Name: 대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 학습하세요 대변 DNA 무결성 검출을 이용한 비침습적 대장암 선별 검사법을. FL-DNA 키트와 qPCR을 활용하여 대장 종양 병변의 존재 가능성을 정확히 예측하고 기존 선별 검사와 병용하여 진단 정확성을 높이는 방법입니다.

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환자는 2013년과 2015년 사이 멜돌라 (FC, 이탈리아)의 로 스튜디오 e la Cura dei Tumori (IRST)당 Istituto Scientifico Romagnolo당에서 모집되었습니다. 등록된 환자는 IRST의 윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜 IRSTB002로 - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 서면 통보 된 동의는 모든 환자로부터 얻었다.
1. 대변에서 DNA 추출
<ol><li>키트를 사용하여 대변 샘플을 준비합니다(재료 표참조). 제조업체의 지침에 따라 추출을 수행하여 배설물을 선택하고 처리합니다. 정제된 DNA를 직접 증폭하거나 후속 분석을 위해 -20°C에 저장합니다.</li>
</ol>2. 양성 대조군, 표준, 스파이크인 DNA 및 임상 샘플의 준비
<ol><li>표준 및 시료 준비<ol>
<li>양성 대조군, 표준, 스파이크인 DNA 및 모든 임상 샘플을 준비하려면 양성 대조군, 표준 및 스파이크인 DNA의 알리쿼트를 원심분리한 다음 제공된 물의 정확한 양을 추가하여 각 시약을 다시 일시 중단합니다(아래 참조). 그런 다음 긍정적 인 제어, 표준 및 스파이크 인 DNA를 조심스럽게 소용돌이친 다음 10 초 동안 원심 분리기를 하십시오. 건식 시약의 완전한 재현탁액을 얻으려면 액체 시약을 실온(RT)에 사용 하기 전에 30 분 동안 보관하십시오.<ol>
<li>양성 대조는 건조한 형식의 인간 DNA입니다. 750 μL의 물로 각 알리쿼트에 다시 일시 중단하십시오.</li>
			<li>스파이크인 DNA는연어(Oncorhynchus keta)DNA로, 대변에서 추출된 DNA 샘플에서 억제제의 존재 가능성을 확인하기 위해 외인성 내부 대조군으로 사용된다. 100 μL의 물로 각 알리쿼트에 다시 일시 중단하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>표준 곡선을 준비하려면 스톡 솔루션에서 시작하여 4개의 1:5 희석을 생성합니다. 표준 점은 10 ng/반응, 2 ng/반응, 0.4 ng/반응 및 0.08 ng/반응이어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x 스파이크인 DNA의 준비<ol>
<li>사용하기 전에 스파이크인 DNA 대조군을 직접 준비하십시오.</li>
		<li>FL-DNa 스파이크 5 μL을 멸균수 20 μL과 혼합하여 1x 스파이크인 DNA 제어를 준비합니다. 분석할 샘플의 수와 양성 대조군에 따라 1x 스파이크인 DNA 대조군 샘플의 개수가 제조될 것이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 의 준비<ol>
<li>샘플(임상 샘플 또는 양성 대조군)의 75 μL을 1x 스파이크인 DNA의 25 μL과 혼합하여 총 부피를 100 μL로 산출합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. qPCR 쉬운 PGX를 사용하여 FL-DNA 값의 증폭 및 측정
참고: 인간 DNA와 내부 대조군을 대상으로 하는 특정 프라이머와 프로브를 포함하는 완전한 증폭 혼합물은 FL-DNA 혼합 A 및 FL-DNA 혼합 B. 표준, 양성 및 음성 대조군, 및 시료를 모두 혼수성 혼합물로 증폭해야 하는 8개의 웰 스트립에서 동열화 형식으로 제공됩니다. 임상 샘플은 두 가지 혼신 혼합체와 중복하여 만 증폭되어야합니다.
<ol><li>qPCR 계측기 및 운영 소프트웨어는 재료 표를 참조하십시오.<ol>
<li>작동 소프트웨어를 열고 플레이트 및 열 프로파일을 설정합니다.<ol>
<li>표 1과같이 플레이트를 설정합니다.<ol>
<li>열 1의 모든 8개 위치에 대해 웰 유형을 표준으로설정합니다.</li>
				<li>NTC로A2 및 B2 우물에 대한 웰 유형을 설정합니다.</li>
				<li>C2 및 D2(양수 컨트롤)에 대한 웰 유형을 알 수 없음으로설정합니다.</li>
				<li>다른 모든 위치에 대한 웰 유형을 알 수 없음으로 설정합니다.
</li>
				<li>모든 96 위치를 선택하고 염료 FAM 및 HEX를추가합니다. 동기화 플레이트를 클릭합니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>표 2에따라 열 프로파일을 설정합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>튜브의 바닥에 내용을 가지고 10 s에 대한 스트립의 필요한 수를 원심 분리.</li>
		<li>부드럽게 내용물을 유지하는 주의를 기울이면서 스트립에서 씰을 제거하고 각 스트립에 추가하십시오 : 부정적인 제어 : 물 20 μL; 샘플: DNA의 20 μL; 표준 곡선: 표준 1, 2, 3 또는 4의 20 μL; 양성 대조군: 20 μL의 양성 대조군.</li>
		<li>몇 초 동안 8 스트립 플랫 광학 캡과 소용돌이를 사용하여 조심스럽게 모든 스트립을 닫습니다.</li>
		<li>스트립을 10초 동안 원심분리하고 악기에 적재합니다. 그런 다음 실행을 시작합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 분석
참고: 소프트웨어에 따라 데이터 분석을 자동으로 또는 수동으로 수행할 수 있습니다(재료 표 참조).
<ol><li>실행의 끝에서, 선택 열 A, C, E, G 에 대한"FAM: FL-DNA-A"와"HEX : IC",및 열 B, D, F, H에 대한"FAM: FL-DNA-B"와"HEX : IC".</li>
	<li>표준 수량 시작 량에대해 다음을 설정합니다: A1 및 B1 웰에 대한 10 ng/반응, C1 및 D1에 대한 2 ng/반응, E1 및 F1의 경우 0.4 ng/반응, G1 및 H1의 0.08 ng/반응.</li>
	<li>FAM(FL-DNA A 및 FL-DNA B) 및 HEX(IC) 채널 모두에 대해 임계값 형광 값을 150으로 설정합니다.</li>
	<li>상자에서 결과 표에서 열 옵션을 클릭합니다 . 모두 선택 | 각 Cq (́R) 및 ́R 마지막 값으로 두 채널모두에서 결과를 얻으려면 확인합니다. 참고: 이러한 값은 실시간 PCR 계측기 소프트웨어에서 제공됩니다. ΔR 은 마지막 증폭 주기에 정규화된 형광 값에 마지막으로 해당합니다.</li>
	<li>결과 표 상자에서 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 컨텍스트 메뉴를 열고 Excel로 보내기를 클릭하여 원시 데이터를 내보냅니다.</li>
	<li>표준 값을 확인하여 표준 곡선의 적합성을 확인합니다.</li>
	<li>각 FL-DNA 혼합물에 대해 R2 ["R²(R²)" 열 및 효율성["효율성(%)"""효율(%)""""효율"을 확인하십시오. 열] 값을 지정합니다. 허용 가능한 범위에 있는 경우 제조업체의 지침에 따라 분석을 진행할 수있습니다(표 3).</li>
	<li>FAM 채널의 결과가 예상 범위에 없는 경우 표준 곡선의 한 점을 생략하고 실행을 다시 분석합니다.</li>
	<li>"Cq 없음" 값을 0으로 고려하여 다음 수식을 사용하여 음수 및 양수 컨트롤값을 결정합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg">
</li>
	<li>가져온 값을 표 4에보고된 값과 비교합니다.</li>
	<li>반응 컨트롤이 예상 값 범위에 있는 경우 샘플 분석을 진행합니다. 참고: 얻어진 Cq 값이 아티팩트(선형 형광 곡선)가 아닌 실제 증폭 반응(sigmoidal 형광 곡선)에서 생성되는지 확인합니다.</li>
	<li>각 FL-DNA 혼합에 대한 샘플의 적합성을 분석하려면 HEX 채널의 Cq 값을 비교합니다. 값이 ≥16이면 샘플 분석을 진행합니다. 값이 &lt;16이거나 Cq가 없는 경우 FL-DNA 스파이크의 디스펜싱 오류로 인한 것일 수 있습니다. 따라서 샘플을 분석할 수 없습니다.</li>
	<li>다음 수식을 사용하여 양수 제어의 "HEX" 채널에서 Cq 값의 평균을 계산합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq3.jpg">
</li>
	<li>다음 수식을 사용하여 샘플 복제의 "HEX" 채널에서 Cq 값의 평균을 계산합니다. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq4.jpg">
</li>
	<li>다음 수식에 따라 ́CqHEX 값을 계산합니다. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq5.jpg">
</li>
	<li>샘플의 ́CqHEX 값을 표 5에보고된 값과 비교합니다.</li>
	<li>각 믹스(혼합 A 및 혼합 B)에 대해 FAM 채널의 Cq 값을 표 6에 보고된 값과 비교합니다.
</li>
	<li>각 적합한 샘플의 FL-DNA 값을 확인하려면 "Cq 없음" 값을 0으로 고려하여 다음 수식을 사용합니다. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq6.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg"> 참고: 대장암 위험 및 유병률은 Rengucci et al.12 (표 7)에의해 얻어진 Fagan 노모그램 결과에 따른 iFOBT 및 FL-DNA 평가의 기능이다.</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+Microbiota%2C+and+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li>
<li>SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html">http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html</a> (2019).</li>
<li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps%2C+2008%3A+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society%2C+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer%2C+and+the+American+College+of+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li>
<li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Colorectal+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li>
<li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li>
<li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li>
<li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li>
</ol>

마우라 멘기는 디아텍 약전유전학 스월의 풀타임 직원입니다.

이전 연구는 수동 및 반자동 접근법에 의해 추출 된 대변의 DNA 무결성 분석이 대장 병변7,8,89,10,,,11,,12의조기 발견을위한 대체 도구를 나타낼 수 있음을 입증했다.10 분자, 비침습적 선별 검사는 대장암 의 검출을 위해 수년에 걸쳐 개발되었지만, 이러한 방법의 광범위한 확산은 다른 선별 검사에 비해 시간 소모적인 접근법과 비용 효율성 저하로 인해 제한됩니다.
이 방법은 비교적 저렴하고 시간이 많이 걸리지 않습니다. 또한 몇 가지 수동 단계를 필요로하는 새로운 절차로 인해 대장 병변을 검출하는 정확도가 증가했습니다....

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.

Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

대장암 (CRC)은 건강한 상피가 천천히 선종 또는 폴립으로 발전하는 다단계 과정에서 파생되며, 이는 시간이 지남에 따라 악성 암으로 진행됩니다1,,2. CRC의 높은 발생률에도 불구하고, 죽음의 비율에 있는 하향 추세는 지난 10 년간 관찰되었습니다3. 실제로, 선별 프로그램에서 채택된 조기 진단 도구는 pre-neoplastic 선종 또는 폴립4의조기 발견 및 제거로 이끌어 냈습니다. 그러나 다른 기술적 한계로 인해 이러한 방법 중 어느 것도 최적입니다. 실제로, 민감도와 특이성을 향상시키기 위하여, 많은 발판 DNA 시험은 단독으로 또는 현재 일상적인 진단시험과조합하여 제안되었습니다5,6.
일반적으로 건강한 점막은 배설물 스트림 apoptotic colonocytes로 흘러 들어가는 반면, 병에 걸린 점막은 비 세포사선 대장세포가 제거됩니다. 길이가 200 bp 이상인 단편은 비-사멸 DNA를 특징짓는다. 이 DNA는 긴 DNA (L-DNA)에게 불리고 CRC 조기 진단을 위한 이용 가능한 biomarker가 되었습니다. L-DNA는 대변 시편으로부터 분리되고 체외 진단 FL-DNA,키트7,8,89,910,,11,,12를사용하여 qPCR에 의해 정량화될 수 있다.
시험은 138 bp에서 339 bp에 구역 수색하는 FL DNA 단편의 검출을 위한 2개의 실험으로 이루어져 있습니다. 각 분석법은 FL-DNA (FAM)뿐만 아니라 스파이크 인 DNA (HEX)의 증폭을 허용합니다. 모든 단편의 최적 증폭을 보장하기 위해, 시험은 두 개의 실험("A" 및 "B")으로 나뉘어져 있다. A 분석은 APC 유전자(NM_001127511)의 엑소14의 2개의 지구 및 TP53 유전자의 엑손 7의 단편 (NM_001276760)를 검출합니다. B 분석은 APC 유전자(NM_001127511)의 엑슨 14의 단편과 TP53 유전자의 엑소5 및 8의 2개의 영역(NM_001276760)을 검출한다. 이 해수반은 검출된 부위를 구별하지 않는다. 스파이크인 DNA는 Oncorhynchus 케타 연어 DNA에 해당하며 절차가 제대로 수행되었는지 확인하고 잘못된 부정적인 결과를 얻을 수있는 억제제의 가능한 존재를 확인합니다. FL-DNA 농도는 표준 곡선 방법을 사용하여 절대 정량화에 의해 평가되고 ng/반응으로 표현됩니다.
FL-DNA 방법은 면역화학기반 배설물 혈액검사(iFOBT)와 결합하여 현재 CRC 스크리닝 프로그램에 사용되고 CRC 및/또는 고위험 선종 병변의 더 나은 예측을 가능하게 하는 비침습적이고 저렴한 대변 DNA 검사이다12.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 및 2 mL 폴리프로필렌 트위스트-락 튜브 (DNase-, RNase-, DNA-, PCR 억제제 없음)</td><td></td><td></td><td>DNA 추출 및 Real Time PCR</td></tr><tr><td>절대 에탄올 (분석 정도의 품질)</td><td></td><td></td><td>에 필요한 소모품 DNA 추출에 필요한 시약</td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기&nbsp;</td><td></td><td></td><td>최대 속도 20000 x g. DNA 추출에 필요한 기기</td></tr><tr><td>EasyPGX 분석 소프트웨어 버전 2.0.0</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-SW</td><td>분석 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>EasyPGX 원심분리기/와류 8-웰 스트립</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT803</td><td>기기는 실시간 PCR 분석에 권장됩니다.</td></tr><tr><td>EasyPGX qPCR 기기 96&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-96</td><td>기기는 Real Time PCR 분석에 권장됩니다.</td></tr><tr><td>EasyPGX 준비 FL-DNA</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT029</td><td>Kit for the Real Time PCR assay</td></tr><tr><td>Micropipettes (volume from 1.000 &micro; L)</td><td></td><td></td> <td>DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품</td></tr><tr><td>파우더 프리 일회용 장갑</td><td></td><td></td><td>DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품</td></tr><tr><td>QIAamp Fast DNA Stool</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td>대변에서 DNA 추출 및 정제에 권장되는 키트</td></tr><tr><td>멸균 필터 팁 DNase-, RNase-free (1 - 1.000 &micro; L)</td><td></td><td></td> <td>DNA 추출 및 Real Time PCR에 필요한 소모품</td></tr><tr><td>열 차단 예: EasyPGX 건조 블록</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT801</td><td>DNA 추출에 필요한 기기</td></tr><tr><td>Vortex 예: EasyPGX 원심분리기/소용돌이 1.5 ml&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT802</td><td>DNA 추출에 필요한 기기</td></tr></tbody></table>

대변 dna 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

요즘 대변 DNA는 여러 가지 방법으로 분리되고 분석 될 수 있습니다. 대변에 있는 DNA의 긴 단편은 사전 신생물 또는 신생물 대고 병변의 존재의 믿을 수 있는 확률을 제공하는 qPCR 분석결과로 검출될 수 있습니다. 형광 긴 DNA에게 불린 이 방법은 (FL-DNA), 1 차적인 예방 시스템에 개선인 빠른, 비침범성 절차입니다. 이 방법은 게놈 DNA의 특정 표적의 정량적 증폭에 의한 배설물 DNA 무결성의 평가에 기초한다. 특히, 200 bp 보다 긴 DNA 단편의 평가는 매우 높은 특이성을 가진 대장 병변을 가진 환자의 검출을 허용합니다. 그러나, 이 시스템 및 현재 유효한 모든 발판 DNA 시험은 해결될 필요가 있는 몇몇 일반적인 문제점을 제출합니다 (예를 들면, 시험을 수행해야 하는 주파수 및 각 개별을 위한 각 시점에서 집합된 대변 견본의 최적 수). 그러나, FL-DNA의 주요 장점은 면역화학성 배설물 혈액 검사(iFOBT)로 알려진 CRC 스크리닝 프로그램에서 현재 사용되는 시험과 관련하여 이를 사용할 수 있는 가능성이다. 실제로, 두 시험은 비용을 감소시키고 대장 병변의 궁극적인 존재의 더 나은 예측을 달성하는 동일 견본에 수행될 수 있습니다.

이 프로토콜의 워크플로는 그림 1에나와 있습니다. 워크플로는 이러한 단계 결과에 따라 두 가지 제어 단계와 서로 다른 작업을 제공합니다. 첫째, 샘플에 부적절한 컨트롤이 있는 경우 증폭을 반복해야 합니다. 둘째, 증폭이 억제되면 시료를 처음부터 재처리하거나 가치가 없는 것으로 분류해야 합니다.
도 2는 양성 및 음수 샘플에 의해 생성된 형광 곡선을 나타낸다. (A)도시된 것은 적합한 양성 샘플의 예이다. HEX 채널의 샘플 신호가 허용 범위 내에 있습니다. 양수 신호가 FAM 채널의 임계값을 초과합니다. (B)표시된 것은 적합한 음수/양수 샘플의 예입니다. 샘플 신호는 HEX 채널의 허용 범위 내에 있습니다. 음의 제어 신호가 FAM 채널의 임계값 보다 낮습니다. (C)도시된 것은 적합하지 않은 샘플의 예이다. 샘플 신호가 HEX...

제시된 진단 FL-DNA 키트는 대장암 병변의 존재의 신뢰할 수 있는 확률을 결정하는 시간 절약 및 사용자 친화적 인 방법입니다.

대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

이 방법은 비침습적 접근법에 의해, 대장 신생물 성병증을 가진 환자를 검출하는 것을 허용합니다. 특히, 이 시험은 현재 대장암 검진 프로그램에서 사용되는 검사와 연계하여 암의 존재 또는 비정상적인 병변의 위험이 더 높은 것을 더 잘 예측할 수 있도록 허용합니다. 이 프로토콜을 시작하려면 각 양성 제어, 표준 DN 및 스파이크 인 DNA의 알리쿼트를 미니 원심 분리기에서 10 초 동안 건조한 형식으로 알리쿼트합니다.750 마이크로리터의 물로 양수 제어를 다시 중단합니다. 외인성 내부 제어로 사용되는 스파이크 인 DNA를 다시 중단하고 100 마이크로 리터의 물로 억제제의 존재를 테스트합니다. 표준 곡선의 경우 100 마이크로리터의 물로 건식 표준을 다시 중단하고 스톡 솔루션에서 시작하여 4 개의 1:5 희석을 만듭니다.그런 다음 시약을 15초 동안 조심스럽게 소용돌이게 하고 원심분리기를 미니 원심분리기에서 10초 간 조심스럽게 소용돌이시다. 완전한 리서스펜션을 위해 액체 시약을 실온에서 30분 간 보관하십시오. 1x 스파이크 인 DNA 제어를 준비하려면 FL DNA 스파이크 5 마이크로리터와 멸균 수 45 마이크로리터를 혼합합니다.시료의 경우 각 샘플의 75마이크로리터를 1x 스파이크인 DNA 50마이크로리터와 혼합하여 총 125마이크로리터를 생성합니다. 먼저 qPCR 운영 소프트웨어를 엽니다. 플레이트를 설정하려면 열 1의 8개 위치에 대해 Well Type을 표준으로 설정합니다.A2 및 B2 웰에 대한 웰 유형을 NTC로 설정합니다. 양수 컨트롤인 C2 및 D2에 대한 웰 유형을 알 수 없음으로 설정합니다. 그리고 알 수없는 다른 모든 위치에 대한 웰 유형을 설정합니다.96개의 위치를 모두 선택합니다. 염료, FAM 및 HEX를 추가하고 동기화 플레이트를 클릭합니다. 그런 다음 제공된 대로 열 프로파일을 설정합니다.인체 DNA를 대상으로 하는 특정 프라이머 및 프로브와 함께 완전한 리오필화 증폭 혼합물을 포함하는 8웰 스트립의 원하는 수를 준비하고 내부 제어를 준비한다. 내용물의 내용을 튜브 바닥에 가져오려면 스트립을 10초 동안 원심분리합니다. 스트립에서 씰을 부드럽게 제거하여 펠릿을 잃지 않도록 하십시오.그런 다음 음의 제어 우물에 25 마이크로 리터의 물을 추가합니다. 우물을 샘플링하는 샘플 DNA의 25 마이크로리터와 양성 제어 우물에 양성 대조군 DNA의 25 마이크로리터. 표준 곡선의 경우 각 전용 웰에 표준 1, 2, 3 및 4의 마이크로리터 25개를 추가합니다.8 스트립 플랫 광학 캡을 사용하여 몇 초 동안 모든 스트립과 소용돌이를 조심스럽게 닫습니다. 스트립을 10초 동안 원심분리하고 계측기에 로드한 다음 실행을 시작합니다. 실행의 끝에서, FAM FL DNA A 및 HEX IC에 대 한, 선택 컬럼, A, C, E, 그리고 G.FOR FAM FL-DNA B 및 HEX IC, 선택 열, B, D, F, 그리고 H.표준 수량 시작 량에 대 한, 설정 10 나노 그램 A1 및 B1 우물에 대 한 반응 당, C1 및 4 1 에 대 한 반응 당 2 나노 그램, 4 나노 그램 반응 당 반응 당 , G1 및 H1에 대한 반응 당 8 나노그램을 가리킵니다. 그런 다음 FAM 및 HEX 채널 모두 임계값형광값을 150으로 설정합니다.상자 결과 테이블에서 열 옵션을 클릭한 다음 모두 를 선택한 다음 확인을 선택하여 실시간 qPCR 계측기 소프트웨어에서 제공하는 각 Cq 및 델타 R 마지막 값으로 두 채널모두에서 결과를 가져옵니다. 델타 R 은 마지막 증폭 주기로 정규화된 형광 값에 해당합니다. 상자 결과 테이블에서 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 컨텍스트 메뉴를 엽니다.원시 데이터를 내보내려면 Excel로 보내기를 클릭합니다. 그런 다음 FL-DNA 수량의 자동화된 계산을 위해 전용 분석 소프트웨어에 Excel 파일을 업로드합니다. iFOBT와 FL-DNA 값의 조합에서 각 환자에 대 한 추정, 대장 암 위험.적합한 양수 샘플의 형광 곡선은 허용 가능한 범위 내에서 내부 제어인 HEX 채널의 샘플 신호를 보여줍니다. 양성 신호는 표적 유전자의 증폭을 보여주는 FAM 채널의 임계값 이상입니다. 적합한 음수 샘플의 형광 곡선은 HEX 채널의 허용 범위 내에서 샘플 신호를 표시합니다.음수 제어 신호는 FAM 채널의 임계값 보다 낮습니다. 한편, 적합하지 않은 샘플의 곡선은 HEX 채널에서 허용 가능한 범위 내에 있지 않은 샘플 신호를 표시합니다. 잠재적인 억제로 인해 가장 가능성이 높습니다.따라서 이 샘플은 추출부터 시작하여 반복되어야 합니다. 소프트웨어 분석 출력 표는 반응 제어, 임상 샘플 및 실행 품질 관리 결과를 위한 FL-DNA 농도 측면에서 혼합 A 및 혼합 B 모두에 대한 데이터를 보여줍니다. 샘플 번호 4는 품질 관리를 통과하지 못했기 때문에 결과가 없습니다.반복하고 다시 분석해야 합니다. 표준 곡선에 스파이크 인 제어에 대한 DNA를 다시 일시 중단 할 때주의하시기 바랍니다. 및 다른 DNA를 8웰 스트립에 분배할 때, 뿐만 아니라 결과 분석 섹션에서 분자 검출 중에.이 방법은 대장 신플라스틱 병변의 더 나은 평가를 허용하기 위해 iFOBT 테스트와 함께 수행되어야하며, 동일한 배설물 샘플로 수행되어야한다.

evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

Pms2 및 / 또는 전체 crypts에서 ERCC1의 감소 / 결석 표현 가능성 colonic adenocarcinomas, 높은 mutability 암하는 모습으로 현장 결함의 기초의 각 측면에 10cm 이내에 자주 이벤트입니다. Ku86 또는 CcOI의 결핍증은 훨씬 덜 자주 이러한 필드 결함에 있습니다.

결함 Pms2, ERCC1, Ku86, 결장암을 진행하는 동안 필드 결함에 CcOI

그러면 표면 항원 (DotScan CRC microarray)를 인식 맞춤 항체 microarrays에 캡처되어 가능한 단일 세포를 생산하는 대장암 (CRC)의 disaggregation에 대한 절차를 설명했다. microarray에 바인딩된 세포의 하위 인구는 형​​광 염료와 태그 단클론 항체를 사용하여 형광 멀티플렉싱하여 프로파일 수 있습니다.

항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

이 비디오는 결장 종양 보유 마우스의 대변 샘플에서 DNA 분리 프로토콜에 대해 설명합니다. 추출된 DNA는 PCR을 사용하여 증폭되고 생성물은 마그네틱 비드 기반 접근법을 사용하여 추가로 세척됩니다. 이 방법은 대장 미생물총(microbiota) 및 동물 폐사율에 대한 환경 풍부화의 영향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

대변 미생물 DNA 분리: 쥐 종양 모델의 미생물 군집 다양성에 대한 환경 풍부화의 영향 연구

우리는 생쥐를 잠재적인 DNA 손상 물질에 노출시킨 후 체세포 결장 줄기 세포 돌연변이의 재현 가능한 측정에 대해 상당한 개선을 보고했습니다.

대장 줄기 세포 돌연변이의 정량화

소변 샘플의 cell-free 상등액 분획에서 DNA 무결성을 분석하는 방법을 제안합니다. 이 방법은 비뇨기과 악성 종양의 조기 발견에 적합하며 방광암의 조기 진단에 정확한 것으로 입증되었습니다.

소변 샘플에서 셀 무료 DNA 무결성 분석

환경 농축 (EE) 생활, 스트레스, 질병 사이 연결의 기반이 되는 메커니즘을 공개 하는 데 사용 되는 동물 주택 환경입니다. 이 프로토콜에서는 콜론 tumorigenesis EE의 마우스 모델을 사용 하 여 특별히 microbiota 생물 다양성 동물 사망률에 영향을 줄 수 있는 변경을 정의 하는 프로시저를 설명 합니다.

마우스 결 장 종양 모델에서 콜론 미생물 생물 다양성에 환경 농축의 효과 정의 하는 방법

디지털 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 이체와 DNA 복사 번호 이체의 고감도 검출을 위한 유용한 도구입니다. 여기, 칩에 튜브 형식으로 디지털 PCR를 사용 하 여 인간 게놈에 있는 드문 이체를 측정 하기 위한 주요 고려 사항을 설명 합니다.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

여기에 제시된 대장 HT29 세포로부터 유래된 확립된 암 줄기 유사 세포를 유지하는 과발현 드라이버 유전자를 발견하는 프로토콜이다. 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq는 표적 종양 세포의 생존에 관여하는 잠재적인 기계장치를 해명하기 위한 유전자 발현 네트워크를 조사하고 스크린하기 위하여 수행되었다.

대장 HT29 유래 암 줄기 와 같은 종양스피어에서 드라이버 유전자의 발견

우리는 인간 대변 샘플로부터 고품질 바이러스 크기 분획 메타게놈(바이러스)을 생성하는 유연한 프로토콜을 제시합니다. 원래 토양 바이러스 분석을 위해 개발된 이 프로토콜은 대변 샘플에 성공적으로 적용되어 인간 장 바이러스권의 견고한 특성 분석이 가능해졌습니다.

인간 대변 샘플을 위한 DNA 바이러스 크기 분율 메타게놈학

우리는 마우스의 맹장에 종양 세포 또는 유기체를 주입하고이 모델에서 순환하는 종양 세포 (CTCs)를 분리하여 정형 적 대장 직장 종양의 형성을 기술합니다.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

학습하세요 대변 DNA 무결성 검출을 이용한 비침습적 대장암 선별 검사법을. FL-DNA 키트와 qPCR을 활용하여 대장 종양 병변의 존재 가능성을 정확히 예측하고 기존 선별 검사와 병용하여 진단 정확성을 높이는 방법입니다.

대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가

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