Name: 대만 박쥐 인구의 Lyssavirus 감시를위한 표준 운영 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 배우세요 대만 박쥐 인구에서 리사바이러스 감시를 위한 표준 실험실 운영 절차를. 이 방법은 연구자들이 2016년부터 2018년까지 네 종류의 리사바이러스를 식별하는 데 도움을 줍니다.

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이 연구에서 티엔청 리, 이탕 린, 치아정 차이, 야란 리에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 보조금 번호에 의해 지원되었다 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) 동물 및 식물 건강 검사 및 검역국에서, 농업위원회, 집행 위안, 대만.

1. 리사바이러스 취급 시 안전주의사항
<ol><li>박쥐 표본을 취급하는 모든 실험실 노동자가 사전 노출 광견병 예방17을수신한다는 것을 확인합니다. 작업자의 광견병 항체 수준을 사전에 모니터링하고 6 개월마다17개월마다 다시 검사하십시오. 후속 광견병 예방 접종은 항체 수준이 0.5 IU / mL17보다낮은 사람들을 위해 필요합니다.</li>
	<li>실험실이 있는 국가의 생물 안전 규정에 따라 적합한 생물 안전 수준 실험실(예: 대만의 BSL-2 실험실 및 호주의 BSL-3 실험실)에서 다음과 같은 절차를 수행하도록 하고, 근로자는 현재 자격을 갖추었으며 적절한 개인 보호 장비를 착용합니다18. 참고 : 광견병 예방 접종은 phylogroups II 및 III18에속하는 lyssaviruses로부터 거의 또는 전혀 보호를 제공하지 않습니다. 작업자는 박쥐19에서 여러 동물성 병원균이 확인되었으며 적절한 개인 보호 장비로 적절한 생체 안전 수준 실험실 조건에서 샘플을 처리해야 한다는 사실을 알려야 합니다.</li>
</ol>2. 샘플 수집
<ol><li>약하거나 아픈 박쥐 나 시체를 발견 사용하십시오. 참고: 약하거나 아픈 박쥐는 수의학 치료 또는 연구를 위해 타이베이 의 박쥐 보존 협회에 전달되며 시체는 동물 건강 연구소에 직접 제출됩니다. 이 감시 프로그램에서는 건강한 박쥐가 안락사되지 않았습니다.</li>
	<li>박쥐 생태학자가 형태학적 특성을통해 박쥐 종을 식별20있다.</li>
	<li>이전에 발표된 절차21을사용하여 용염바이러스 양성 진단시 박쥐 종의 DNA 바코드 코딩을 수행한다.</li>
	<li>각 박쥐 시체(수집 부위, 종, 임상 징후 등)의 정보 시트를 제출합니다.</li>
</ol>3. 박쥐 표본의 부검
<ol><li>자료를 준비합니다.<ol>
<li>깨끗한 해부 보드를 준비하고 부검을 위해 멸균 흡수 패드를 놓습니다.</li>
		<li>박쥐 장기를 수집하기위한 수집 튜브를 준비합니다.</li>
		<li>일회용 핀셋과 메스를 준비하여 부검을 하십시오. 각 박쥐의 부검 사이의 도구를 변경합니다. 샘플링 중에 핀셋과 메스를 청소하기 위해 70 % 에탄올로 적셔진 면봉을 준비하십시오.</li>
		<li>FAT에 대한 두 개의 현미경 슬라이드를 준비합니다. 신선한 표본을 수집하고 조직 병리학 검사를위한 포르말린 용액에 고정하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부검하기 전에 모든 외부 오리피스를 검사합니다. 박쥐의 외부 특징, 특히 머리, 귀 및 날개를 사진으로 촬영하여 종 차별화를 위해 촬영합니다.</li>
	<li>구강 면봉 샘플을 수집합니다. 보드에 복부 재감에 박쥐를 놓고 핀셋으로 박쥐의 머리를 고정합니다. 메스로 칼바리아의 중간선을 따라 피부를 자르고 피부를 측면으로 당깁니다. 메스와 calvaria의 중간 선을 따라 두개골을 잘라 뇌 조직을 노출 핀셋으로 엽니 다.</li>
	<li>두개골에서 뇌 조직을 제거하고 멸균 혀 우울에 배치하고 뇌 조직에서 인상 얼룩을 합니다 (단계 4.2 참조). 신선한 뇌 조직의 작은 조각을 수집하고 조직 병리학 검사를 위해 포르말린에 고정. 핵산 추출을 위해 튜브에 남은 뇌 조직을 포함합니다.</li>
	<li>70% 에탄올로 적시고 면봉으로 핀셋과 메스를 깨끗하게 청소하여 시편 수집 사이에 유지된 조직을 제거합니다.</li>
	<li>박쥐를 등쪽 의복에 놓고 칠실라와 꼬리 뒤꿈치의 양쪽에 바늘로 보드에 고정합니다.</li>
	<li>하악골에서 항문까지 신체의 중간선을 따라 피부를 절개하십시오. 핀셋으로 피부와 기본 근육 조직을 들어 올리고 분리하십시오. 하악골 근처에 있는 타액선을 모으자.</li>
	<li>핀셋으로 흉골을 약간 들어 올리고 메스로 중간선을 따라 흉골과 복벽을 잘라냅니다. 메스로 쇄골을 잘라. 왼쪽 및 오른쪽 흉곽을 바늘로 보드에 고정하여 흉강 구멍을 엽니다.</li>
	<li>총 병변과 사후 변화의 정도를 기록합니다.</li>
	<li>핀셋과 메스를 사용하여 시체에서 내장 조직 (즉, 심장, 폐, 간, 신장, 내장)을 제거하십시오. 미래 연구에 필요한 내장 표본을 수집합니다. 참고: 중복 샘플 컬렉션을 권장합니다. 하나는 분자 진단을 위해 수집되어야 하며, 다른 하나는 바이러스 배양(22)에 대한바이러스 수송 배지의 유무에 관계없이 -80°C에서 동결되어야 한다.</li>
</ol>4. 직접 형광 항체 시험 (FAT)
<ol><li>FAT에 대한 뇌 조직의 인상 얼룩을 확인합니다. 앞서 설명한대로 FAT를 수행18,23은 다음과 같은 수정을 한다.</li>
	<li>핀셋으로 연결된 신경 조직에서 뇌 조직을 부드럽게 분리하고 뇌 조직을 멸균 혀 우울기로 옮김을 전달합니다. 뇌줄기와 소뇌를 포함한 뇌의 단면을 잘라18,23. 뇌 조직의 절단 된 표면을 가볍게 터치하여 뇌 조직의 인상 얼룩을 확인하고, 과잉 조직을 제거하기 위해 렌즈 조직에 슬라이드를 누릅니다.</li>
	<li>아세톤으로 슬라이드를 -20°C에서 30분 동안 고정합니다.</li>
	<li>시판되는 두 개의 FITC-컨쥬게이트 항광견병 항체를 사용하여 염색용 리사바이러스 항원을 적극 권장하는23. 제1 염색 전에 상업용 컨쥬게이트의 작동 농도를 결정한다. 희석된 접합체를 0.45 μM 주사기 필터를 슬라이드 에 떨어뜨리고 젖은 챔버 내에서 30분 동안 37°C에서 슬라이드를 배양합니다.</li>
	<li>슬라이드에서 여분의 컨쥬게이트를 빼내고 인산완충식염수(PBS)로 슬라이드를 세척한 후 배양합니다.</li>
	<li>슬라이드에 10% 글리세롤을 소량 떨어뜨리고 커버 슬라이드로 덮습니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 슬라이드를 검사합니다.</li>
</ol>5. 핵산 추출
<ol><li>MEM-10의 적당한 부피(10% 태아 소 세럼으로 보충된 최소 필수 배지)를 뇌 조직에 추가합니다(10% w/v).</li>
	<li>균질화 기기에 5mm 강철 비드로 뇌 조직을 동형화하고 원심분리기를 825 x g에서 10분 동안 균질화합니다.</li>
	<li>핵산을 추출하는데, 그 중 최종 부피는 50 μL이며, 상용 총 핵산 추출 키트를 이용하여 상급자의 200 μL 이내인 기구를 사용한다.</li>
</ol>6. RT-PCR 및 계통유전학 분석
참고: 알려진 모든 lyssaviruses 또는 특정 리사바이러스를 검출하기 위해 여러 프라이머 세트가 게시되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 실험실에서 사용하고 모든 실험 적 요구에 맞지 않을 수 있는 예입니다. 실험실 요구에 따라 적합한 프라이머를 선택하십시오.
<ol><li>1단계 RT-PCR 시약준비: 추출된 핵산 5 μL을 10x 반응 완충액의 2.5 μL을 함유하는 반응 혼합물에 추가, 순방향 및 역방향 프라이머의 0.5 μL(각각 10μM), 4 μL 의 1.25 mM dNTP, 0.3 μL의 RNase 억제제(40 U/L)를 첨가한다. , 역전사 (10 U / μL), DNA 폴리머 라제의 0.4 μL (5 U / μL), 및 DEPC 처리 된 물의 11.5 μL의 0.3 μL. 참고 : 이 프로토콜에 사용되는 프라이머 세트는 JW12 (5'-ATGTACACCYCTACAATG-3') 및 N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTTTATATA-3')24입니다. 사용되는 프라이머 세트에 따라 시약 및 사이클링 조건의 준비를 수정합니다.</li>
	<li>다음과 같은 조건하에서 사이클링을 수행하십시오 : 42 °C에서 40 분 동안 배양; 10 분 동안 94 °C에서 초기 변성; 30s에 대한 94°C의 35 사이클, 30s에 대한 55°C, 30s에 대한 72°C; 그리고 마지막으로, 10 분 동안 72 °C에서 추가 연장.</li>
	<li>다른 프라이머 세트를 사용하여 진단 민감도를 높입니다.<ol>
<li>N113F(5'-GTAGATATATATG-3')와 N304R(5'-TTGACGAAGATTTTTTCAT-3')25,26을 사용하여 1단계 RT-PCR 시약을 준비하여 다음과 같이 사용하십시오: 추출된 핵산의 5 μL을 10x완충액의 5μlL을 함유하는 반응 혼합물에 5 μL을 첨가하십시오. 전진 및 역프라이머 (각각 4 μM), 1.25 mM dNTP의 5 μL, RNase 억제제의 0.5 μL (40 U / μL), 역 전사제의 0.2 μL (10 U / μL), DNA 폴리머 라제 (5 U / μL), 1 μL의 DNA 폴리머라제 (5 U / μL), 및 23.3 μL의 DEPC 처리 된 물.</li>
		<li>다음과 같은 조건하에서 사이클링을 수행하십시오 : 42 °C에서 40 분 동안 배양; 5 분 동안 95 °C에서 초기 변성; 35 사이클 95°C의 1분, 55°C에서 1분 및 20초, 72°C에서 1분; 그리고 마지막으로, 10 분 동안 72 °C에서 추가 연장. 참고: 실험실 의 요구에 따라 진단에 적합한 프라이머를 선택하십시오. N113F는 원래 광견병 바이러스 증폭을 위해 설계되었지만 다른 lyssaviruses에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. N113F 및 N304R 세트는 광견병 바이러스 (대만 페렛 오소리 변형) 및 대만 박쥐 리사 바이러스에 적합합니다. 상기 두 프라이머 세트 모두에 의해 리사바이러스가 증폭되는 경우 JW12 및 N304R 프라이머세트를 이용하여 전체 핵단백질 서열을 얻는 것이 더 쉬울 것이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2% 아가로즈 겔 전기동동에 대한 PCR 제품을 분석하고 UV 광 조명으로 시각화합니다.</li>
	<li>상용 시퀀싱 서비스에 의해 PCR 제품을 순서를 지정합니다.</li>
	<li>서열을 Nucleotide 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST)의 웹 페이지에 입력하거나 업로드합니다. "다른 사람 (nr 등)" 데이터베이스를 선택하고 Lyssavirus로유기체를 입력합니다. MegaBlast 알고리즘을 선택하고 BLAST를 실행합니다.</li>
</ol>7. 바이러스 격리
참고: 1) FAT 또는 2) RT-PCR이 양성을 나타내는 경우 바이러스 격리를 수행합니다.
<ol><li>MEM-10에서 10% (v) 현탁액으로 뇌 시편을 균질화합니다. 825 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>MEM-10의 1 mL에서 3 x 106 MNA (마우스 신경 아세포종) 세포의 현탁액으로 상복부 200 μL을 37 °C에서 1% CO2로 접종하였다. 뇌 균질 세포 현탁액을 25 cm2 플라스크로 옮기고 MEM-10 6 mL를 추가합니다.</li>
	<li>직경 6mm의 테플론 코팅 유리 슬라이드 4개에서 뇌 균질세포 현탁액 1 mL을 동시에 배양합니다.</li>
	<li>37°C에서 1% CO2로 3-4일간 배양한 후, 100% 아세톤(v/v)으로 4웰 슬라이드에 세포를 고정시다.</li>
	<li>4.4-4.7 단계 다음 두 FITC 공액 항 광견병 항체로 슬라이드를 얼룩. 세포는 intracytoplasmic 포함이 조사될 때 감염됩니다. 감염된 세포의 백분율을 기록합니다.</li>
	<li>슬라이드가 음수로 염색될 때 접종된 세포 배양의 트립시네화 및 하위 배양을 수행합니다.<ol>
<li>중간 부분을 제거하고 5 mL의 PBS로 플라스크를 헹구세요.</li>
		<li>플라스크에 트립신 1mL를 넣고 플라스크 바닥을 단단히 공격합니다.</li>
		<li>MEM-10 의 6 mL을 추가하고 세포를 다시 일시 중단합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 새로운 조직 플라스크 (6 mL)에 넣고 4 웰 슬라이드 (1 mL)에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>100% 감염에 도달할 때까지 7.4-7.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>배양 24 시간 후에 상급체를 수집합니다.</li>
</ol>

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<li>Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanlon%2C+CA+%22Rabies%2C+3rd+ed%22">Rabies, 3rd ed</a>. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).</li>
<li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).</li>
<li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li>
<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

이해 상충은 선언되지 않습니다.

이 실험실 표준 작동 절차 (SOP)는 대만에서 lyssavirus 항원의 존재에 대한 박쥐 샘플을 테스트하기위한 직렬 프로세스를 제공합니다. 주요 단계는 FAT 및 RT-PCR의 고용을 포함한다. 적합한 샘플의 선택과 바이러스의 성공적인 격리도 중요합니다. 또한 박쥐 라사바이러스를 모니터링하는 동안 일부 트러블슈팅이 수행되었습니다. 가장 큰 차이점은 대상 동물이었다. 처음에 (2008-2009), 박쥐 lyssavirus 감시의 대상 동물은 살아있는 박쥐, 대만의 킨멘 섬에 갇혀 다음 안락사 후 lyssavirus에 대한 테스트. 갇힌 박쥐의 대부분은 건강하고 lyssavirus를 전송할 가능성이 있었고, 모니터링에 이 접근은 인간적이지 않았습니다. 따라서 3년차에는 죽거나 죽어가는 박쥐만 수거하여 감시 지역을 지역에서 국가로 확대했습니다. 8년간의 지속적인 모니터링 끝에 대만에서 첫 박쥐 리사바이러스 사건이 마침내 발견되었습니다.
FAT는 광견병 진단을 위해 가장 널리 사용되...

속 Lyssavirus 내의 바이러스는 동물성 병원체입니다. 인간 케이스와 관련되었던 적어도 7개의 lyssavirus 종이있습니다1. 이 속의 16 종 이외에1,2,3,대만 박쥐 리사 바이러스 (TWBLV)4 및 코탈라티 박쥐 리사 바이러스5 최근 박쥐에서 확인 되었습니다., 하지만 그들의 분류 학적 상태는 아직 결정됩니다.
박쥐는 모콜라 리사 바이러스와 이코마 리사 바이러스를 제외하고 대부분의 리사 바이러스의 자연 숙주이며, 아직 박쥐1,2,3,6에서확인되지 않았습니다. 아시아 박쥐의 lyssaviruses에 대한 정보는 여전히 제한되어 있습니다. 아시아 박쥐 (인도와 태국에서 다른 하나)에서 두 개의 특성이없는 lyssaviruses7,8이보고되었습니다. 2002년에 중국에서 박쥐물린과 관련된 한 인간의 광견병 사례가 보고되었지만, 진단은 임상 관찰9에의해서만 이루어졌다. 중앙아시아에서는 1991년 키르기스스탄의 작은 쥐귀박쥐(Myotis blythi)에서아라반 리사바이러스가 확인되었고, 쿠자드 리사바이러스는 2001년 타지키스탄에서 수염박쥐(Myotismystacinus)에서확인되었다. 남아시아에서는 2015년 스리랑카의 인도 비행 여우(Pteropusmedius)에서간노루와 박쥐 리사바이러스가 확인되었다 3. 동남 아시아에서, 필리핀, 태국, 방글라데시, 캄보디아, 베트남에서 박쥐에 대한 여러 혈청학 연구는 가변 혈청 11,12,13,14, 15. 이르쿠트 리사바이러스는 2012년 중국 지린성에서 더 큰 튜브코가트(Murinaleucogaster)에서확인되었지만, 동아시아 박쥐 집단의 정확한 종과 위치는 아직 알려지지 않았다.
대만 박쥐 인구에 있는 lyssavirus의 존재를 평가하기 위하여는, 직접 FAT와 RT-PCR를 둘 다 채택한 감시 프로그램이 시작되었습니다. 대만 박쥐 리사바이러스는 2016~2017년 일본 피피스트렐(Pipistrellusabramus)4의 두 사례에서 확인되었다. 본 기사에서는 대만의 박쥐 인구의 lyssavirus 감시를 위해 실험실 표준 운영 절차가 도입되었습니다. 우리의 실험실에서 박쥐 lyssavirus 진단의 흐름도는 그림1에 제시되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2.5% 트립신(10x)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>트립신</td></tr><tr><td>25cm2 플라스크</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>VWR Life Science</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>알코올</td><td>NIHON SHIYAKU 시약</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV 역전사효소</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제(100X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>블레이드</td><td>브라운</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>에펜도르프</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>화학발광 시스템</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td>수집 튜브</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>수집 튜브</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬라이드</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>DNA 분석기</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC 광견병 방지 단클론 글로불린</td><td>Fujirebio 진단 Inc.</td><td>800-092</td><td>FITC-conjugated anti-rabies antibodys: reagent B</td></tr><tr><td>Four-well Teflon 코팅 glass slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr><tr><td>겔 전기영동 시스템</td><td>주요 과학</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>트립신</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS 광견병 FAT 시약</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>FITC-conjugated anti-rabies antibodys: reagent A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact Instrument</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM 비타민 용액</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>바늘</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 합성</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 서비스</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Stainless Steel Beads</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>멸균 흡수 패드</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq 중합효소</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>열 순환기</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>혀 압착기</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>Tweezer</td><td>Tennyson 의료기기 개발 CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>타이로신 주석산염</td><td>시그마</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

대만 박쥐 인구의 lyssavirus 감시를위한 표준 운영 절차

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

속 Lyssavirus 내의 바이러스는 동물성 병원체이고, 적어도 7개의 lyssavirus 종은 인간적인 케이스와 연관됩니다. 박쥐는 대부분의 lyssaviruses의 자연 저수지이기 때문에, 박쥐의 lyssavirus 감시 프로그램은 박쥐에 있는 이 바이러스의 생태를 이해하기 위하여 2008년부터 대만에서 실시되었습니다. 이 프로그램에서는 비정부 박쥐 보호 단체와 지역 동물 질병 통제 센터가 협력하여 약점이나 질병으로 죽어가는 죽은 박쥐 나 박쥐를 수집했습니다. 박쥐의 뇌 조직은 부검을 통해 수득되었고, 용해바이러스 항원 및 핵산의 검출을 위해 직접 형광 항체 검사(FAT) 및 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 실시하였다. FAT를 위해, 적어도 2개의 다른 광견병 진단 접합관이 추천됩니다. RT-PCR의 경우, 두 세트의 프라이머(JW12/N165-146, N113F/N304R)가 용이사바이러스 핵단백질 유전자의 부분 서열을 증폭시키는 데 사용된다. 이 감시 프로그램은 박쥐에서 lyssaviruses 및 기타 동물 성 에이전트를 모니터링합니다. 대만 박쥐 리사바이러스는 2016-2017년 일본 피피스트렐(Pipistrellusabramus)의두 사례에서 발견된다. 이 사실 인정은 박쥐 및 그밖 야생 동물을 접촉의 잠재적인 리스크의 대중, 건강 전문가 및 과학자를 알려야 합니다.

2014년부터 2017년 5월까지 13종의 박쥐 시체 332마리가 감시를 위해 수집되었습니다. 두 가지 양성 반응을 나타. 첫 번째 박쥐 의 경우, 뇌 인상은 상용 FITC-컨쥬게이트 항 광견병 항체중 하나와 FAT를 사용하여 부정적인 테스트 (그림 2), 두 프라이머 세트의 각각을 사용하는 RT-PCR 동안 (JW12 / N165-146, N113F / N304R) 산출 긍정적 인결과 (그림 3). 428 bp 의 앰플리컨 서열(N113F/N304R로 증폭되고 부분 핵단백질 유전자를 함유)를 수득하였다. 그 순서는 GenBank 데이터베이스에 의해 BLAST 쿼리를 실시하였다. 결과는 서열이 79% 미만의 정체성을 가진 lyssaviruses와유사하다는 것을 보여주었다(도 4), 검출된 lyssaviruses의 신원을 지원하는.
<p class="jove_con...

이 프로토콜은 대만의 박쥐에서 lyssavirus 항원의 진단 테스트를위한 표준 실험실 운영 절차를 소개합니다.

대만 박쥐 인구의 Lyssavirus 감시를위한 표준 운영 절차

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

리사바이러스는 동물원이 없는 병원균입니다. 대만 박쥐 인구에서 Lyssavirus의 존재를 평가하기 위해, 우리는 감시 프로그램을 시작했다. 그리고 2016년부터 2018년까지 4개의 리사바이러스를 성공적으로 확인했습니다.이 프로토콜은 대만의 vi-al Lysavirus 감시에 대한 단계별 소개입니다. 우리는 vi-al Lyssavirus 감시에 관심이있는 연구에 유용 할 수 있기를 바랍니다. 올바른 탁통 기호를 연결하는 것이 중요합니다.죽은 박쥐 또는 죽어가는 박쥐는 Lyssavirus 감시를위한 라이브 박쥐보다 더 적합합니다. 실험실이 위치한 국가의 바이오 안전 규정에 따라 적절한 생체 안전 수준 실험실에서 다음과 같은 절차를 수행합니다. 그리고 연구원이 현재 자격을 갖추고 적절한 개인 보호 장비를 착용하도록 하십시오.약하거나 아픈 박쥐 또는 시체의 수집시, 박쥐 생태학자는 표본의 형태학적 특성에 의해 박쥐 종을 식별해야합니다. 수집 부위, 종, 임상 징후 및 각 박쥐 표본과 함께 기타 관련 데이터를 포함하여 실험실에 정보 시트를 제출하십시오. 괴사 검사를 시작하기 전에 모든 외부 오리피스를 검사하고 박쥐 외부 기능, 특히 종 분화를위한 머리, 귀 및 날개를 촬영합니다.구강 면봉 샘플을 수집하려면 멸균 해부 보드에 복부 용재에 박쥐를 배치하고 핀셋으로 머리를 고정합니다. 메스를 사용하여 종아리 부위의 중간선을 따라 피부를 자르고, 피부를 측면으로 끌어당겨 종아리 부위의 중간선을 따라 두개골에 절개를 합니다. 핀셋으로 두개골을 열어 뇌 조직을 노출시키고 핀셋을 사용하여 뇌 조직을 연결된 신경 조직으로부터 부드럽게 분리합니다.뇌의 단면을 자르고 뇌 의 줄기와 소뇌를 포함한 절단을 가볍게 유리 슬라이드로 뇌 조직의 절단 표면을 터치하여 얼룩 인상을 줍니다. 렌즈 조직의 슬라이드를 눌러 과도한 조직을 제거하고 30 분 동안 영하 20도 아세톤에서 얼룩 인상 슬라이드를 수정합니다. 그런 다음 포르말린에서 조직 병리학 검사를 위해 신선한 뇌 조직의 작은 조각을 수정합니다.그리고 핵산 추출을 위해 나머지 조직을 emi-em 10에 배치한다. 다음으로, 바디의 중간선을 따라 항문에 매니폴드에서 피부를 절개하고, 핀셋을 사용하여 피부를 들어 올리고 분리하고 근육 조직을 밑줄로; 하악 뼈 근처에 있는 타액 땀샘의 수집을 허용합니다. 핀셋으로 흉골을 약간 들어 올리고 메스를 사용하여 흉골과 복부 벽을 중간선을 따라 자르고 클라비클을 자른다.바늘을 사용하여 왼쪽과 오른쪽 갈비뼈케이지를 해부 보드에 고정하여 흉부 구멍을 엽니다. 그리고 총 군단과 사후 모템 변화의 정도를 기록합니다. 그런 다음 핀셋과 메스를 사용하여 계획된 다운스트림 분석에 적합한 내장 조직을 제거합니다.고정의 끝에 직접 형광 항체 테스트를 수행하기 위해, 얼룩 인상 슬라이드를 건조하고 분석을 위해 적어도 두 개의 형광 접합 항광견 병 항체를 선택합니다. 0.45 마이크로미터 여과기를 통해 각 슬라이드에 하나의 항체를 필터링합니다. 그리고 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 30 분 동안 슬라이드를 배양하십시오.인큐베이션이 끝나면 여분의 컨쥬게이트를 빼내고 PBS로 슬라이드를 씻으십시오. 그런 다음 소량의 10%의 글리세롤을 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 장착하고 형광 현미경 으로 슬라이드를 이미지합니다. 형광 항체 검사 또는 RT-PCR 분석이 양성을 나타내는 경우, emi-en 10에서 10% 현탁액에서 뇌 표본을 균질화하고 퇴적조직은 원심분리에 의해 조직을 벼룩-리리를 날화한다.슈퍼 낫엔의 마이크로리터 200개에 3회 10~6번째 마우스 신경모세포종 세포와 37°C에서 1시간 동안 에미앙 10밀리리터를 37°C와 이산화탄소 1%로 접종하였다. 그리고 뇌균질 세포 현탁액을 25센티미터 제곱 플라스크로 옮기고, 신선한 emi-en 10의 6밀리리터를 함유한다. 직경 6mm의 테플론 코팅 유리 슬라이드로 뇌 균질 세포 서스펜션의 1 밀리리터에서 3 ~4 일 동안 섭씨 37도 및 1 %의 이산화탄소로 슬라이드를 배치합니다.100% 아세톤으로 고정한 후, 형광 항체 검사에 사용되는 것과 동일한 두 개의 형광으로 슬라이드를 염색한다. 그리고 형광 현미경 검사법에 의해 슬라이드를 시각화하여 내산성 플라스 마이크 포함의 수를 결정합니다. 표준 프로토콜에 따라 접종된 세포 배양을 트립시화 및 하위 배양한 후, 100%의 감염성에 도달할 때까지 입증된 바와 같이 감염된 세포의 수를 반복적으로 계산하여 3~4일 동안 세포 배양 배양에 감기 배양을 반환한다.2014년 1월부터 2017년 5월까지 13종의 박쥐 시체가 332마리의 시체가 수집되었습니다. 2개의 양성 박쥐 케이스의 이 대표적인 분석에서, 뇌 인상은 상업적, 적합 sy 공주 항광견 항체 중 하나를 가진 형광 항체 시험을 사용하여 부정적인 시험, RT-PCR는 각각 2개의 다른 프라이머 세트를 채택하는 동안, 긍정적인 결과를 산출했습니다. Gen bank 데이터베이스에서 스래스팅 쿼리를 폭발시키는 데 얻어진 증폭기 서열의 주관은 시퀀스가 검출된 Lysaviruses의 ID를 지원하는 79% 미만의 ID를 가진 리사바이러스와 유사하다는 것을 밝혀냈습니다.2개의 Lyssaviruses는 형광 항체 시험 및 순서에 의해 확인된 대로 그 후에 성공적으로 두 개의 두뇌에서 격리되었습니다. Lyssavirus 양성을 결정하기 위한 중요한 단계는 형광 항체 시험 및 RT-CPR 분석입니다. 프라이머 세트에서 두 개 이상의 항광견 항체를 사용하는 것이 좋습니다.Lyssavirus 이외에 다른 동물원 -비-서적인 박쥐 병원체폐쇄 진단 방법을 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 그런 다음 데이터를 사용하여 대중에게 박쥐와의 접촉을 피하는 것에 대해 알릴 수 있습니다. 우리가 박쥐 Lyssavirus를 연구할 수록, 우리는 그것의 진화와 공중 보건에 미치는 영향을 더 이해할 수 있을 것입니다.

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

이것은 야생에서 잡힌 박쥐의 게놈, 전사체 및 단백질 분석을위한 최적의 조직 준비를위한 프로토콜입니다. 그것은 박쥐 포획 및 해부, 조직 보존 및 박쥐 조직의 세포 배양을위한 프로토콜을 포함한다.

-Omics 분석 및 1 차 적인 세포 배양을 위한 박쥐의 조직 수집

dsDNA 인터칼레이팅 염료를 사용하는 이러한 실시간 RT-PCR은 리사바이러스 감염을 진단하는 데 적합합니다. 이 방법은 광견병에서 추출한 RNA로 시작하여 영양분 또는 사후 샘플로 의심되는 데, 마스터 믹스 준비, RNA 추가, 실시간 기계 설정 및 결과의 정확한 해석을 자세히 설명합니다.

광견병 진단을 위한 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

이 프로토콜은 조직 채취에서 결과 해석에 이르기까지 pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석을 보여주며, 여기에는 일부 비광견병 lyssavirus 및 lagomorphs에 대한 분석 성능을 개선하기 위한 프라이머 염기서열 및 제형 업데이트가 포함됩니다. 또한 단일 웰 LN34 다중화(LN34M) 형식에 대한 분석 설정을 시연합니다.

업데이트된 멀티플렉스 LN34 Real-Time 역전사-중합효소 연쇄 반응 분석을 통한 동물 광견병의 사후 진단

인간 아데노바이러스의 스파이크를 사용하여 소량의 물 샘플에 대한 최적의 바이러스 농도 조건을 식별하기 위한 접근 방식이 개발되었습니다. 여기에 설명된 기법은 다른 바이러스 표적에 대한 농도 매개변수를 식별하는 데 사용되며 대규모 바이러스 농도 실험에 적용됩니다.

물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

수중 환경에서 미량 금속 연구를 위해 물 샘플을 적절하게 수집하고 처리하기 위해서는 "깨끗한 기술"을 사용하는 특별한 주의가 필요합니다. 상세한 미량 금속 연구를 위해 신뢰할 수 있는 환경 모니터링 데이터와 높은 감도의 결과를 얻기 위한 샘플링, 처리 및 분석 절차를 위한 프로토콜이 제시됩니다.

클린 샘플링 및 추적 금속 연구 강 하구 바다의 분석

플랑크톤과 중단된 한 입자는 바다 생물 지구 화학적 순환에 중요 한 역할을 재생합니다. 여기, 우리 해 수의 큰 볼륨을 처리 하는 능력 입자와 바다에서 플랑크톤의 다양 한 크기의 컬렉션에 대 한 매우 깨끗 하 고 낮은 스트레스 방법을 제공 한다.

크기 분류 한 해양 플랑크톤과 중단된 한 입자를 수집 하기 위해 매우 깨끗 한 다층 기구

우리 물에 촉매 Brønsted 산 성 이온 성 액체 (BAILs)의 존재와 재생 비 식용 lignocellulosic 바이오 매스 (즉, 황 마)에서 C5 설탕 (xylose 및 arabinose)의 합성에 대 한 프로토콜을 제시. BAILs 촉매 전시 기존의 무기물 산 촉매 보다 더 나은 촉매 성능 (H2이렇게4 와 HCl).

당 분석에 대 한 새로운 방법을 황 바이오 매스 및 산 성 이온 성 액체를 사용 하 여 설탕 단위체로 그것 변환에

배우세요 대만 박쥐 인구에서 리사바이러스 감시를 위한 표준 실험실 운영 절차를. 이 방법은 연구자들이 2016년부터 2018년까지 네 종류의 리사바이러스를 식별하는 데 도움을 줍니다.

대만 박쥐 인구의 Lyssavirus 감시를위한 표준 운영 절차

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