iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술

Duchenne은 근육 전구 세포의 조기 피로를 일으키는 근육 이영양증입니다. 그것은 가장 심각한 근 이영양증 중 하나입니다. 기능성 근육 재생을 촉진하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집을 사용하여 유도 된 다능줄기 세포 유래 근육 전구 세포에서 dystrophin 발현을 복원합니다.

CRISPR-Cas9 유전자 편집은 dystrophin 유전자 발현을 복원할 가능성이 있습니다. 자가 iPSC 유래 근육 전구 세포는 줄기 세포 모공을 보충하고 손상을 복구하며 면역 반응을 일으키지 않고 DMD에서 추가 합병증을 예방할 수 있습니다. 근생 전구 세포로 iPS 세포의 상이한 에이전트는 iPS 세포에 있는 종양 재창종의 리스크를 감소했습니다.

자백 유도 만능 줄기 세포 유래 근육 전구 세포를 CRISPR-Cas9 매개 유전자 교정과 결합하는 몇몇 치료는 Duchenne 근 이영양증 치료 전략을 유망합니다. 이 기술은 심장, 두뇌 및 혈액 병을 포함하여 자가 줄기 세포를 유전으로 편집하여 많은 선천성 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이 접근법의 데모가 도전으로 남아 있는 세포 재프로그래밍 및 유전자 편집처리에 있는 경험을 독자에게 제공할 수 있었다는 것을 보여주었습니다.

반전 된 현미경에서 감염된 마우스 배아 줄기 세포의 식민지를 검사하십시오. 자체 잉크 오브젝트 마커로 접시 바닥에 식민지를 표시합니다. 기름칠된 복제 링을 적용하여 표시된 세포 식민지를 덮습니다.

각 복제 링에 0.05%의 트립신-EDTA 100 마이크로리터를 추가하고 5분간 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 이어서, MES 성장 배지의 250 밀리리터를 포함하는 48웰 배양 판에 100 마이크로리터 파이펫 팁으로 소화된 세포를 전송한다. 이산화탄소 5%와 습도 85%로 섭씨 37도 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

70%의 합류를 읽을 때 잘 자란 셀이 있는 우물을 선택하고 TVP 용액 250밀리리터를 추가하여 30분 동안 소화합니다. 그런 다음 각 웰에서 6센티미터 접시로 세포 배양을 옮김합니다. 균일한 기숙사 모양의 클론이 얻어지을 때까지 복제 링과 인큐베이션을 여러 번 반복적으로 적용하십시오.

이제 TVP 솔루션의 밀리리터 를 추가하여 준비된 마우스 iPSC를 소화합니다. 세포 배양을 섬유네틴과 젤라틴으로 코팅한 24웰 플레이트로 옮기고 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포가 50%에 도달하면 밀리리터 폴리브레네 당 8마이크로그램을 함유한 신선한 배양 배지 500마이크로리터로 전환합니다.

그런 다음, 마우스 iPSCs에 렌티바이러스 입자 용액의 100 마이크로리터를 추가합니다. 37°C에서 3일간 세포를 배양하여 이산화탄소 5%를 증정합니다. 다음으로, 24시간 이내에 반킬 속도로 있는 블라스팅신과 히그로마이신 B의 최소 농도를 결정합니다.

밀리리터 블라스티시딘당 2.5 마이크로그램의 미디어를 추가하고 밀리리터 히그로마이신 B당 100 마이크로그램을 세포에 넣고 3일 동안 기다린 후 감염된 세포를 안정화하는 것으로 부착된 세포를 선택합니다. 선택한 마우스 iPSC를 0.5 밀리리터의 TVP 용액으로 소화하고, 새로운 24웰 플레이트에서 각각 잘 소화하고, 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 iPSC를 단일 셀로 피펫하고 셀 카운팅 챔버로 셀을 계산합니다.

약 150개의 소화된 단일 세포를 선택하고 MES 배지로 희석하여 10센티미터 의 접시로 희석하고, 이산화탄소는 섭씨 37도에서 배양합니다. 약 10 일 후, 반전 된 현미경에서, 사용 10 마이크로 리터 멸균 파이펫 팁 단일 식민지를 선택하고 96 웰 플레이트에 TVP 솔루션의 50 마이크로 리터로 각 식민지를 전송합니다. 섭씨 37도에서 30분간 소화하세요.

CRISPR/Cas9 편집 유도 만능 줄기 세포를 수확하는 성공에 는 신뢰할 수 있는 수동 복제 따기가 중요합니다. 그런 다음 소화된 세포를 각각의 다른 2개의 96웰 배양 판으로 옮기고 나눕니다. 섭씨 37도에서 70%까지 배양합니다.

70%의 결합에서 세포 콜로니를 사용하면 96웰 플레이트의 배지를 제거하십시오. 각 웰에 1%Proteinase K 용액을 함유한 25개의 리시스 시약을 추가하고 용액을 다른 96웰 PCR 플레이트로 옮습니다. PCR 플레이트를 접착 씰로 밀봉하고 30분 동안 섭씨 55도에서 열 사이클러에 플레이트를 인큐베이션한 다음 45도에서 45도의 섭씨에서 세포를 lyse및 단백질을 해독하고, PCR 튜브에 2개의 마이크로리터, 2DNA 의 마이크로리터 프리클리터 10마이크로리터를 추가했습니다. , DMD Exon23 프라이머의 마이크로 리터 1개.

원고에 따라 PCR 반응을 시작합니다. 그런 다음, 2.2 마이크로리터의 적재 버퍼와 함께 제공되는 PCR 반응을 2%아가로즈 젤에 적재한다. 젤을 100~150볼트에서 30분간 실행하고 자외선 아래에서 젤을 검사합니다.

이 프로토콜에서는 돌연변이 Exon23 측면에 있는 두 개의 가이드 RNA가 설계되었습니다. Cas9 매개 이중 좌초 휴식 및 비 동종 최종 결합 후 돌연변이 Exon23이 삭제되어 잘린 하지만 기능적인 Dystrophin 생성이 허용되었습니다. 트립신 솔루션의 누출을 방지하기 위해, 우리는 고리의 바닥에 고르게 그리스를 적용해야합니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집과 근육 측정기 활성화 시스템의 조합은 유전자 회복 기저 전구 세포를 가진 Duchenne 근 이영양증 환자에서 자가 이식을 위한 안전하고, 실현 가능하고 효과적인 전략을 제공합니다.