Name: Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 중첩 RT-PCR을 이용한 모든 리사바이러스 검출 방법으로, 9,000건 이상의 동물 뇌 조직을 검증하여 신선 및 열화된 샘플에서 높은 민감도와 특이도를 확인했습니다. 이 기술은 뇌척수액, 타액, 소변 등 생체액 검체에도 적용 가능하여 광견병 진단과 감시를 강화합니다.

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이 연구는 국가 주요 연구 개발 계획 (보조금 번호 2016YFD0500401)과 중국의 국립 자연 과학 재단 (보조금 31302043)에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 마우스의 사용은 군사 의학 연구소의 동물 복지에 대 한 관리 위원회에 의해 승인 되었다, 군사 의료 과학 아카데미, 중국 (실험실 동물 관리 및 사용 위원회 승인, 허가 2010-02). 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 모든 기관 및 국가 지침이 따랐습니다.
1. RNA 추출
<ol><li>광견병-의심 되는 뇌 조직, 피부 생 검, 타 액 또는 CSF 또는 RABV 감염 세포 배양 물 로부터 RNA를 추출 하 여, 구 아니 늄 추적용-페 놀 클로로 포 름 계 추출 방법 또는 시판 바이러스 RNA 추출 키트를 사용 한다. 준비 된 RNA를 즉시 사용 하거나 필요할 때까지-80 ° c에서 보관 하십시오.</li>
</ol>2. 바이러스 성 RNA의 역 전사
<ol><li>표 1 에 나열 된 RT 시 약을 냉동에서 제거 하 고, 얼음에 보관 하 고, 사용 하기 전에이를 해 동 하 고 소용돌이 십시오.</li>
	<li>표 1에 나열 된 시 약을 0.2 ML의 PCR 튜브에 µ 반응 믹스 12 리터를 준비 한다. 마스터 믹스의 부피를 필요 이상으로 1 개 이상의 반응 크기로 준비 하 여 파이 펫 팅 변형을 허용 합니다.</li>
	<li>템플릿 룸에서 PCR 워크 스테이션 내에서 RT 반응 믹스에 8 µ L 샘플, 포지티브 제어 RNA 또는 네거티브 컨트롤을 추가 합니다. 상기 RT 양성 대조 군으로는 고정 된 RABV 스트레인에 감염 된 세포 배양 물 로부터 추출한 RNA-11 (챌린지 바이러스 표준-11)을-80 ° c에서 보관 하였다. 네거티브 컨트롤에는 RNase가 없는 ddH2O가 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>볼 텍 싱에 의해 RT 튜브의 내용물을 섞는다; 이어서, 짧게 원심 분리기.</li>
	<li>반응 튜브를 열 사이 클론에 넣습니다. 다음과 같은 조건으로 cDNA 합성 프로그램을 설정 합니다: 42 ° c의 경우 90 분, 95 ° c의 경우 5 분, 그리고 4°c에서 4 ° c를 유지 합니다. 반응 량을 20 µ로 설정 합니다. RT 실행을 시작 합니다.</li>
</ol>3.1 라운드 PCR
<ol><li>상기 표 2 에 열거 된 PCR 시 약을 사용 전까지 청정 실에서 얼음 위에 보관 하 고; 그런 다음, 해 동 하 고 소용돌이.</li>
	<li>상기 표 2에 나열 된 시 약을 사용 하 여 0.2 mL pcr 튜브에 제 1 라운드 pcr 혼합물을 제조 하였다.</li>
	<li>CDNA 또는 플라스 미드의 2 µ L 샘플을 템플릿 룸 내의 PCR 워크스테이션 내에서 1 라운드 PCR 믹스에 첨가 한다. 상기 PCR 양성 대조 군으로는 상기 RT 방법에 대해 2.3 단계에서 언급 한 바와 같이 제조 된 CV-11 cDNA를 제공 한다. PCR 음성 대조 군에는 ddH2가 있다.</li>
	<li>표 3에 나열 된 매개 변수를 사용 하 여 밀봉 된 튜브를 PCR 열 사이 클론으로 이송 하 고 순환 시킵니다.</li>
</ol>4.2 차 PCR
<ol><li>상기 표 4에 열거 된 시 약을 이용 하 여 0.2 mL pcr 튜브에 2 차 pcr 혼합물을 제조 하였다.</li>
	<li>1 라운드 PCR 산물의 2 µ L을 제 2 라운드 PCR 믹스에 추가 합니다. 또한, ddH를 2차 PCR의 음성 대조 군으로 서 포함 한다.</li>
	<li>3.4 단계에서 주어진 것과 동일한 파라미터를 사용 하 여 PCR 열 순환을 수행 한다.</li>
</ol>5. 아가 로스 겔에 전기 영동 하 여 PCR 산물 분석
<ol><li>1.5% 아가 로스를 1.5 g의 스 트리 아세테이트-EDTA의 100 mL에 첨가 하 고,이를 전자 렌지에서가 열 하 여 완전히 용 해 시킨 후에 아가 로스 겔을 제조 하였다.</li>
	<li>에 티 듐 브 로마 이드 (EB) 첨가 (최종 농도 0.01%) 또는 다른 상업용 EB 치환. 곰 팡이에 젤을 붓고 적어도 30 분 동안 주위 온도에서 응고 되도록 둡니다.</li>
	<li>각 PCR 산물의 5 µ L을 6 배의 로딩 완충 액 1 µ L과 혼합 하 여 로딩 샘플을 준비 한다.</li>
	<li>시료와 적합 한 DNA 마커를 웰에 별도로 적재 하 고 겔을 120에서 약 30-45 분 동안 겔을 실행 하 여 염료 라인이 약 75% ~ 80% 아래로 되도록 한다.</li>
	<li>전원을 끄고 전원에서 전극을 분리 한 다음 젤 상자에서 젤을 조심 스럽게 제거 하십시오.</li>
	<li>UV 젤 문서화 장치를 사용 하 여 DNA 단편을 시각화 하 고 촬영 합니다.</li>
</ol>6. 내포 된 RT-PCR의 특성화
<ol><li>
6.1. 리즈 사 바이러스 플라스 미드 18 의 검출 에 대 한 특이성 및 민감도 
	<ol>
<li>상기 PCR에 대 한 각각의 리즈 사 바이러스 (16 가지 ICTV 종 및 두 개의 신규 한 종)의 전체 N 유전자를 함유 하는 상용 플라스 미드 (18)를 주문 한다.</li>
		<li>Avogadro의 번호 (N) 및 다음 공식을 사용 하 여 플라스미드의 카피 수를 계산 한다. 【 µ 플라스 미드 DNA 660) 】 × 6.022 × 10 23 = 분자의 수/µ l</li>
		<li>DdH2의 모든 18 플라스 미드의 재고 솔루션 (2.24 x 109 분자/µ l) 준비</li>
		<li>DdH2에 있는 모든 18 플라스 미드의 9 10-접기 연속 희석을 수행 하십시오. 각 플라스 미드 스톡의 µ l을 90 µ l의 ddh2의 소용돌이 및 원심 분리기와 함께 희석 하십시오.</li>
		<li>3-5 섹션에 설명 된 대로 PCR 증폭을 수행 합니다.</li>
		<li>일련의 리즈 사 바이러스 플라스 미드를 검출 하 여 중첩 된 PCR의 특이성 및 민감도를 분석 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
D의 결정 etection l imit
	<ol>
<li>광견병 바이러스 균 주의 역가 조정 CV-11 세포 배양 액을 105.5 tcid50/ml (바이러스 역가는 oie 매뉴얼에 따라 결정 됨)5.</li>
		<li>6.1.4 단계에서 설명한 바와 같이 CVS-11의 5 10 (재고 액은 105.5 tcid50/mL)의 시리얼 희석을 수행 합니다.</li>
		<li>1-5 섹션에 기재 된 바와 같이 모든 바이러스 희석 액의 RNA 추출 및 중첩 된 RT-PCR 증폭 절차를 수행 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compar 의 슨 는 내포 된 rt-pcr "골드 스탠다드" 지방
	<ol>
<li>모든 임상 샘플을 중첩 된 RT-PCR로 시험 하 고, 그 결과를 지방5 및 N 유전자 염기 서 열 분석9로 확인 하였다.</li>
		<li>SAS 9.1을 사용 하 여 통계 분석을 위해 정규화 된 데이터를 활용 합니다. 진단 테스트의 통계적 비교를 위해 카파 테스트와 McNemar의 카이 제곱 검정을 사용 하십시오 (SAS 명령: proc 주파수; 테이블/동의). Abinomial 분포를 가정할 때 신뢰 구간을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
성능 저하 샘플 테스트의 효능 평가
	<ol>
<li>37 ° c에서 확인 된 2 개의 임상 뇌 조직 샘플을 라 이드 개에 노출 시킵니다.</li>
		<li>중첩 된 RT-PCR, 지방 및 MIT5에 의해 37 ° c에서 노출의 각 일에 두 개의 샘플을 분석 하였다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies%3A+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li>
<li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales%3A+update+2018%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li>
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<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China%3A+comparison+across+the+Lyssavirus+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+and+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

현재 RABV는 중국의 거의 모든 인간과 동물 광견병 뿐만 아니라 다른 나라에 대 한 책임을 맡고 있는 주요 리 사이 바이러스입니다. 또한, IRKV 변이체는 2012에서 중국 북동부에 있는 길 림 성의 Murina leucogaster 박쥐 로부터 먼저 확인 되었고, 201711에 있는 랴오닝 성에 서 개 사망을 야기 하는 것으로 보고 되었다. 가장 최근에는, 2017에서 대만, 중국의 일본 pipistrelle bat에서 새로운 리즈 사 바이러스, TWBLV도 확인 되었다. 이러한 결과는 다른 리스 바이러스를 효과적으로 검출 하는 것이 또한, 상기 박쥐-매개의 발생을 방지 하는 것이 중요 하다는 것을 시사 바이러스. 이와 관련 하 여, 가장 보존 된 N 개의 유전자 영역을 표적화 하는 pan-리 조 바이러스 내포 된 RT-PCR은 매우 유용한 도구이 고, 그 결과는 지금까지 확인 된 16 가지 ICTV 승인 ...

광견병은 인 리스 사코 바이러스1내에서 바이러스에의 한 전 세계적으로 발생 한 질병입니다. 리스 사 바이러스 (가족 Rhabdo비리대)는 5 개의 단백질을 인코딩하는 약 12kb 게놈을 갖는 단일 음성 가닥 RNA 바이러스: N, phosphoprotein, 매트릭스 단백질 (G), 당단백질 및 큰 단백질 또는 중 합 효소 (L). N 유전자, 유전 거리 및 항 원 성 패턴의 뉴클레오티드 서 열에 기초 하 여, 리 사이 바이러스는 고전적인 광견병 바이러스 (RABV) 및 광견병 관련 바이러스 (RRV)를 포함 하는 16 종으로 구분 되었다: 라고스 박쥐 바이러스 ), 모 코 롤라 바이러스 (MOKV), 유럽 박쥐 리스 사 바이러스 1 (EBLV-1), 브라질의 박쥐 리스 사 바이러스 2 (EBLV), 아 라 반 바이러스의 아 반 바이러스,이 코 코 (IKOV),이 르 쿠 바이러스 (GBLV), Irkut (IRKUT), (이로 브 루), Gannoruwa Khujand 바이러스 (쿠 브), 웨스트 코 카 서 스 박쥐 바이러스 (WCBV), 시 나 니 박쥐 바이러스 (L레프) 및 레이다 박쥐 리스 사 바이러스 최근 두 가지 추가 리 사이 바이러스가 확인 되었습니다: 일본 pipistrelle 에서 고립 된 2017 3 및 대만 박쥐 리스 사 바이러스 (Twblv)에서 브란트의 브랜드 박쥐 (myotis 브랜디 티) 로부터 고립 된 (kblv) Pipistrellus abramus), 중국 대만에서 2016 년-20174.
모든 포유류는 광견병에 취약 합니다. 그러나, 총 병리학 적 병 변 또는 특정 임상 징후는 그것의 식별을 허용 하지 않으며, 진단은 실험실 에서만 만들 수 있습니다5. 광견병 진단을 위한 가장 널리 사용 되는 방법은 지방, 누구와 oie5에 의해 금 표준으로 간주 됩니다.,6. 그럼에도 불구 하 고, 지방은 저하/자동 화 된 뇌 조직 샘플에 대 한 신뢰할 수 없는 결과를 생성 합니다. 추가적으로, 뇌 척 수액 (CSF), 타 액 및 소변과 같은 생물학적 유체 표본을 분석 하는 데 사용할 수 없으며,이로 인해 antemortem 진단7에서의 고용을 크게 배제 합니다. 광견병 조직 배양 감염 시험 (RTCIT) 및 마우스 접종 시험 (MIT)과 같은 대안적인 종래의 진단 시험은 신속한 진단이 필수적 일 때 주요한 단점이 있고, 며칠6을 필요로 한다.
다양 한 분자 진단 시험 (예를 들어, RT-PCR에의 한 바이러스 성 RNA의 검출, 효소-결합 면역 흡착 분석 법 [PCR ELISA], 현장 혼성 화 및 실시간 PCR)은 광견병 진단8에 대 한 신속 하 고 민감한 기술로 사용 된다. RT-PCR은 현재 일상적인 광견병 진단을 위해 OIE에 의해 권장 되 고 있으며, 각 리 사 바이러스5를 검출 하는 것은 지상 동물에 대 한 진단 검사 및 백신의 Oie 매뉴얼에 기재 되어 있다. 여기에서 우리는 지방에 의해 얻어진 것에 필적 하거나 초과 하는 모든 18 개의 리 사 바이러스 종의 특이 하 고 민감한 검출을 허용 하는 범 리 사 바이러스 중첩 RT-PCR을 설명 한다. 상기 방법의 원리는 표적 RNA (리즈 사 바이러스 N 유전자의 보존 부위)를 cDNA로 넣고, 2 차례의 PCR로 cDNA의 증폭을 따른다. 상기 cDNA는 845 bp 단편을 증폭 하기 위해 외부 프라이 머로 1 라운드 PCR을 겪는 다; 이어서, 상기 제 2 라운드 pcr은 371 bp 단편을 내부 프라이 머로 증폭 하기 위한 템플릿으로 서 1 라운드 PCR 산물을 사용 한다. PCR의 2 개의 라운드는 분석의 감도를 현저 하 게 증가 시킵니다.

<table><tbody><tr><td>50 &번; TAE</td><td>Various</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>6 &times; 로딩 버퍼</td><td>TakaRa</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>US Everbright&reg; Inc</td><td>A-2015-100g</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL 2,000 마커</td><td>Takara</td><td>3427A</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (10 mM)</td><td>TakaRa</td><td>4019</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (2.5 mM)</td><td>TakaRa</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 시스템</td><td>Tanon</td><td>EPS300</td><td></td></tr><tr><td>Ex-Taq (5 U/&mu; L)</td><td>TakaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>겔 이미징 시스템</td><td>UVITEC</td><td>Fire Reader</td><td></td></tr><tr><td>Microcentifuge 튜브</td><td>다양한</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 역전사 효소(200 IU/&micro; L)</td><td>TakaRa</td><td>2641A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 분광 광도계</td><td>Thermoscientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)15</td><td>TakaRa</td><td>3805</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>BIO-RAD</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>다양한</td><td>Phusion</td><td></td></tr><tr><td>High-Fidelity DNA Polymearase</td><td>NEW ENGLAND BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>다양한</td><td>랜</td><td></td></tr><tr><td>덤 프라이머</td><td>TakaRa</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제(40 IU/&마이크로; L)</td><td>TakaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free ddH2O</td><td>TakaRa</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Taq 버퍼 (10&times;)</td><td>TakaRa</td><td>9152A</td><td></td></tr><tr><td>팁</td><td>다양한</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>다양한</td><td>다양한</td><td></td></tr></tbody></table>

lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

가정 내에서 리 조 바이러스 의 광견병 바이러스 및 기타 종 종을 검출 하는 것은 Rhabdo비리대에 있어서, 상기 팬 리스 사 바이러스 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응 (중첩 된 rt-pcr)은 보존 된 영역을 검출 하기 위하여 개발 된 광견병 (N) 유전자의. 이 방법은 바이러스 RNA (cDNA)를 합성 하기 위한 프라이 머로 서의 템플릿 및 올리고 (dT)15 와 랜덤 hexamers로 서 바이러스가 있는 DNA를 사용 하 여 역 전사 (RT)를 적용 한다. 이어서, 바이러스 성 cDNA는 외부 프라이 머를 사용 하 여 1 라운드 PCR에서 845 bp N 유전자 단편을 증폭 하는 템플릿으로 사용 되 고, 이어서 제 2 라운드 형 PCR에 의해 내부 프라이 머를 이용 하 여 최종 371 bp 단편을 증폭 한다. 이 방법은 광견병 바이러스 (RABV)의 상이한 유전 적 clades를 검출할 수 있다. 중국에서의 10 년의 임상 광견병 진단 및 감시에서 8 개의 국내 동물 종에서 9624 두뇌 표본을 사용 하 여 유효성 검사는, 방법이 직접 형광에 비교 하 여 100% 감도 및 99.97% 특이성을가지고 있음을 보여주었습니다 항 체 시험 (지방), 세계 보건 기구 (WHO)와 동물 건강을 위한 세계 조직 (OIE)에 의해 권장 되는 금 표준 방법. 또한, 상기 방법은 또한 합성의 모방 검출에 의해 평가 된 바와 같이, 바이러스의 분류에 관한 국제 위원회의 제 10 회 보고서에서의 타겟 된 N 유전자 단편을 다른 승인 및 2 개의 신규 리 사이 바이러스 종들에 게 증폭 시킬 수 있다 모든 리즈 사 바이러스의 N 유전자 플라스 미드. 이 방법은 광견병 진단에 대 한 지방에 대 한 편리한 대안을 제공 하 고 중국의 국가 표준 (T36789)로 승인 되었습니다.

18 개의 리 사 바이러스 종을 검출 하는 중첩 된 RT-PCR의 결과는 도 1에 나타나 있다. 모든 PCR 양성 대조 군에서는 1 차 및 371 bp에서 845 bp에 예상 되는 것을 나타내 었으 며, 네거티브 컨트롤에는 밴드가 없는 2 라운드 증폭. 총 18 개 리즈 사 바이러스는 예상 845 및/또는 371 bp 대역을 생산 하 여, 중첩 된 RT-PCR이 모든 리즈 사 바이러스를 검출 했음을 나타낸다. 16 개의 리 사 바이러스 플라스 미드는 두 차례의 PCR에서 효율적인 증폭을 했지만, 두 가지 즉 ARAV와 IKOV는 1 차 또는 2 라운드 PCR 중 하나에서 증폭을 가졌다. 표 6에 나타난 바와 같이 상이한 리 사 바이러스 플라스 미드의 검출에 있어서 다양 한 방법의 민감도는 2.24 x 10 내지 2.24 x µ의 범위에 이른다. 이러한 차이는 바이러스 성 서 열 다양성으로 인해 프라이 머와 ...

중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

중첩 된 RT-PCR은 승인 된 모든 16 ICTV 및 두 개의 새로운 Lysavirus 종을 포함하여 모든 Lysaviruses를 감지하기 위해 개발되었습니다. 이 방법의 검증은 중국에서 임상 광견병 진단 및 감시의 10 년에서 9000 개 이상의 동물 뇌 표본을 사용하여 입증되었습니다. 중첩 된 RT-PCR은 신선한 뇌 조직 샘플뿐만 아니라 저하 된 샘플에서도 신뢰할 수있는 결과를 생성 할 수 있습니다.침수 방법은 뇌척수액, 타액 및 소변과 같은 생물학적 유체 표본을 분석하는 데 사용될 수 있으며, 이에 따라 이 방법은 최후통첩 진단에 적용될 수 있다. PCR 이월 오염을 최소화하기 위해서는 음수 및 양성 제어를 준비하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 각 RNA 추출에 대한 준비, PCR 설정 및 겔 전기전도는 물리적으로 분리된 영역에서 작동되어야 합니다.또한 펩티드 사슬에 대한 광견병 오염을 방지하기 위해 RNA 추출 및 역전사에 나선형 테이프를 사용하는 것이 좋습니다. 얼음에 에이전트를 준비, 정기적으로 장갑을 변경, 리보누브리스 무료 재료의 사용과 같은 적절한 취급은 ribonuclease의 도입을 방지하고 RNA의 저하를 제거합니다. 이 절차를 시작하려면, 광견병 의심 조직에서 RNA를 추출, 피부 생검, 타액, 뇌척수액 또는 RABV 감염 된 세포 배양 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로.진행 준비를 마쳤을 때, 필요한 시약을 냉동고에서 제거하고 얼음 위에 보관했습니다. 사용하기 전에 각 시약을 해동하고 소용돌이치십시오. cDNA에 바이러스 RNA의 역전사를 위해 클린룸내 텍스트 프로토콜의 표 1에 설명된 바와 같이 얼음에 대한 각 샘플에 대한 12 마이크로 리터의 반응 혼합과 1.5 밀리리터 원심분리관을 준비한다.파이펫팅 변형을 고려하여 필요한 것보다 적어도 하나의 반응 크기인 마스터 믹스의 볼륨을 준비한 다음 반응 혼합물을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다. 템플릿 룸의 PCR 워크스테이션에서 샘플 또는 제어 중 하나의 8마이크로리터를 반응 믹스에 추가합니다. 양성 조절은 고정 RABV 균주 CVS11에 감염된 세포 배양에서 추출된 RNA이며, 음의 대조군은 Rnase 가 없는 이중 증류수를 함유하고 있다.각 튜브의 내용을 먼저 소용돌이로 혼합한 다음 잠시 원심 분리하여 혼합합니다. 그 후 반응 튜브를 열순환기로 로드합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 cDNA 합성 프로그램을 설정하고 실행합니다.먼저 필요한 시약을 검색하고 사용할 준비가 될 때까지 클린룸에서 얼음을 보관하십시오. 준비가 되면 시약을 해동하고 소용돌이시합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 샘플에 대해 48개의 마이크로리터를 준비하고 반응 혼합을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다.템플릿 룸의 PCR 워크스테이션에서 첫 번째 라운드 PCR 믹스에 cDNA의 마이크로리터 샘플 2개를 추가합니다. CVS11 cDNA의 마이크로리터 2개와 양수 조절으로 이중 증류수 2개의 마이크로리터를 음수 대조군으로 포함시게 한다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 표 3에 나열된 매개 변수를 사용하여 밀봉 된 튜브를 PCR 열순환기 및 사이클로 전송합니다.시작하려면, 텍스트 프로토콜의 표 4에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 각 샘플에 대해 각 샘플에 대해 48마이크로리터를 준비하고 반응 혼합을 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 나눕니다. 두 번째 라운드 PCR 믹스에 첫 번째 라운드 PCR 제품의 마이크로 리터 2개를 추가합니다. 이 PCR 라운드에 대한 음의 제어로 이중 증류수를 포함하십시오.그런 다음 텍스트 프로토콜의 표 3에 나열된 매개 변수를 사용하여 PCR 써모사이클링을 수행합니다. 먼저 1.5그램의 아가로즈를 트리스 아세테이트 EDTA 100밀리리터에 넣고 전자레인지에 가열하여 철저히 녹입니다. 다음으로, 최종 농도0.01%의 최종 농도에서 에티듐 브로마이드를 추가하여 젤을 금형에 붓고 30분 이상 주변 온도에서 고화하게 둡니다.각 PCR 제품의 5마이크로리터를 6배 로딩 버퍼 1개에 혼합하여 적재 샘플을 준비합니다. 별도로 샘플과 적합한 DNA 마커를 우물에 적재하고 염료 라인이 젤 아래로 약 75 ~ 80 %가 될 때까지 120 볼트에서 약 30 ~ 45 분 동안 젤을 실행합니다. 실행이 완료되면 전원을 끄고 전원에서 전극을 분리합니다.그런 다음 젤 상자에서 젤을 조심스럽게 제거합니다. UV 젤 문서화 장치를 사용하여 DNA 조각을 시각화하고 촬영합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중첩된 역전사 PCR을 특성화합니다.18개의 리사바이러스 종을 검출하기 위해 대표적인 중첩 된 RT-PCR의 결과가 여기에 나와 있다. PCR 포지티브 컨트롤은 1라운드 증폭에서 845개의 베이스 페어와 2라운드 371개의 베이스 페어로 예상 대역을 보여줍니다. 음수 컨트롤에 대해 어떤 밴드도 볼 수 없습니다.모든 18 Lyssaviruses는 중첩 된 RT-PCR모든 18 Lysaviruses를 검출했음을 나타내는 긍정적 인 제어와 동일한 두 개의 밴드를 생산하는 것으로 보입니다. 플라스미드 중 16개는 PCR 2라운드에서 효율적인 증폭을 가하지만, 그 중 2개, 아라반 바이러스및 이코마 바이러스는 각각 1라운드 또는 2라운드에서만 증폭된다. 이 방법의 감도는 마이크로리터 당 2.24에서 2, 240 분자에 이르는 값에서 다른 Lyssavirus 플라스미드의 검출에 따라 다릅니다.이러한 차이는 바이러스 성 시퀀스 다양성으로 인해 프라이머와 템플릿 간의 불일치에 기인 할 수 있습니다. 중첩 PCR에 의해 테스트되는 임상 표본의 9, 624 뇌 조직을 비교한 결과, RT-PCR을 100%의 감도로 중첩하고 99.97%의 특이성으로 중첩된 것으로 나타났으며, 두 방법 사이의 특성은 99.07%의 다른 광견병 실험실이 99.07%의 다른 광견병 실험실을 통해 중첩된 RT-PCR의 유효성을 검사하도록 초대되었다. 모든 10개의 실험실은 중첩된 RT-PCR 결과, 가중된 RT-PCR이 높은 특이성과 재현성을 가지고 있음을 나타내는 거짓 네거티브 또는 거짓 긍정없이 FAT에 따라 100%인 중첩 된 RT-PCR 결과를 얻었다.RT-PCR은 이제 광견병 기술을 사용하기 위해 OIE에서 권장합니다. 그리고 우리의 중첩 RT-PCR은 2018 년 중국에서 광견병 기술의 국가 표준으로 입증되었습니다.

evaluation-universal-nested-reverse-transcription-polymerase-chain

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 실시간 역전사 PCR을 사용하여 바이러스 감염을 감지하는 정량적 방법을 보여줍니다. 역전사 단계는 RNA를 cDNA로 변환한 다음 PCR 주기를 통해 증폭합니다. 샘플에 바이러스 RNA가 존재한다는 것은 PCR에서 얻은 DNA의 증폭 및 해리 곡선을 분석하여 확인합니다.

바이러스 감염 진단을 위한 Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR

이 동영상은 두 개의 프라이머 세트를 사용하여 두 개의 순차적 PCR 증폭 프로세스로 구성된 기술인 중첩 중합효소 연쇄 반응에 대해 설명합니다. 프라이머의 첫 번째 세트는 두 번째 세트의 상류에서 서열에 어닐링하여 특정 유전자 서열을 선택적으로 증폭할 수 있습니다. 이 PCR은 일반 PCR보다 민감하고 특이도가 높으며 다양한 질병의 검출 기법으로 널리 사용되고 있습니다.

특정 바이러스 게놈 염기서열을 검출하기 위한 Nested-PCR

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

이 프로토콜은 대만의 박쥐에서 lyssavirus 항원의 진단 테스트를위한 표준 실험실 운영 절차를 소개합니다.

대만 박쥐 인구의 Lyssavirus 감시를위한 표준 운영 절차

dsDNA 인터칼레이팅 염료를 사용하는 이러한 실시간 RT-PCR은 리사바이러스 감염을 진단하는 데 적합합니다. 이 방법은 광견병에서 추출한 RNA로 시작하여 영양분 또는 사후 샘플로 의심되는 데, 마스터 믹스 준비, RNA 추가, 실시간 기계 설정 및 결과의 정확한 해석을 자세히 설명합니다.

광견병 진단을 위한 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.

양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

여기에서는 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)를 통해 인간 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 방법을 표준화하고 구현하기 위한 완전한 프로토콜을 제공합니다. 60분 이내에 완료되는 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 모든 실험실이나 현장 진료에 적용할 수 있습니다.

역전사 루프 매개 등온 증폭을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 검출

일반적인 호흡기 바이러스에 대한 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트를 소개합니다. 첫 번째 분석은 SARS-CoV-2(N), 인플루엔자 A(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B에 대한 것입니다. 두 번째는 SARS-Cov-2(N)와 메르스(UPE 및 ORF1a)에 대한 것입니다. 이러한 분석은 모든 전문 실험실에서 성공적으로 구현할 수 있습니다.

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발

이 프로토콜은 조직 채취에서 결과 해석에 이르기까지 pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석을 보여주며, 여기에는 일부 비광견병 lyssavirus 및 lagomorphs에 대한 분석 성능을 개선하기 위한 프라이머 염기서열 및 제형 업데이트가 포함됩니다. 또한 단일 웰 LN34 다중화(LN34M) 형식에 대한 분석 설정을 시연합니다.

업데이트된 멀티플렉스 LN34 Real-Time 역전사-중합효소 연쇄 반응 분석을 통한 동물 광견병의 사후 진단

학습하세요 중첩 RT-PCR을 이용한 모든 리사바이러스 검출 방법으로, 9,000건 이상의 동물 뇌 조직을 검증하여 신선 및 열화된 샘플에서 높은 민감도와 특이도를 확인했습니다. 이 기술은 뇌척수액, 타액, 소변 등 생체액 검체에도 적용 가능하여 광견병 진단과 감시를 강화합니다.

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

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