou5f1 의 보고 된 식에 따라 선정 됐다. 교 잡 단계의 결론에 oocytes 조직학 슬라이드에 응용 프로그램에 대 한 방지 페이드 설치 미디어의 방울에 배치 했다. 공초점 이미지 개별 mRNAs를 대표 하는 punctate 형광 신호 수 계량에 사용 되었다. 영상 또한 셀에 특정 mRNA의 공간적 분포를 보였다는 mRNAs를 측정 이외에 다른 RNA 정량화 방법 달성할 수 없습니다. 이 기술은 실험 그룹3사이의 중요 한 차이점을 식별 하기 위해 각 실험 그룹에 oocytes의 작은 숫자의 사용을 허용 하는 실험적인 그룹 내에서 낮은 다양성을 입증 했다.

<table><tbody><tr><td>(&플러스mn;)-&-&alpha;-Lipoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1395</td><td>Alpha Lipoic Acid</td></tr><tr><td>Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>199899</td><td>FAF BSA</td></tr><tr><td>BD 10mL TB 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>10 mL 주사기</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305109</td><td>27 1/2 게이지 바늘</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7902</td><td>CaCl2-2H2O</td></tr><tr><td>구연산</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2404</td><td>구연산</td></tr>염 <tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G6152</td><td>포도</td></tr>당 <tr><td>인산</td><td></td><td></td>이나트륨 <td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>쉬운 그립 페트리 접시</td><td>팔콘 코닝</td><td>351008</td><td>35mm 접시</td></tr><tr><td>에데테이트 디소듐</td><td>아반토르</td><td>8994-01</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>엑스트라 파인 본 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14084-08</td><td>스트레이트, 샤프/샤프, 톱니 모양이 아닌 13mm 커팅 엣지 가위</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>애틀랜타 생물학 제제</td><td>S10250</td><td>FBS</td></tr><tr><td>겐타마이신 시약 용액</td><td>gibco</td><td>15710-064</td><td>겐타마이신</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X)</td><td>gibco</td><td>35050-061</td><td>글루타맥스</td></tr><tr><td>골드 씰 마이크로 슬라이드</td><td>골드 씰</td><td>3039</td><td>25 x 75mm 슬라이드</td></tr><tr><td>성선 자극 호르몬, 임산부 암말 세럼</td><td>시그마</td><td>G4877</td><td>eCG</td></tr><tr><td>hCG 재조합</td><td>NHPP</td><td>AFP8456A</td><td>hCG</td></tr><tr><td>히알루로니다아제, 유형 IV-S: 소 고환에서</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3884</td><td>히알루로니다제</td></tr><tr><td>보석 세공 스타일 집게</td><td>Integra</td><td>17-305X</td><td>집게 4-3/8", 스타일 5F, 스트레이트, 마이크로 파인 턱</td></tr><tr><td>L-(+)-젖산, 유리 산&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>190228</td><td>L-Lactate</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>MgSO4-7H2O</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-025-Cl</td><td>NEAA</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-C</td><td>25 x 25x 0.15 mm 커버 슬립</td></tr><tr><td>Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope 프로브</td><td>고급 셀 진단</td><td>501891-C2</td><td>나노 프로브</td></tr><tr><td>Mm-Pou5F1-O1-C3 RNAscope 프로브</td><td>고급 셀 진단</td><td>501611-C3</td><td>Pou5F1 프로브</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td>파라포름알데히드</td></tr><tr><td>PES 0.22 um 멤브레인 -sterile</td><td>Millex-GP</td><td>SLGP033RS</td><td>0.22 um 필터</td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리</td><td>돈 시그마-알드리치</td><td>P0930</td><td>PVP</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>60128</td><td>KCl</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>60218</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Prolong Gold 안티페이드 시약</td><td>invitrogen</td><td>P36934</td><td>안티페이드 시약 DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope DAPI</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320858</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320852</td><td>Amplifier 1</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320853</td><td>Amplifier 2</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 3</td><td>Advanced 세포 진단</td><td>320854</td><td>증폭기 3</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT A</td><td>고급 세포 진단</td><td>320855</td><td>증폭기 4 ALT A</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT B</td><td>고급 세포 진단</td><td>320856</td><td>증폭기 4 ALT B</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT C</td><td>고급 세포 진단</td><td>320857</td><td>증폭기 4 ALT C</td></tr><tr><td>RNAscope 형광 다중 검출 시약 키트</td><td>고급 세포 진단</td><td>320851</td><td>FISH 시약 키트</td></tr><tr><td>RNAscope 프로브 3-plex 음성 대조군 프로브</td><td>고급 세포 진단</td><td>320871</td><td>음성 대조</td></tr>군 <tr><td>RNAscope 프로브 3-plex 양성 대조군</td><td>고급 세포 진단</td><td>320881</td><td>양성 대조</td></tr>군 <tr><td>RNAscope 프로브 희석제</td> 고급 <td>세포 진단</td><td>300041</td><td>프로브 희석제</td></tr><tr><td>RNAscope 프로테아제 III</td><td>고급 세포 진단학</td><td>322337</td><td>프로테아제 III</td></tr><tr><td>RNAscope 프로테아제 III & IV 시약 키트</td><td>, 고급 세포 진단</td>, <td>322340</td><td>FISH, 프로테아제 키트</td></tr>, <tr><td>RNAscope, 프로테아제 IV</td>, <td>고급 세포 진단</td><td>, 322336</td><td>프로테아제 IV</td></tr><tr><td>S/S 니들, Luer Hub 30G</td><td>Component Supply Co.</td><td>NE-301PL-50</td><td>무딘 30 게이지 바늘</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S6297</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S6191</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>306576</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨, > = 99 %</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>P5280</td><td>피루브</td></tr><tr><td>산 용액 6 웰 디쉬</td><td>Agtechinc</td><td>D18</td><td>6 우물 접시</td></tr><tr><td>타우린</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T8691</td><td>타우린</td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>팔콘 코닝</td><td>353002</td><td>60mm 접시</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>X100</td><td>트리톤 X-100</td></tr></tbody></table>

murine oocytes에 계량 및 방화 mrnas 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (sm-물고기)의 사용

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

정기적으로 oocytes에서 배아 mRNA를 측정 하는 데 사용 하는 현재 방법 디지털 역 전사 연쇄 반응 (dPCR), 양적, 실시간 RT-PCR (RT-정량) 및 RNA 시퀀싱 포함 됩니다. 이러한 기술은 단일 oocyte 또는 배아를 사용 하 여 수행 됩니다, 낮은 복사 mRNAs 안정적으로 검색 되지 않습니다. 이 문제를 해결 하려면 oocytes 또는 배아 수 수 풀링된 함께 분석; 그러나,이 종종 샘플 중 높은 가변성에 이어집니다. 이 프로토콜에서 우리 형광 제자리 교 잡 (물고기) 분기 DNA 화학을 사용 하 여의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 개별 셀에서 mRNAs의 공간적 패턴을 식별합니다. 기술은 자리 찾아서 추적 컴퓨터 소프트웨어와 결합 되어 때 셀에서 mRNAs의 풍부도 측정할 수 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 실험적인 그룹에서 감소 변화 이며 적은 oocytes 및 배아 실험 그룹 간의 중요 한 차이 검출 해야. 상업적으로 사용 가능한 분기 DNA SM-물고기 키트 sectioned 조직 또는 슬라이드에 부착 세포 mRNAs를 검색에 최적화 되었습니다. 그러나, oocytes 효과적으로 슬라이드에 고착 하지 않는다 고 일부 시 약 키트에 oocyte 세포의 결과로 너무 가혹 했다. 이 세포의 용이 해를 방지 하기 위해, 물고기 키트 여러 수정 되었다. 특히, oocyte permeabilization 및 워시 버퍼를 oocytes와 태아의 면역 형광을 위한 독점 버퍼를 교체 했습니다. Permeabilization, 세척, 그리고 프로브와 앰프 외피 6 잘 플레이트에서 수행한 고 oocytes 슬라이드 설치 미디어를 사용 하 여 프로토콜의 끝에 배치 했다. 이러한 수정 상용 키트, 특히, oocyte 세포의 한계를 극복할 수 있었다. 정확 하 게 그리고 reproducibly 개별 oocytes에서 mRNAs의 수를 계산, 컴퓨터 소프트웨어 사용 되었다. 함께,이 프로토콜 PCR 및 시퀀싱을 비교할 단일 셀에 특정 성적 표현 하는 대안을 나타냅니다.

프로토콜 완료 되 면 결과 (그림 4A , 그림 5), 맞춘된 이미지 (그림 4C), confocal z 시리즈에서 개별 이미지를 있을 것입니다 그리고 mRNA 계산 (그림 4B). 다중화를 수행 하는 경우 또한 병합 된 이미지를 보여주는 두 개의 다른 mRNAs (그림 5)에 대 한 레이블이 있을 것입니다. MRNA 카운트 피지 (그림 3) 에 의해 생성 된 스티치 이미지와 자리 찾기 및 추적 프로그램 ...

Reproducibly 개별 oocytes, 단일 분자 RNA 형광 제자리에서 mRNAs의 숫자를 카운트를 교 잡 (RNA-물고기) 비 부착 한 세포에 대 한 최적화 되었다. Oocytes 수집 했다, 대 본 특정 프로브 때 교배 하 고 이미지 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 계량.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

이 기술은 지역화뿐만 아니라 개별 난모세포 및 배아에서 후보 mRNA의 양도 허용합니다. PCR을 포함한 다른 분석법과 비교하여 이 기술의 완성으로 인해 변동이 낮은 재현 가능한 데이터가 생성됩니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 켈시 팀메 (Kelsey Timme)가 될 것입니다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 5~8주에 필요한 물질 및 여성 마우스의 준비로 이 절차를 시작합니다. 70%에탄올을 사용하여 마우스를 청소하십시오. 복강을 노출하고 여성 생식 기관을 시각화합니다.난소를 집게로 잡고 난소 주위에서 자궁 인대와 과도한 지방 조직을 제거하십시오. 자궁에서 oviduct를 잘라. 그런 다음 난소 oviduct 쌍을 35 mm 접시에 따뜻한 홀딩 배지에 놓습니다.난소와 주변 지방 조직을 제거합니다. 반 인치 27 게이지 바늘을 사용하여 oviduct의 부어 오른 앰풀라를 찢습니다. 눈물의 부위에 oviduct를 밀어 내고 적수 세포 난낭 복합체가 추방됩니다.구강 파이펫을 사용하여 배란된 난소세포를 히알루로니다아제로 보유 하는 매체를 포함 하는 100 마이크로 리터 드롭에 전송. 적혈구를 제거하기 위해, 메타상 2 개의 난낭 수중 세포가 구강 파이펫으로 배지를 보유하는 히알루로니다제에서 위아래로 복합체를 피펫한다. 적혈구가 없는 후에는 입 파이펫을 사용하여 각 난미세포를 매미만 포함하는 세척 방울로 옮깁니다.각 세척 액적당이 반복됩니다. 조각화되거나 투명한 난모세포는 전송하지 마십시오. SM-FISH 염색을 수행하려면 먼저 고정 버퍼 500 마이크로리터를 포함하는 6개의 웰 플레이트의 개별 우물에서 난모세포를 수정합니다.우물에 20 개의 난모세포 이하를 잠급하십시오. 실온에서 20분 동안 고정 버퍼에 난모세포를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 난모세포를 세척한 후, 실온에서 30분 동안 충혈 버퍼로 난모세포를 배양한다.또 다른 세척후, 전액을 80 마이크로리터로 옮기면 실온에서 30분 동안 3개의 버퍼를 미리 희석한 프로테아제3버퍼로 옮깁니다. 나노그, Pou5f1 및 DapB에 대한 온난한 프로브 세트를 프로브 희석제에서 1~50으로 희석합니다. 40섭씨에서 2시간 동안 성적증명서 의 80마이크로리터에 난모세포가 인큐베이션됩니다.난모세포가 프로브와 AMP 버퍼에 있을 때 부유하는 경향이 있습니다. 버퍼에 부드럽게 밀어 넣으면 난모를 담는 것이 필수적입니다. 난모를 500 마이크로리터의 세척 버퍼로 옮기고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.이제 증폭 버퍼에서 oocytes를 순차적으로 배양합니다. 첫째, AMP1 80 마이크로리터에서 40도에서 30분 동안 난모세포를 배양합니다. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 세척 버퍼의 500 마이크로 리터로 난모를 옮깁니다.다음으로, AMP2 의 80 마이크로 리터에서 40 °C에서 15 분 동안 난모세포를 배양합니다. 전과 같이 난모를 세척한 후, AMP3 80 마이크로리터에 40도에서 30분 동안 난미료를 배양한 다음 최종 세척을 합니다. 마지막으로, 섭씨 40도에서 15분 동안 AMP4FL 80 마이크로리터에 난모를 추가합니다.파이펫 12 마이크로리터의 안티 페이드 장착 매체는 시약에 거품을 추가하지 않고 슬라이드의 중앙에. 가능한 한 적은 세척 버퍼로 난모를 마운팅 매체로 옮깁니다. 마지막으로 커버 슬립을 적용합니다.Z 단계 공초점 현미경 을 사용하여 3 차원 난모를 이미지하고 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 이미지를 저장합니다. 피지에 ND2 파일을 드래그하고 하이퍼 스택을 선택합니다. 이미지 탭을 클릭하고 색상을 선택하고 분할 채널을 클릭하여 ND2 파일의 형광 채널을 분리합니다.각 형광 채널에서 난모세포의 각 Z 조각에 대해 개별 TIFF 파일을 생성합니다. 이렇게 하려면 이미지 탭을 클릭하고 스택을 선택하고 이미지로 스택을 클릭합니다. 그런 다음 이미지 탭을 클릭하고, 유형을 선택하고 RGB 색상을 클릭하여 각 Z 슬라이스를 개별 RGB 색상 이미지로 변환합니다.변환된 각 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 각 형광 채널에 대한 단일 난초에서 이미지를 새 폴더에 배치하여 바느질 중에 혼동을 피합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 파일을 정규화한 후 플러그인 탭을 클릭하고 스티치를 선택하고 그리드 컬렉션을 클릭합니다.드롭다운 메뉴에서 순차적 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. 디렉터리 탐색하고 한 파장에서 개별 난모세포에 대한 Z 슬라이스 이미지를 모두 포함하는 폴더를 선택합니다. 확인을 클릭합니다.스티치 이미지 의 하단에 있는 슬라이더를 사용된 파장에 적합한 색상 채널로 이동합니다. 이미지를 클릭하고, 유형을 선택하고, RGB 색상을 클릭하여 최종 RGB 스티치 이미지를 만듭니다. 스티치 된 이미지를 32 비트 최대 투영 된 그림으로 변환합니다.이렇게 하려면 이미지를 클릭하고 입력을 선택하고 32비트를 클릭합니다. 이 이미지를 새 TIFF 파일로 저장합니다. 스팟 찾기 및 추적 프로그램에서 32비트 스티치 이미지를 엽니다.드롭다운 지역화를 선택하고 로컬화를 클릭하여 이미지에 있는 스팟 수를 계산합니다. 여기에 표시된 스팟 파인더 및 추적을 사용하여 mRNA의 정량화입니다. 파란색 화살표는 임계값 위의 양수 신호를 가리킵니다.흰색 화살표는 임계값 아래에 형광 지점을 표시하므로 계산되지 않습니다. mRNA 카운트는 표준 데이터 분석 도구를 사용하여 이후에 분석되었다. 중간 Z 시리즈 이미지의 대표적인 이미지는 Pouf51 및 Nanog에 표시됩니다.메타상 2스핀dle에 정렬된 염색체의 DAPI 염색은 흰색으로 표시됩니다. 이 프로토콜에서 수집된 데이터는 775Pouf51 성적증명서와 113개의 나노그 성적증명서를 메타상 2개의 난소세포에서 보여주었습니다. 중요한 것은, 부정적인 제어 역할을 DapB 프로브로 표시되는 난모세포에서 검출된 반점이 없었다는 것입니다.비 부착 셀을 사용하는 경우 SM-FISH 키트에서 프로테아제 버퍼의 최상의 희석을 경험적으로 식별하는 것이 중요합니다. mRNA 검출은 1xPBS에서 희석되지 않은 여러 희석 프로테아제 버퍼 농도의 적정 곡선을 사용하여 테스트되었다. 이 프로토콜에 사용된 프로테아제 희석은 메타상 2oocytes에서 Pouf51 mRNA의 평균 형광 발현에서 가장 낮은 변이를 보였기 때문에 1-8이었다.표적 단백질의 동시 면역 형광은 RNA 결합 단백질과 mRNA를 공동국화하기 위해 수행될 수 있다. RNA 결합 단백질과 mRNA의 공동 국소화는 조사자가 oocyte 또는 태아 내의 mRNA 저장, 번역 및 분해를 조절하는 메커니즘을 결정할 수 있게 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

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형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

단일 분자 RNA 형광은 시투 혼성화(smFISH)에서 단일 세포 수준에서 특정 RNA의 수준 및 국소화를 정확하게 정량화하는 방법이다. 여기서는 특정 RNA의 단일 세포 정량화를 위한 습식 벤치 처리, 이미징 및 이미지 분석을 위한 검증된 실험실 프로토콜을 보고합니다.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

초파리 는 근육 형성을 조절하는 주요 분자를 연구하기 위한 잘 정립된 모델입니다. 그러나 현재의 방법은 mRNA 전사 역학 및 세포융합 내 공간 분포를 결정하기에 충분하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 RNA 형광 in situ hybridization 방법을 최적화하여 단일 분자 규모에서 mRNA를 검출하고 정량화할 수 있습니다.

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

이 프로토콜은 생쥐 난모세포 시스템의 핵 모양과 내부 막이 없는 세포 소기관에 대한 세포골격의 물리적 영향을 문서화하기 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 이 프레임워크는 다른 세포 유형 및 컨텍스트에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

공간 규모에 걸쳐 마우스 난모세포핵의 세포골격 기반 교반 캡처

배우세요 단일 분자 RNA 형광 제자리 교잡법(SM-FISH)을 사용하여 생쥐 난모세포에서 mRNA를 정량화하고 위치를 분석하는 방법을. 이 기술은 재현성 높은 데이터와 낮은 변이성을 제공하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

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