Name: 단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 학습하세요 표준화된 정량적 웨스턴 블롯팅을 사용하여 다양한 조직과 발달 단계에서 단백질 수준을 비교하는 강력한 방법을. 형광 전체 단백질 염색과 내부 로딩 대조군을 결합하여 재현성 있는 결과를 얻습니다.

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E.J.N.G.는 Wellcome 트러스트 (그랜트 106098/Z/14/Z)에 의해 지원 됩니다. SMA 신뢰 (SMA 영국 컨소시엄;에 의해 제공 된 다른 자금 T.H.G. & Y-T H.), SMA 유럽 (T.H.G, D.v.D.H. 및 E.J.N.G.), 정밀 의학 (T.H.G., L.L. & A.M.M.)에 딘 버 러의 대학 DTP 및 모터 신경 질병 연구 (T.H.G)에 대 한 이완 맥도날드 센터.

이 절차에 대 한 조직 내부 윤리 위원회에 딘 버 러의 대학에 의해 승인 된 기관으로 색인 및 관련 된 권위 아래 영국 홈 오피스 규정에서 동물 연구에서 가져온 개인 라이센스 프로젝트.
참고:이 프로토콜 최적화 된 표준, 상용 장비와 시 약을 사용 하 여 재현성을 증가 하기 위하여 ( 재료의 표참조).
1입니다. 샘플의 준비
<ol><li>
단백질 추출
	<ol>
<li>스냅-냉동 셀 전송 또는 드라이 아이스에-80 ° C에서 조직 샘플, 얼음에 녹여 고 얼음 감기 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 필요에 따라 세척 (대 한 자세한 내용은 조직 및 PBS 세척, 표 1참조). 이 단백질 품질에 영향을 미칠 것 이다 불필요 한 동결-해 동 주기를 하지 마십시오.</li>
		<li>Radioimmunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 버퍼 (25mm Tris HCl (pH 7.6) 150 mM NaCl, 1 NP-40%, 1% 나트륨 deoxycholate, 0.1 %SDS) 추가 조직 무게 당 최적의 금액을 사용 하 여 각 샘플 protease 억제제 x 1 ( 표 1 참조 권장 사항)입니다. 참고: 응용 프로그램에 따라 유형 및 균질 버퍼의 양을 할 수 있습니다 추가 최적화.</li>
		<li>폴 리 프로필 렌 유 봉과 휴대용 전기 균질 화기를 사용 하 여 조직 샘플을 균질. 각 샘플 사이의 이중 증 류 물에서 유 봉 세척 하 고 건조 한 깨끗 한 조직. 다른 실험 조건 및 조직 사이 유 봉을 변경 합니다.</li>
		<li>균질 후 10 분 동안 얼음에 샘플을 둡니다. 원심에서 샘플 > 10 분 동안 4 ° C에서 10000 x g .</li>
		<li>펠 릿을 방해 하지 않고 얼음에 새로운 튜브에는 상쾌한 전송. 상쾌한 단백질 샘플입니다. -80 ° C에서 추출한 단백질을 저장 하거나 직접 단백질 농도 측정을 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정량화 및 단백질 농도의 정상화
	<ol>
<li>Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다. 잘 당 BCA 믹스의 200 µ L를 사용 하 여 광학 96 잘 접시에 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석 결과 믹스를 준비 합니다. 참고:로 리와 Bradford 분석 실험과 같은 다른 정량화 방법 또한 단백질 농도 실험에서 일관 하 게 측정할 단백질 농도 결정을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>준비 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 기준 3 중에 농도 증가 하 고 중복에서 각 단백질 견본의 1 µ L를 추가 합니다. 60 ° C 10 분 이상 단백질 농도 낮을 것으로 예상 하는 경우에 따뜻한 열 블록에 96 잘 접시를 품 어.</li>
		<li>부 화, 후 560에서 흡수 측정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.</li>
		<li>플레이트 리더 측정 내보내고 얻은 단백질 표준을 사용 하 여 표준 곡선을 각 샘플의 평균 흡 광도 값을 비교 하 여 단백질 농도 계산. 표준 곡선의 R-제곱 값은 샘플 단백질 농도 정확 하 게 추정 하는 0.98 보다 크거나 이어야 한다.</li>
		<li>샘플 버퍼 및 초순 단백질 샘플의 희석을 준비 하 여 단백질의 양을 정상화. 총 볼륨 젤 사용의 유형에 따라 조정할 수 있습니다. 시작 금액으로 레인 당 단백질의 30 µ g를 로드 하는 것이 좋습니다. Dithiothreitol와 같은 환 원제를 추가 (DTT; 최종 농도 5 m m) 또는 베타-mercaptoethanol (최종 농도 200 m m)를 필요에 따라 각 샘플. 증기 두건에서 undiluted 베타-mercaptoethanol 플라스틱</li>
		<li>짧게 수집 샘플 얼음과 소용돌이, 다운 스핀에 넣어 10 분 동안 70 ° C에서 열 블록에 샘플을 품 어. 젤 로드까지 얼음에 계속.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 젤 전기 이동 법 단백질 샘플의
<ol><li>
장치 및 젤 설정
	<ol>
<li>부품된 4-12% 두번째-트리 스 그라데이션 젤 ( 재료의 표참조) 젤 전기 이동 법 챔버 시스템에 설치 합니다. 사용 하기 전에 두 번 증 류 물을 사용 하 여 젤 린스. 참고: 크기, 상호 작용 및 관심, 다른 그라디언트로 젤의 단백질의 풍부에 따라 버퍼링 에이전트 또는 잘 크기와 수 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>실행 버퍼 탱크 당 이중 증 류 물에 희석 1 x MES SDS의 500 mL를 추가 합니다. 겹쳐 쌓이는 젤에 우물을 방해 하지 않고 실행 중인 버퍼를 추가한 후 빗은 젤에서 조심 스럽게 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단백질 로딩
	<ol>
<li>우물에 표준 단백질의 3.5 µ L를 로드 합니다. 샘플 레이아웃에 따라 젤에 단백질 사다리를 로드 도움이 더 정확 하 게 단백질 크기를 추정 됩니다. 뾰족한 젤 더 정확한 샘플 로드에 대 한 팁을 로드를 사용 합니다.</li>
		<li>내부 표준 사이 막 표준화에 대 한 사용 하는 경우 (아래의 5 단계 및 토론 참조), 금액은 단백질 사다리 옆 처음 3 우물에 다른 샘플을 로드.</li>
		<li>나머지 우물에 각 샘플의 30 µ g를 로드 합니다. 모든 빈 우물에 샘플 버퍼 x 1을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전기 이동 법
	<ol>
<li>샘플을 로드 한 후 젤 탱크를 조립. 10 분 뒤에 추가 45-60 분 150 V 80 V에서 겹쳐 쌓이는 젤을 통해 샘플을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 단백질 전송
참고:이 프로토콜에서 단백질 전송 상용 세미 드라이 더 럽 히 시스템을 사용 하 여 수행 됩니다 ( 재료의 표참조) 신속 하 고 일관성 있는 결과 대 한.
<ol><li>사전 필터 종이 이중 증 류 물에 몸을 담글 젤 칼 함으로써 단백질 전송 준비, 플라스틱 파스퇴르 피 펫, 더 럽 히 롤러와 집게를 사용할 준비가.</li>
	<li>신중 하 게 모든 포장 호 일을 제거 하 여 전송 스택을 엽니다. 상단 하단 스택에서 제거 하 고 따로 설정 합니다. 신속 하 게 전기 이동 법 버퍼 (2-3 mL) 실행의 몇 방울과 하단 스택에 막 축. 일단 전송 스택 열리면, PVDF 막 밖으로 건조 로부터 방지 하기 위해 중요 하다.</li>
	<li>중지 한 후에 전기 이동 법, 프리 카스트 젤 젤 칼을 사용 하 여 열고 겹쳐 쌓이는 젤을 잘라. 젤 플라스틱 캐스트에서 그것을 그것의 가장자리를 잘라. 젤 칼 젤에 손상을 방지 하기 위해 젖은 계속.</li>
	<li>맨 아래에서 전송 스택 조립: 스택 (PVDF 막 포함), 단백질 젤, 필터 종이 바닥. 더 럽 히 롤러를 사용 하 여 모든 기포를 제거 하. 필터 종이 위에 최고 스택 배치 하 고 롤 다시 기포 제거를 스택. 밀어 하지 않습니다 전송 너무 강하게 젤 단백질 동안 변형 될 수 있습니다.</li>
	<li>장치의 왼쪽에 전체 스택 전극으로 전송 장치에 전송 하 고 스택 맨 위에 젤 스폰지를 배치 하는 장치에는 해당 전기 접점과 나란히. 뚜껑을 닫고, 선택 하 고 적절 한 프로그램을 시작 (20 V 7 분은 권장된 시작 지점).</li>
	<li>완료 되 면 스택 아래로 냉각 하 고 막 밖으로 건조 하지 않도록 수 있도록 2 분 동안 폐쇄 뚜껑을 둡니다. 전송 스택 제거 하 고 젤 크기를 막 잘라. 총 단백질 얼룩과 계속 하기 전에 두 번 증 류 물으로 신속 하 게 잘라 막 세척.</li>
</ol>4. 총 단백질 얼룩
참고: 형광 탐지를 사용 하 여 제공 합니다 실질적인 혜택을 더 전통적인 접근 (예를 들면, ECL 감지), 선형 범위와 감도 훨씬 더 나은 제어4수로. 따라서,에서 단계 4 및 5, 형광 TPS와 형광등 2 차 항 체는 사용 ( 재료의 표참조).
<ol><li>롤 단백질 면이 안쪽으로 50 mL 튜브에 막. 2 차 항 체와 형광 TPS의 빛 감도, 때문에 모든 후속 단계 어둠 속에서 수행 됩니다.</li>
	<li>단백질 얼룩 솔루션의 5 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 및 실 온에서 5 분 동안 롤러에 품 어. 때문에 TPS와 워시 버퍼 메탄올을 포함, 밖으로 증기 두건에서 다음이 단계를 수행.</li>
	<li>얼룩 솔루션을 삭제 하 고 신속 하 게 세척 솔루션 (30% 메탄올에서 6.3% 아세트산)의 5 mL로 두 번 씻어. 세척 단계 사이 롤러에 다시 짧게 튜브를 놓습니다. 계속 하기 전에 짧게 초순와 막을 헹 구 십시오.</li>
</ol>5. 차단, 항 체 외피 및 탐지
<ol><li>
막 차단: 차단 버퍼의 3 개 mL를 추가 ( 재료의 표참조) 포함 하는 막 50 mL 튜브에. 실 온에서 30 분 동안 롤러에 막 품 어. 항 체의 선택에 따라 사용 하는 블로킹 버퍼 유형의 최적화를 해야 합니다.</li>
	<li>
1 차적인 항 체 외피
	<ol>
<li>삭제 버퍼는 차단 및 적절 한에 1 차 항 체로 대체 최적화 농도 (그림 1 및 그림 2: 마우스-안티-SMN, 블로킹 버퍼에 희석 1:1, 000에). 참고: 적절 한 최적화 기본 항 체의 항 체에 적당 한 크기의 단백질 제품 검색을 보여주는 하는 동안 확인 포함 해야 없습니다 또는 불특정, 다른 단백질 제품을 최소한의 바인딩. 가능 하면, 테스트 하 고 관심사의 단백질에 대 한 여러 개의 항 체를 비교.</li>
		<li>4 ° c.에 하룻밤 롤러에 멤브레인을 품 어 다음 날, 항 체 솔루션을 제거 하 고 실내 온도 (RT)에 롤러에 1 x PBS 가진 5 분에 대 한 6 번 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이차 항 체 외피
	<ol>
<li>5 mL 차단 버퍼에 1 차적인 항 체의 호스트에 대 한 1:5,000에서 특정 이차 항 체를 준비 합니다. 다른 이차 항 체는 다른 희석 또는 대체 블로킹 버퍼를 사용 하 여 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>실시간에서 1 시간에 대 한 롤러에 이차 항 체 솔루션 멤브레인을 품 어 부 화, 후 롤러에 막 1 x PBS로 3 시간 30 분을 씻어.</li>
		<li>막 건조 하 고 막 탐지까지 알루미늄 호 일을 사용 하 여 빛 으로부터 보호 유지. 막 장기 저장을 위한 4 ° C에서 보관 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이미지 수집
	<ol>
<li>스캐너에 연결 된 컴퓨터에 로그인 합니다. 막 스캐너에 단백질 면이 아래로 향하게 놓고 소프트웨어에서 스캔 영역을 선택 합니다.</li>
		<li>모두 레이저 강도 최적화 (700 nm와 800 nm) 채널, 채도 없음 발생을 확인 하 여. 두 채널의 이미지 고 추가 분석 (6 단계)에 대 한 이미지를 내보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 서쪽 오 점 분석 및 정량화
참고: 이러한 권장 사항은 기반으로 자유롭게 사용할 수 있는 이미지 스튜디오 소프트웨어 합니다. 그러나, 비교 분석 또한 행 해질 수 있다 ImageJ 등 다른 소프트웨어 패키지를 사용 하 여.
<ol><li>
가져오기 파일: 분석을 위해 사용 하는 컴퓨터에서 로컬 작업 영역을 만듭니다. 이 인수 서쪽 오 점에 대 한 이미지 파일의 데이터베이스를 생성합니다. 가져오기 파일 스캐너에 획득 하 고 분석에 대 한 이미지를 선택 합니다.</li>
	<li>
TPS 분석
	<ol>
<li>총 단백질 얼룩 결과 보여 700 nm 채널을 표시 합니다. TPS 이미지의 예를 들어 그림 1 에 신생아 (P5)에서 다른 어떤 조직에 포함 되어 (그림 1A-B) 10 주 오래 된 마우스 (그림 1 C D) 직접 비교 됩니다. 마찬가지로, 그림 2 는 다른 연령대의 쥐에서 뇌 조직의 직접 비교의 예가 나와 있습니다.</li>
		<li>오른쪽 상단 모서리에서 분석 탭을 선택 하 고 정규화 (그림 1B, D)에 대 한 관심의 영역을 정의 하려면 사각형을 추가 선택 합니다. 복사 및 붙여넣기 모든 분석된 차선에 대 한 동일한 크기에 정의 된 영역을 보장 하기 위해 각 개별 샘플에 첫 번째 사각형 영역이입니다.</li>
		<li>소프트웨어의 하단 왼쪽된 모서리에 모양 탭에서 결과 복사 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
정량화 참고: 샘플 측정에 대 한 최적의 접근 실험 설계에 따라 달라 집니다. 우리 여기는 생존 모터 신경 단백질 (Smn, 신경 근육 학 질병 척수 근육 위축 증20,21에서 포함 된 주요 단백질), 시간이 지남에 따라 감소 하의 탐지의 설명 예를 제공 합니다. 19 그리고 Smn 신호 강도 TPS에의 단백질 식 개발의 신뢰할 수 있는 예측을 제공 하는 방법.<ol>
<li>
그림 2 는 Smn 식 컨트롤을 로드 하는 단백질으로 TPS와 동물의 나이 증가 함께 감소. 반복 단계 6.2.1-6.2.3 단백질 (그림 2B) 로드를 계량 합니다. 800 nm 채널 (그림 2A) 관심사의 단백질 분석 단계 6.2.1-6.2.3를 반복 합니다.</li>
		<li>스프레드시트 프로그램에 TPS와 관심사의 단백질에서 결과 복사 합니다. 스프레드시트에서 먼저 단백질 높은 TPS 신호를 확인 하 여 로드를 정상화 하 고 나누어 각 TPS 신호 값을 로드 하는 정규화 된 단백질을 얻으려면이 값으로 값 합니다.</li>
		<li>다른 샘플에서 상대 단백질 식 비율을 계산 해당 정규화 된 단백질 값으로 각각의 개별 샘플에서 800 nm 신호 값을 나눕니다.</li>
		<li>첫 번째 정규화 후 다양 한 시간 점 또는 조직의 다른 막과 실험을 통해 직접 비교를 허용 하도록 내부 표준의 평균 값을 비교 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7입니다. 통계
<ol><li>샘플의 복잡 하 고 큰 그룹에서 단백질 표정에서 통계적으로 유의 한 차이 확인 하려면 적절 한 통계 방법론은 필요 합니다. 통계 배경에 대 한 자세한 내용은이 문서의 범위를 넘어, 비록 우리가 몇 가지 고려 사항을 강조 표시 하 고 성공적인 접근을 우리는 이전에 사용한19세부 싶어요.</li>
	<li>많은 실험을 위한 단백질 부 량 측정은 완전히 독립적인 데이터를 대표 하지 않는다. 여기, 예를 들어 여러 조직 일반적으로 얻을 수 있습니다 단일 점에서 실험 시간-여러 장기에 걸쳐 단백질 수준을 결정 하는 단일 동물에서. 따라서, 우리는 단백질 식 시간이 지남에, 그리고 조직 사이에서 차이 분석 하 혼합된 효과 모델을 사용.  일반적으로, 혼합된 효과 모델 아닌 독립을 다루는 의사 복제22,23그로 인하여 방지 하는 효과적인 수단을 제공 합니다. 현재의 경우에 혼합된 효과 모델 조직, 개인 시간 사이에서 반복된 측정에 대 한 고려 하 여 통계적 인 힘을 증가. 우리는 이것이 자유롭게 사용 가능 하 고 다재 다능 한 이러한 분석을 수행 하기 위해 통계 소프트웨어 패키지 R를 사용 합니다. 그러나, 다른 상용 패키지 유사한 분석을 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>현재 실험 설계를 각 마우스 한 연령 그룹에 속한 "분할 음모" 디자인을 포함 한다. 따라서, 우리 고유 식별자; 임의 효과로 개별 마우스 (마우스 ID) 모델링 우리는 또한 조직, 나이, 그리고 그들의 상호 작용 효과 대 한 차지 했다. 우리 연구 도서관, lme4의 함수 lmer를 사용 하 여 데이터 모델링. 품질 관리 단계로 우리 시각 오차 같은 분산 및 정규 분포의 가정을 평가 하 고 필요한 경우 이러한 가정에 맞게 데이터를 변형. 조직과 세 사이의 중요 한 상호 작용을 테스트 하려면 우리는이 상호 작용을 결여 되 고 패라메트릭 부트스트랩 (R 함수 라이브러리, pbkrtest에에서 PBmodcomp)를 사용 하 여 모델을 비교 하는 동일한 모델 적합.  어디 중요 한 상호 작용 발생, 우리 사용 함수 emmeans (emmeans R 도서관) 상호 작용의 원인을 확인 합니다.  예를 들어 우리; 각 조직 내에서 나이 클래스 중 평균 식 비교 중요 한 상호 작용, 2 개의 주어진된 나이 수업 한 조직에 대 한 크게 달랐다 하는 경우 연령과 조직 사이 발생할 수 있지만 또 다른. 요약 하자면, 이러한 접근 이러한 결과 통계 지원을 제공 하 여 서쪽 오 점 실험에서 결론의 견고성을 확장 하는 방법을 제공 합니다.</li>
</ol>

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적절 한 실험 설계, 제어 측정 및 통계 분석, 서쪽 더 럽 히는 단백질 식 및 생물 학적 샘플의 다양 한 범위 사이 신뢰할 수 있는 양적 견적을 사용할 수 있습니다. 우리는 현재 원고에서 설명 하는 프로토콜 형광 기반의 조합을 사용 하 여 샘플, 더 크고 복잡 한 그룹 전체 정량 분석을 수행을 더럽혀 서 사용 하고자 하는 연구자에 대 한 지침 서 역할을 목표로합니다 탐지 방법, 총 단백질 로딩 정규화 및 내부 기준. 여기 초점은에 결정 하 고 비교 단백질 표정 다른 마우스 조직에서 다양 한 연령대에, 비록이 방법은 확장할 수 있습니다 또한 다른 실험 조건에서 단백질 발현을 비교 하.
우리의 현재 프로토콜에서 중앙 단계는 총 단백질 형광 총 단백질 얼룩을 측정 하 여 로드 하는 관심사의 단백질의 정규화 이다. TPS 정규화 샘플 로딩에 변화와 단백질 정량화 방법에 오류 여백에 대 한 해결합니다. 그러나, 단일 막에 분석 될 수 있는 단백질 샘플 수는 종종 제한 됩니다, 때문에 더...

서 부 럽 일반적으로 감지 단백질 표정, 조직 homogenates 또는 추출 물 등을 계량 하는 데 사용 되는 기술입니다. 년 동안,이 기술을 주도하 고 있다 기본 및 임상 연구에 많은 발전을 그것은 사용할 수 있는 진단 도구로 질병1,2의 존재를 확인 하. 서 부 럽 처음에 설명 되었다 1979 니트로 시트 polyacrylamide 젤에서 단백질을 전송 후 했다 방사성으로 분류 하거나 fluorescein에 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 단백질을 시각화 하는 방법으로 또는 과산화 효소3. 상용 장비 및 장비 개발을 통해 서쪽 더 럽 히 방법은 점점 표준화 하 고 되었습니다 년간 단순화. 실제로, 기술은 다양 한 배경과 경험의 수준의 과학자 들에 의해 쉽게 수행 이제 됩니다. 그러나, 많은 유사한 실험 기법, 것과 같이 서쪽 오 점 분석의 결과 쉽게 영향을 설계 및 실험의 실행에서 만든 선택. 그것은 중요 한, 그러므로, 표준화 된 서쪽 더 럽 히 메서드의 액세스 가능성 모호한 실험 계획에 대 한 필요성 및 디자인 하지 않습니다. 실험적인 고려 사항 포함, 하지만 제한, 샘플 준비 및 처리, 선택 및 단백질 검출을 위한 항 체의 유효성 검사 및 특히 소형 또는 대형의 젤 막 전송 효율 (< 10 또는 > 140 kDa) 단백질4,,56,7,,89. 원래 샘플의 단백질 품질 후속 서쪽 오 점 분석의 결과 결정에 중요 한 역할을 한다. 단백질 샘플 및 세포, 조직, 동물 모델에서 사후 인간의 조직, 등의 다양 한에서 추출 될 수로 처리 및 처리에 일관성 재현성 결과를 얻이 필요 합니다. 예를 들어 단백질 추출에 대 한 샘플의 장기 보관이 필요한 경우 그것은, 단백질은-80 ° C에 일반적으로 안정, 추출 된 단백질 및-80 ° C에서 그대로 조직 단백질 안정성에 차이 되었다는 것을 실현 하는 것이 중요 보고 된10. 또한, 단백질 양의 재현할 수 견적을 얻으려면, 샘플의 일관 된 균질 결정적 이다. 다른 세포의 용 해 버퍼 및 균질 화 방법 (예를 들어, 수동 균질 자동된 방법에 비해)을 최적화 하는 것은 대규모 양적 실험을 시작 하기 전에 필요할 수 있습니다.
단백질 로드와 부 량 변화에 대 한 해결 하기 위해 정규화 전략 단백질 식의 강력 하 고, 양적 결과 얻기 위해 필수적입니다. 단백질 β-말라 등 내부 관리, α-tubulin, β-tubulin, 및 glyceraldehyde-3-인산 효소 (GAPDH) 전통적으로 사용 되어 왔습니다 정량화에 대 한 단백질 수준을 정상화 하. 그러나, 정량화 목적을 위해 특정 가사 단백질 정규화 점점 받아왔다 지난 몇 년 동안11,12이상. 예를 들어 가사 단백질의 표현 같은 동물4, 그리고 다양 한 질병 조건4,15 아래 조직에 걸쳐 서로 다른 발달 단계13,14를 변경할 수 있습니다. ,,1617. 따라서, 특정 가사 단백질의 사용 다른 조직, 다른 timepoints와 다양 한 실험 조건 아래에서 단백질 표정 사이 더 복잡 한 비교를 만들기의 가능성을 제한 합니다. 로드 변형 단백질에 대 한 제어를 가사 단백질 대신 총 단백질 얼룩 (TPS)를 사용 하 여 해당 레이블 이며 샘플에 존재 하는 모든 단백질을 시각화. TPS 신호 정규화 총 단백질 부하에 따라 수 보다는 특정 한 단백질의 수준 및 그러므로 TPS 신호의 정량화 해야 한다 비교 실험 조건, 샘플 형식 또는 발달 timepoint에 재현 . 총 단백질 얼룩 포함 됩니다 Ponceau S, 얼룩-무료 젤, Coomassie R-350, Sypro-루비, Epicocconone, Amydo 블랙와 Cy5 (참고 18에서 검토). 이러한 각 메서드는 특정 이점 및 제한 하 고 메서드 선택 실험 설치4,18뿐만 아니라 시간 및 사용할 수 있는 도구에 따라 달라 집니다.
내 막 로드와 부 량 변화에 대 한 수정 하는 TPS를 사용 하 여, 그것을 다른 세포 막, 대규모 단백질 표정 분석을 수행 하는 경우에 특히 사이 샘플을 비교할 필요할 수 있습니다. 그러나, 항 체 바인딩 효율성과 총 단백질 얼룩 강도 같은 요인에서 변화를 소개 추가 별도 젤에 분석 단백질 견본 및 막 사이 변화 합니다. 이 상황에서 강력한 정량화에 대 한 그것은 멤브레인 사이 가변성을 더 정규화 단계를 소개 하는 데 필요한 따라서. 이 실험에서 일정 하 게 유지는 별도로 분석 된 막의 각각에 내부 로드 표준 포함 하 여 달성 될 수 있다. 이 표준은 모든 단백질을 실험에 포함 하는 모든 세포 막에 걸쳐 사용 될 충분 한 수량에 얻어질 수 있다 lysate의 형태를 걸릴 수 있습니다. 여기, 우리 두뇌는 즉시 무 균 하 고 높은 농도에 단백질의 상당한 금액을 포함 하는 취득된 단백질 lysate lysate 쥐의 뇌 (5 일 오래 된 컨트롤 마우스에서 얻은)의 사용 합니다. 3 중에는 내부 표준 로드 정상화 하 고 직접 비교를 별도 세포 막에 샘플 수 있습니다.
여기, 우리는 우리가 다른 조직, (를 포함 하 여 질병 모델), 마우스 모델 및 발달 timepoints19단백질 식 변화의 복잡 한 비교를 수행 하기 위해 수 있도록 개발 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 결합 하 여 형광 TPS는 내부 로드 표준의 사용과, 우리 수 샘플 및 단일 실험에서 비교 될 수 있는 실험 조건에서에서 기존의 한계를 극복할 수 있었다. 이 방법은 전통적인 서쪽 오 점 기법, 수 있도록 더 나은 다른 조직 및 샘플 단백질 식이 탐구 하는 연구자의 사용을 확장 합니다.

<table><tbody><tr><td>세밀한 팁 젤 로딩 팁</td><td>알파 연구소</td><td>GL20057SNTL</td><td></td></tr><tr><td>Halt 프로테아제 억제제 칵테일, EDTA-free 100x 5mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 호모게나이저&nbsp;</td><td>VWR Collection</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>IB401031</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio Lite</td><td>Licor</td><td>N/A</td> https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ <td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 2차 항체</td>에서 무료 다운로드<td>Licor</td><td>--</td><td>1차 항체의 숙주에 대해 특이적인 적절한 2차 항체를 선택합니다.</td></tr><tr><td>Micro BCA 단백질 분석 키트</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Novex Sharp, 사전 염색 단백질 표준</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5800</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔, 1.0mm, 15웰</td><td>, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 시료 버퍼(4X),</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr>, <tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking</td><td>Buffer Licor</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610646</td><td>SMN/SMA 문헌에서 광범위하게 사용되며 로트 번호에 관계없이 일관된 결과를 제공합니다</td></tr>. <tr><td>REVERT 총 단백질 염색, 250 mL&nbsp;</td><td>라이코</td><td>926-11021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>REVERT 워시 솔루션&nbsp;</td><td>라이코르</td><td>926-11012&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 용해 및 추출 버퍼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock 미니 셀</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

서 부 럽 감지 하 고 단백질 식 계량 일반적으로 사용 되는 기술입니다. 년 동안,이 기술은 기초 및 임상 연구에 많은 발전을 주도하 고 있다. 그러나, 많은 유사한 실험 기법, 것과 같이 서쪽 오 점 분석의 결과 쉽게 영향을 설계 및 실험의 실행에서 만든 선택. 그러나 특정 가사 단백질 단백질 수준을 정량화에 대 한 정상화 하는 데 사용 되었습니다 전통적으로,, 이러한 제한 수 있고 따라서 점점 더 지난 몇 년 동안 강평 되었다. 여기, 우리는 우리가 다른 조직, (를 포함 하 여 질병 모델), 마우스 모델 및 발달 timepoints 단백질 표정 변화의 복잡 한 비교를 수행 하기 위해 수 있도록 개발 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 형광 총 단백질 얼룩을 사용 하 고 내부 로드 표준의 사용을 도입, 가능 하다 실험에서 비교 될 수 있는 고 단백질 수준에 걸쳐 체계적으로 비교 샘플 수에 기존의 한계를 극복 하는 다양 한 실험 조건입니다. 이 방법은 전통적인 서쪽 오 점 기법, 수 있도록 더 나은 다른 조직 및 샘플 단백질 식이 탐구 하는 연구자의 사용을 확장 합니다.

우리는 조직 및 시간 포인트 단백질 레벨의 비교를 용이 하 게 TPS는 내부 표준의 사용의 예제를 포함 합니다. 그림 1 은 신생아 (출생 후 5 일) (10 주 된) 성인 쥐 비교에서 얻은 조직에서 추출 하는 단백질에 서 부 럽에서 결과 보여줍니다. TPS 및 Smn immunoblot 그림 1A, C에에서 나와 있습니다. 각 레인에 사각형 상자 안에 형광 강도 측정 하 여 정량화는 TPS의 형광 강도의 달성 하 고 그 결과 그림 1B 및 1 D에서 테이블에 표시 됩니다. Note 샘플 다른 조직에서 다른 TPS 단백질 밴드 패턴에 의해 특징 및 따라서 그것은 정규화 목적에 대 한 전체 차선을 사용 하는 데 필요한. 실제로, 전체 차선을 분석할 때 형...

이 방법은 단백질 레벨과 다른 조직에서 표준화 된 양적 서쪽 더 럽 히 접근을 사용 하 여 다른 발달 timepoints에서의 비교에 대 한 강력 하 고 재현 가능한 방식을 설명 합니다.

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

이 프로토콜은 다른 조직 및 시간 점에 걸쳐 단백질 발현을 보고 근본적인 임상 연구에서 중요한 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 정량적 서양 얼룩을 수행하기 위해 형광 총 단백질 얼룩과 내부 적재 제어를 결합합니다. 이것은 실험 조건에 걸쳐 각종 조직을 비교할 때 생기는 한계를 극복합니다.스냅 냉동 세포 또는 조직 샘플에서 단백질을 추출하려면 표에 따라 샘플을 적절하게 세척하기 전에 얼음에 마이너스-80도 샘플을 해동하십시오. 폴리프로필렌 유봉이 있는 핸드헬드 전기 균질화제를 사용하여 세척된 샘플을 균질화하고, 이중 증류수로 유봉을 헹구고, 샘플 사이에 깨끗한 조직으로 건조시. 샘플을 얼음 위에 10분 간 두고 원심분리가 뒤따릅니다.그런 다음, 펠릿을 방해하지 않고 얼음에 새로운 튜브에 단백질 샘플 함유 슈퍼상체를 전송. 단백질 농도의 정량화를 위해, 트리플리케이트의 농도증가에 소 혈청 알부민 기준을 설정하고, 각 단백질 샘플의 마이크로리터 1개를 96웰 광학 플레이트의 적절한 우물에 중복하여 첨가한다. 단백질 농도가 낮을 것으로 예상되는 경우 60도 섭씨 열 블록에 단백질을 10분 이상 배양하고 플레이트 판독기에서 560 나노미터에서 흡수를 측정합니다.플레이트 판독기 측정을 내보내고 각 샘플의 평균 흡광도 값을 단백질 표준을 사용하여 얻은 표준 곡선과 비교하여 단백질 농도를 계산합니다. 단백질의 양을 정상화하기 위해, 샘플 버퍼및 초순수수에서 단백질 샘플의 희석을 준비하고 10분 동안 70도 섭씨 열 블록에서 시료를 배양한다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 놓고 소용돌이를 가하고 잠시 원심분리합니다.전기 포거의 경우, 젤 전기 전광 챔버 시스템에 4 ~ 12 %의 비스 트리스 그라데이션 젤을 설정하고 단백질 표준의 3.5 마이크로 리터를 우물에 로드합니다. 멤브레인 정상화를 위해 내부 표준을 사용하는 경우 단백질 사다리 옆에 있는 처음 세 개의 우물에 다른 샘플과 동일한 양을 적재하고 각 샘플의 30 마이크로그램을 나머지 우물에 적재합니다. 이어서, 스태킹 젤을 통해 샘플을 10분 동안 80볼트로 실행하고 45~60분 동안 150볼트를 추가로 실행한다.전기포광의 끝에서, 전달 스택을 조립하기 위해, 단백질 젤을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인을 포함하는 바닥 스택에 놓는 다음 필터 종이를 한다. 블로팅 롤러를 사용하여 기포를 제거하고 필터 용지 상단에 상단 스택을 놓은 다음 스택을 다시 롤링하여 기포를 제거합니다. 장치의 왼쪽에 전극을 가진 전체 스택을 전달 장치로 옮기고 스폰지가 장치의 해당 전기 접촉과 정렬되도록 스택 위에 젤 스폰지를 놓습니다.뚜껑을 닫은 후 적절한 프로그램을 선택하고 시작합니다. 프로그램이 끝나면 멤브레인을 젤 크기로 자르고 절단 막을 이중 증류수로 신속하게 세척한 후 총 단백질 얼룩을 계속 합니다. 총 단백질 염색을 위해, 단백질 측이 안쪽을 향하고 있는 50 밀리리터 튜브로 막을 굴려 연기 후드의 실온에서 5 분 동안 롤러에 단백질 얼룩 용액의 5 밀리리터로 막을 라벨.인큐베이션이 끝나면 5밀리리터의 워시 용액으로 멤브레인을 신속하게 세척하고 튜브를 세척 사이에 롤러로 간단히 되돌리고 초순수물로 짧은 헹구는 것입니다. 멤브레인에 블로킹 버퍼 3밀리리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 멤브레인을 롤러로 되돌려 보입니다. 블로킹 버퍼를 적절한 최적화된 농도에서 관심 있는 1차 항체로 교체하고 밤새 4도에서 롤러의 멤브레인을 배양한다.다음 날, 실온에서 롤러에 신선한 PBS의 5 밀리리터와 5 분 동안 멤브레인을 6 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 실온에서 1 시간 동안 롤러에 적절한 이차 항체 용액으로 멤브레인을 인큐베이션한 다음 세척당 30 분 동안 3 개의 세척을 합니다. 마지막 세척 후 멤브레인을 건조하고 알루미늄 호일을 사용하여 멤브레인을 빛으로부터 보호합니다.이미지 수집을 위해 단백질 측이 아래로 향하여 스캐너에 멤브레인을 배치하고 소프트웨어의 스캔 영역을 선택합니다. 그런 다음 두 채널모두에서 이미지를 획득하고 이미지를 적절한 이미지 분석 프로그램으로 내보냅니다. 700나노미터 채널을 표시하여 총 단백질 염색 결과를 표시하고 해석 및 그리기 사각형을 선택하여 정상화에 대한 관심 영역을 정의합니다.그런 다음 정의된 영역이 분석된 모든 레인에 대해 동일한 크기인지 확인하기 위해 첫 번째 사각형 영역을 각 개별 샘플에 복사하여 붙여 넣습니다. 각 차선의 단백질 농도를 정량화하기 위해 총 단백질 얼룩과 관심 있는 단백질모두에서 결과를 스프레드시트 프로그램에 복사하고 가장 높은 총 단백질 얼룩 신호를 결정합니다. 이어서, 각 총 단백질 얼룩 신호 값을 이 값별로 나누어 정규화된 단백질 적재값을 얻고 각 개별 샘플로부터 800나노미터 신호 값을 상응하는 정규화된 단백질 값으로 나누어 상이한 시료에서 상대단백질 발현비를 계산한다.이러한 대표적인 서양 얼룩에서, 산후 5마리의 마우스로부터 얻은 조직에서 추출된 단백질은 10주된 성인 마우스에서 추출한 단백질과 비교된다. 총 단백질 얼룩의 형광 강도의 정량화는 각 차선의 사각형 상자 내부의 형광 강도를 측정함으로써 달성되었다. 전체 차선을 분석할 때, 형광 강도는 시료 전반에 걸쳐 상대적으로 유사하게 유지되며, 이는 정규화를 위해 총 단백질 얼룩을 사용하는 것이 이러한 목적에 적합하다는 것을 나타냅니다.형광 총 단백질 얼룩은 또한 다른 발달 시간 지점에서 단백질 수준을 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 생존 운동 뉴런 단백질 수치가 마우스의 나이에 따라 명확하게 감소하지만, 총 단백질 염색 정량화는 일정하게 유지됩니다. 내부 표준, 형광 기반 정규화 및 적절한 통계를 사용하면 다양한 조건에서 복잡한 단백질 발현 분석의 견고성을 증가시킵니다.이 프로토콜은 전통적인 서양 얼룩 기술에 추가, 실험 배치에 걸쳐 적절한 로딩 제어 및 비교의 문제를 극복하고, 단백질 발현 분석을위한 유연성을 제공. 이 접근법은 그밖 실험 조건의 밑에 단백질 발현을 비교하기 위하여 확장될 수 있습니다.

robust-comparison-protein-levels-across-tissues-throughout

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 샘플에서 표적 단백질 발현을 정량화하기 위한 전체 단백질 정규화 기반 웨스턴 블로팅 기술을 보여줍니다. 샘플의 총 단백질 염색을 활용하여 비율계량 분석을 수행하여 표적 단백질의 상대적 발현 수준을 결정합니다.

단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)

V3 워크플로우는 얼룩이 없는 젤을 사용한 웨스턴 블롯 시술입니다. 얼룩없는 기술은 연구원이 단백질 분리 품질을 시각화하고, 전달 효율을 검증하며, 가장 중요한 것은 신뢰할 수있는 적단백질 정량화를 사용하여 관심있는 단백질의 변화를 검증 할 수 있게합니다.

서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 V3 얼룩 없는 워크플로우

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

형광을 이용한 웨스턴 블로팅(western blotting)의 발전으로 단백질 발현의 미묘한 변화를 감지할 수 있게 되어 정량 분석이 가능해졌습니다. 여기에서는 다양한 종과 조직 유형에 걸쳐 다양한 단백질을 검출하기 위한 강력한 방법론에 대해 설명합니다. 일반적인 기술 문제를 극복하기 위한 전략도 제공됩니다.

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

프로토콜 blotting 표준 서 500 조 혈 줄기 또는 조상 세포로 몇 가지 분석을 위해 최적화 되었다. 최적화 포함 셀 샘플의 처리, 튜브, 사이 전송 제한 및 직접 Laemmli 샘플 버퍼에 세포를 lysing 주의 한다.

조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

여기 설명 양적 점 오 점 분석 (QDB)의 상세한 과정 대상된 단백질의 절대 내용을 확인 하 여 상한 걸 단백질, 3 개의 다른 마우스 조직에서 gelsolin 같은 (CAPG), 합니다. 높은 처리량, 세포 및 조직 수준에서 바이오 마커 검증에 대 한 편리 하 고, 양적 immunoblot 기술을 설명합니다.

높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB)

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

여기, 선물이 편차를 줄이기 위해, 재현성, 개선 및 해석을 용이 하 게 하기 위해에서 RNA, DNA, 그리고 동일한 샘플에서 단백질의 격리에 대 한 프로토콜.

결합 된 뉴클레오티드와 꼬마 선 충 의 단백질 추출

이 기사에서는 면역블로팅을 통해 Xenopus 난모세포 및 배아의 단백질을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 수집 단계가 설명된 후 샘플 처리, SDS-PAGE, 전이, 항체 염색 및 이미징에 해당하는 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 내인성 항체 및 단백질 친화성 태그에 대한 항체를 사용한 번역 조절 단백질 복합체를 연구하는 것을 강조합니다.

면역블로팅에 의한 Xenopus 난모세포 및 배아의 단백질 최적화 분석

학습하세요 표준화된 정량적 웨스턴 블롯팅을 사용하여 다양한 조직과 발달 단계에서 단백질 수준을 비교하는 강력한 방법을. 형광 전체 단백질 염색과 내부 로딩 대조군을 결합하여 재현성 있는 결과를 얻습니다.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

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