Name: 공포 대조 신경 활동의 만성 조작을 위한 비침범성 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 배우세요 생쥐에서 비침범성 CNO 투여를 통한 만성 신경 활성 조절 방법입니다. 안약과 음수를 활용한 이 프로토콜은 동물 스트레스를 최소화하면서 DREADD 기반 화학유전학 연구의 효율성을 높입니다.

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이 작품은 정신 건강의 국립 연구소에서 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다 (ZIA MH002964-02). 우리는 NIMH IRP 설치류 행동 코어 (ZIC MH002952)의 지원에 감사드립니다.

모든 동물은 국립 정신 건강 연구소 (NIMH)의 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 처리되었습니다. 모든 노력은 통증과 사용되는 동물의 수를 최소화하기 위해 만들어졌다.
1. 해마에서 아데노 관련 바이러스 주사
참고: 혼합 배경(B6/129 F1 하이브리드, 3개월)의 야생형 수컷 마우스는 M3 무스카린 수용체(hM3Dq)를 해내로 인코딩하는 AAV를 입체적으로 주입하였다. 전체 실험 동안, 마우스는 일반 12 시간 빛 아래, 단일 보관했다: 12 h 어두운 (T24) 주기, 음식과 물 광고 리비툼에대한 액세스.
<ol><li>입체 외과 수술을 수행하기 전에 스테레오택 프레임과 필요한 모든 악기를 청소하고 살균하십시오. 참고: 수술용 커튼은 멸균 장을 유지하고 마우스의 열 손실을 줄이는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>이소플루란을 사용하여 마우스를 깊이 마취시다. 이렇게하려면 먼저 산소 유량계를 약 1.5 L / min으로 조정한 다음 이소플루란 기화기를 유도의 경우 약 3-5 %, 유지 보수를 위해 약 1-3 %로 조정하십시오.<ol>
<li>동물이 완전히 의식을 잃었을 수 있도록 마우스의 발을 꼬집습니다. 꼬치에 대한 플린칭 반응이 없을 때 동물이 제대로 마취됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스의 체온안정성을 유지하기 위해 가열 패드에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>머리 의 상단을 면도하고 스테레오 택시 프레임에 마우스의 머리를 고정합니다. 그런 다음 눈에 안구 보호 윤활제를 바르고, 포비도 요오드와 70 % 에탄올로 문질러 표면을 청소하고 멸균 메스를 사용하여 두개골을 노출시다.</li>
	<li>브레그마 포인트로 프레임을 보정한 다음, 해마를 표적으로 하기 위해 2.9 mm의 내측 좌표와 전방 후방 좌표 -2.7 mm로 드릴링합니다. 참고 : 다른 뇌 표적을 주입해야하는 경우 Paxinos 및 프랭클린 마우스 아틀라스16을사용하여 주입을위한 원하는 좌표를 결정하십시오.</li>
	<li>뇌가 노출되면, 마이크로인젝터를 사용하여 해마에서 -3.0 mm의 등쪽-복부 깊이에서 AAV의 90 nL을 일방적으로 주입하고 미세모세관 피펫을 뽑아냈다(그림 1A). 참고: 이 실험에 사용된 AAV의 기중기표는 참조하십시오. 다른 뇌 영역의 경우 필요에 따라 AAV 주입 볼륨을 조정합니다.</li>
	<li>수술이 끝나면 나일론 봉합사로 절개를 닫고 상처 부위에 국소 항생제를 적용하십시오.</li>
	<li>수술 직후 조직적으로 진통제 (buprenorphine, 0.1 mg /kg)를 투여하고 4-6 시간 후에 투여하십시오.</li>
	<li>시작 4 주 주입 후, 대상 마우스디자이너 흥분 수용체를 발현하는 만성 제어 뉴런에 다음 섹션에 설명 된 패러다임중 어느.</li>
</ol>2. 점안액을 이용한 반복적인 CNO 전달
<ol><li>안약 투여 전 3-4일 동안 매일 3분씩 각 마우스를 스크러핑하여 동물을 취급하도록 적응시킴.</li>
	<li>클로자핀-N-옥사이드(CNO, 5 mg)를 멸균 0.9% 식염수 용액 1mL에 용해하십시오(스톡 솔루션: 5 mg CNO/mL). 용액을 4°C로 냉장 보관하십시오.</li>
	<li>실험을 시작하기 전에 각 마우스의 무게를 측정하여 전달할 CNO의 양을 결정합니다. 1-3 μL 드롭(눈당)을 사용하여 1.0 mg 의 CNO/kg 체중을 달성하십시오. 참고: 예를 들어, 20g 마우스는 양측(각 2 μL) 점안액을 받아야 합니다.</li>
	<li>마우스의 비활성(light) 단계 동안 점안액을 전달하며, 2시간 전에 조명이 꺼집니다(zT 시간(ZT) 10). CNO가 마우스의 활성(어두운) 단계에서 전달되어야 하는 경우 적절한 동물 취급을 위해 희미한 빨간색 표시등이 있는지 확인하십시오. 참고: 실험 동물의 circadian (및 빛/어두운) 주기를 방해 하지 않도록 주의 해야 합니다.<ol>
<li>P10 마이크로파이펫을 사용하여 1.0 mg CNO/kg을 달성하기 위해 CNO 용액의 필요한 양(1-3 μL)을 적재하십시오. 참고: 각 점안액에 대해 새롭고 멸균된 파이펫 팁을 사용하십시오. 이 실험 세트에서, CNO의 양측 점안액이 수행되었다; 그러나, 더 낮은 CNO 농도가 요구되는 경우에, 일방적인 점안액은 또한 적용될 수 있었습니다.</li>
		<li>스크러프를 통해 마우스를 고정시.</li>
		<li>파이펫 팁에 안정된 물방울이 형성될 때까지 용액을 천천히 배출합니다.</li>
		<li>용액이 전달될 때까지 조심스럽게 물방울을 마우스 눈의 각막 가까이에 놓습니다. 파이펫 팁은 마우스의 눈에 닿지 않아야 합니다.</li>
		<li>마우스를 놓아 홈 케이지에 다시 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이 절차를 매일 5 일 동안 반복하십시오. 참고: 이 기간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>대조군 실험의 경우, AAV/DREADD 주입 마우스를 사용하여 가짜 치료(식염수만을 함유하는 점안액)를 실시하고, 설명된 CNO 점안액 프로토콜에 노출된 빈 벡터(예: AAV/mCherry)로 주입된 마우스를 사용한다.</li>
</ol>3. 식수를 통해 전달된 만성 CNO 처리
<ol><li>50 mL (플라스틱) 원두 튜브와 고무 스토퍼 주유를 사용하여 작은 병을 만드십시오. CNO 안정성에 대한 광 매개 효과를 피하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다.</li>
	<li>CNO 처리를 시작하기 3일 전에, 일반 물병을 10 mL의 일반 물을 함유하는 작은 병으로 교체하여 쥐가 적응할 수 있도록 하십시오. 테이프를 사용하여 병을 케이지에 고정합니다.</li>
	<li>각 마우스의 일일 물 소비량측정.</li>
	<li>실험을 시작하기 전에 각 마우스의 무게를 측정합니다.</li>
	<li>0.9% 멸균 식염수 용액의 1 mL에 클로자핀-N-옥사이드(CNO, 5 mg)를 용해하십시오. 재고 용액을 4°C에서 냉장 보관하십시오.</li>
	<li>1.0 mg CNO/ kg (체중)을 달성하기 위해 CNO 용액의 농도를 정의하기 위해 소비 된 물의 체중과 평균 양을 사용합니다. 참고 : 성인 남성 마우스 (~ 20g 체중)는 하루에~ 5 mL의 물을 섭취합니다 (그림 2A). 따라서 1 mg CNO/kg의 CNO 농도를 달성하려면, 6.4 μL의 CNO 스톡 용액을 8 mL의 최종 부피(최종 농도: 4 μg CNO/mL)에 첨가해야 한다. 따라서, 하루에 5 mL 물을 마시는 20g 동물에 대한 CNO의 용량은 1 mg CNO / kg을 초래합니다.</li>
	<li>농도의 범위를 테스트하여 최소한의 CNO 농도로 최대 효과를 표시하는 최적의 CNO 용량을 결정합니다. 식수 방법에 대한 최적의 CNO 용량을 결정하기 위해 용량 응답 분석을 수행합니다. 참고: 다음 CNO 용량은 이 실험을 위해 시험되었다: 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.1 mg/mL, 및 식염수. 1.0 mg CNO/kg은 i.p. 및 점안제 프로토콜에 기초하여 처음 시험되었다.</li>
	<li>1일째에는 8 mL의 일반 물로 병을 채우고 필요한 양의 CNO를 추가하십시오. 참고 : 이 양의 물은 성인 남성 마우스에 대한 광고 리비텀 물 액세스 24 시간 충분합니다. 다른 설치류 종을 사용하는 경우, 먼저 필요한 양을 결정하기 위해 매일 소비되는 물의 양을 측정합니다.</li>
	<li>프로토콜 전반에 걸쳐 동물의 건강을 모니터링하여 물 + CNO 소비로 인한 부작용이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>24 시간 후, 담수 + CNO 용액으로 병을 교체하십시오. 전날 소비된 볼륨을 기록합니다.</li>
	<li>폐기물 용기에 소모되지 않은 물 + CNO 용액을 폐기하십시오. 플라스틱 병을 버리고 동물 시설 지침에 따라 소독 한 후 매일 고무 마개 교체하십시오. 참고: 수성 폐기물을 유기 용매와 혼합하지 마십시오. 보관 및 픽업에 대한 지침은 화학 물질 폐기 서비스에 문의하십시오.</li>
	<li>병을 매일 같은 시간에 5일 동안 교체하십시오. 참고: 이 기간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>단계 2.6에 설명된 대로 대조군을 포함한다.</li>
</ol>4. 자당에 대한 마우스의 선호를 사용하여 제한된 CNO 치료
<ol><li>CNO 처리를 시작하기 3 일 전에, 바람직하게는 원래 물 병에서 멀리 케이지에 물 10 mL + 1 % 자당을 포함하는 작은 병을 놓습니다. 참고: 3.1단계에 설명된 것과 동일한 작은 병을 사용하십시오.</li>
	<li>활성 단계의 마지막 부분 (ZT 18 – 24)동안 동물을 물에 노출 + 1 % 자당. 이 노출 후 케이지에서 물 + 자당으로 병을 제거하십시오. 참고: CNO 배달의 다른 시간 창을 사용할 수 있습니다. 추가적으로, 마우스는 CNO 납품을 촉진하기 위하여 빛의 개시가 저녁 시간에 생기는 반전된 빛/어두운 주기의 밑에 놓일 수 있었습니다.</li>
	<li>각 마우스에 대한 일일 물 + 1 % 자당 소비를 측정합니다.</li>
	<li>실험을 시작하기 전에 각 마우스의 무게를 측정합니다.</li>
	<li>1.0 mg CNO/kg(체중)을 달성하기 위해 CNO 용액의 용량을 결정하기 위해 소비된 체당 +1%의 물 중량과 평균 양을 사용하십시오. 참고: 단계 3.6에서 설명한 대로 최소한의 CNO 농도로 최대 효과를 나타내는 최적의 CNO 용량을 테스트해야 합니다.</li>
	<li>1일째에는 5 mL의 물 + 1% 자당 + CNO(1 mg CNO/Kg)로 병을 채우고 정해진 시간 동안 케이지(항상 같은 장소에)에 놓습니다.</li>
	<li>제한된 시간 창의 끝에서, 병을 제거하고 소비 물 + 자당 + CNO의 양을 측정합니다. 참고: 재료 및 용액은 3.11 단계에서 설명한 대로 소독되거나 폐기됩니다.</li>
	<li>이 절차를 매일 5 일 동안 반복하십시오. 참고: 이 기간은 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>단계 2.6에 기재된 바와 같이 대조군을 포함한다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>마지막 반복적 (5 일째) CNO 눈 방울을 받은 후 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 내측으로 마우스를 침전시. CNO가 식수를 통해 전달되면 마우스의 활성 단계 끝에 있는 물로 CNO + 물을 교체한 다음 CNO 후 2시간 또는 6시간 후에 마우스를 침전시십시오. 참고: 빛 노출이 관심 영역의 c-Fos 유도에 영향을 줄 수 있는 경우, 실험 마지막 날과 관류 전에 마우스를 일정한 어둠 속에 보관하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 뇌를 해부하고 9-12시간 동안 4% PFA 용액에 담급전시.</li>
	<li>PFA 고정 후, 30 % 자당 용액을 사용하여 뇌 조직을 냉동 보호 (뇌가 가라 앉을 때까지 기다립니다), 다음 저온 중지를 사용하여 뇌를 섹션.</li>
	<li>상동맥 뇌 섹션(35 μm)을 1x PBS, 10% 소 혈청 알부민, 0.3% 트리톤 X-100을 실온에서 1시간 동안 함유하는 용액으로 옮니다.</li>
	<li>항 C-Fos (1:2500) 항체 용액으로 뇌 절편을 4 °C에서 밤새 일정한 교반으로 배양합니다.</li>
	<li>1x PBS 및 0.3% 트리톤 X-100을 함유하는 용액으로 각각 5분씩 3회 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 알렉사 컨쥬게이트 이차 항체(1:500) 용액으로 샘플을 배양하고 일정한 교반을 갖는다.</li>
	<li>공초점 현미경을 사용하여 디지털 이미지를 가져옵니다. 사진 편집 및 분석 소프트웨어(예: Adobe Photoshop)를 통해 캡처된 이미지를 조립하고 처리합니다.</li>
	<li>데이터 분석을 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 AAV 감염 영역(mCherry(+) 셀을 개략적으로 설명하고 측정하고 이 영역 내의 c-Fos(+) 셀 수를 정량화하여 영역당 활성화된 셀 수를 얻습니다. 동물 당 3 개의 개별 섹션에서 얻은 결과를 결합하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

공포는 원격으로 신경 활동을 조작하는 대중적이고 효과적인 접근법으로 등장했다17. CNO 제공을 위한 대체 전략설계는 특정 실험 설정에 사용할 수 있는 옵션의 스펙트럼을 광범위하게 증가시킬 것입니다. 또한, CNO의 전달을 위한 비침습적 전략은 동물의 건강에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 부작용을 감소시킴으로써 결과의 잠재적인 오해를 최소화합니다. 여기에서는 DREADDs(hM3Dq)의 강력한 활성화를 제공하고 다양한 가능성을 제공하는 CNO 전달을 위한 두 가지 비침습적 전략을 설명했습니다. 추가, 우리는 여기에서 기술된 프로토콜이 또한 유전으로 조작된 muscarinic 또는 opioid 수용체를 포함하여 신경 조작을 위한 다른 DREADD 이체를 위해 유용할 지도 모른다는 것을 믿습니다.
반복적인 점안액을 사용한 CNO 전달은 CNO 전달의 복용량과 타이밍을 정밀하게 제어하는 힘을 유지하면서 반복적인 복강 내 CNO 주사에 대한 고...

신경 과학 분야의 기술적 진보로 인해 과학자들은 특정 신경 인구의 활동을 정확하게식별하고 제어 할 수 있었습니다 1. 이것은 신경 회로의 기초와 동물 행동에 미치는 영향을 더 잘 이해하는 데 기여했으며, 확립된 교리 2,3을개정했습니다. 이러한 새로운 도구 중, 광유전학 및 화학 유전학 전략은 발견의 품질뿐만 아니라 실험이 생각되고 설계되는 방법에뿐만 아니라 깊은 영향을 미쳤다4. 본 원고에서, 우리는 엔지니어링 수용체 -ligand 전략을 통해 뉴런의 활성화를 제어하기위한 화학 유전 적 전략에 초점을 맞추고 있습니다. 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화 디자이너 수용체 (DREADDs) 신경 활동의 원격 제어를위한 가장 인기있는 화학 유전 도구 중 하나를 나타냅니다, Roth에 의해 검토 20165. 공포는 불활성 리간드, 클로자핀-N-산화물 (CNO) 6에 의해 특별히 활성화되는 변형 된무스카린 아세틸 콜린 수용체를 이용한다.
대부분의 연구는 효과적으로 급성 방식으로 엔지니어링 된 수용체 활성화의 복용량과 타이밍을 제어 복강 내 (i.p.) 주사에 의해 투여 CNO를 사용합니다. 그러나, 반복적 또는 만성 DREADD 활성화가 필요한 경우, 다중 i.p. 주사의 사용은 불가능하게된다. 이 문제를 해결하기 위해, 만성 CNO 전달을위한 다른 전략이보고되었다, 이식 미니 펌프를 포함7 두개내 캐뉼러 8,9. 상이한 범위에서, 이들 모든 전략은 동물에게스트레스와 통증을 유발하고, 11을 시험하기 위해 행동 반응에직접적인 영향을 미칠 수 있는 외과적 개입을 요구한다. 여기에서는, 우리는 만성 CNO 납품을 위한 3개의 비침범성 전략을 기술합니다.
이를 위해, 마우스는 리간드 CNO에 의해 활성화될 때 폭발적인 발사로 이어지는 흥분성 M3 무스카린 수용체(hM3Dq)의 엔지니어링 버전을 코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 해마에 입체적으로 주입하였다. 뉴런6. 이전에는 CNO를 포함하는 단일 안약이 DREADD 발현 뉴런(12)의 강력한활성화를 효과적으로 유도할 수 있음을 보여주었다. 여기서 우리는 점안액의 반복적인 전달을 위한 수정된 방법을 기술한다. 디자이너 수용체의 만성적이고 지속적인 제어를 달성하기 위해, 우리는 다음 식수를 통해 마우스에 CNO를 제공하기 위해 비 침습적 전략을 설명합니다. 마지막으로 제한된 시간 동안 식수에 CNO를 제공하기 위한 대체 패러다임을 설명합니다. 마우스 운동 활동뿐만 아니라 음주 행동 및 달콤한 칼로리 용액의 소비는 주로 빛 / 어두운 주기(13,14)의어두운 부분으로 제한된다. 따라서, 우리는 자당에 대한 마우스의 선호도에 따라 프로토콜을 채택했다. AAV 감염 된 세포에서 즉각적인 초기 유전자 c-Fos의 유도를 측정 하 여, 신경 활성화에 대 한 판독으로12,15,우리는 이러한 CNO 전달 전략 강력 하 게 확장 이상 DREADD 제어 뉴런을 활성화 발견 기간.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>시그마 생명 과학</td><td>#A2153-100G</td><td>동결건조 분말 &ge; 96% (아가로스 겔 전기영동)</td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>The Jackson laboratory</td><td>#000664</td><td>수컷 마우스, 3개월 된</td></tr><tr><td>모세</td>혈관 <td>Drummond Scientific Company</td><td>#3-000-203-G/X</td><td>외경: 1.14 inch</td></tr><tr><td>Clozapine-N-oxide</td><td>Sigma</td><td>#C0832</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>Forane</td><td>Baxter</td><td>#NDC 10019-360-60</td><td>Isoflurane, USP</td></tr><tr><td>Microinjector III</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>#3-000-207</td><td>Nanoject III - 프로그래밍 가능한 나노리터 주입기</td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>Invitrogen</td><td>#P36930</td><td>Prolong Gold antifade reagent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#15710</td><td>16% 수용액(메탄올 무함유), 10mL</td></tr><tr><td>1차 c-Fos 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>#2250S</td><td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb ( 100&마이크로; L)</td></tr><tr><td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td><td>UNC 벡터 코어</td><td></td><td>역가: ~3 x 1012 vg/mL</td></tr><tr><td>rAAV5/hSyn-mCherry</td><td>UNC 벡터 코어</td><td></td><td>역가: ~3x10e12 vg/mL</td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>#A21206</td><td>Alexa Fluor TM 488 당나귀 항토끼 IgG(H+L), 2mg/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>americanbio.com</td><td>#AB02025-00100</td><td></td></tr></tbody></table>

공포 대조 신경 활동의 만성 조작을 위한 비침범성 전략

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

화학 유전학 전략은 신경 활동의 원격 제어를위한 신뢰할 수있는 도구로 등장했다. 이 중, 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화 디자이너 수용체 (DREADDs) 현대 신경 과학에 사용되는 가장 인기있는 화학 유전 적 접근 방식이되고있다. 대부분의 연구는 단일 복강 내 주사를 사용하여 리간드 클로자핀-N-옥사이드(CNO)를 전달하며, 이는 표적 뉴런 집단의 급성 활성화/억제에 적합합니다. 그러나, DREADD 통제된 신경의 만성 변조를 위한 전략의 단지 몇몇 보기가 있습니다, 대다수는 외과 적 개입을 요구하는 납품 시스템의 사용에 의존합니다. 여기에서, 우리는 마우스에 있는 신경 인구를 만성조작하기 위하여 리간드 CNO를 전달하기 위한 2개의 비침범성 전략에 확장합니다. CNO는 반복적인 (매일) 점안액을 사용하거나 동물의 식수를 통해 만성적으로 투여되었습니다. 이러한 비침습적 패러다임은 CNO 치료 전반에 걸쳐 지속되는 디자이너 수용체의 강력한 활성화를 초래한다. 여기서 설명된 방법은 신경 활동의 만성 DREADD 매개 제어에 대한 대안을 제공하며 덜 침습적인 CNO 전달 방법에 초점을 맞추어 자유롭게 움직이는 동물의 행동을 평가하도록 설계된 실험에 유용할 수 있습니다.

우리는 점안액을 이용한 반복적인 CNO 전달이 대부분의 감염된 뉴런에서 c-Fos 발현의 강력한 유도를 유도한다는 것을 관찰했습니다(그림1C),반복적인 노출 동안 CNO 전달의 효과가 지속됨을 보여주는. 더욱이, CNO 처리 후 2시간 수집된 시료에서 c-Fos의 유의한 유도가 관찰되었고, CNO 노출 후 6시간 수득된 샘플과 비교하여(도1D-E),CNO에 의해 유도된 변화가 시간에 의존한다는 것을 입증하였다.
그런 다음 식수를 통해 전달되는 만성 CNO 치료의 효과를 측정했습니다. 우리는 물 + CNO의 일일 소비량이 일반 물의 총 량과 크게다르지 않다는 것을 관찰했습니다 (그림 2A). 유사하게, 밤 동안 소비된 물 +1% 자당의 양(6 시간 창)은 CNO의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다(도2B).</...

여기에서 우리는 마우스에 있는 화학유전학을 사용하여 만성적으로 신경 활동을 통제하는 2개의 비침범성 방법을 기술합니다. 점안액은 클로자핀-N-산화물(CNO)을 매일 전달하는 데 사용되었습니다. 우리는 또한 식수에서 CNO의 장기간 투여를위한 두 가지 방법을 설명합니다. 만성 신경 조절을 위한 이러한 전략은 동물의 스트레스를 줄이는 최소한의 개입이 필요합니다.

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDs는 신경 활동의 원격 제어를 위한 가장 인기 있는 화학 요법 접근 법. 여기서 우리는 덜 침습적 CNO 전달 방법에 초점을 맞추고 반복적 또는 만성 DREADD 제어를위한 새로운 대안을 제공합니다. 우리는 반복적인 점안액에 의하여 마우스에 있는 장기간된 CNO 납품을 위한 2개의 전략을 기술합니다, 또는 동물의 식수를 통해 만성적으로.여기에 설명된 프로토콜은 다른 DREADD 변이체, 조직 또는 종을 포함하여 다양한 실험 설계에 적응할 수 있는 CNO 납품을 위한 만성 및 비침습적 선택권의 예입니다. CNO 배달의 주요 문제는 동물의 스트레스와 통증입니다. 이러한 프로토콜은 이 문제를 최소화하며 다양한 실험 설정에 쉽게 수행하고 적응할 수 있습니다.수술을 수행하기 전에 스테레오 탁스 프레임과 필요한 모든 악기를 청소하고 살균하십시오. 프레임이 준비되면 마취 된 혼합 배경 야생 형 남성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 응답부족을 확인하고 머리 의 상단을 면도하고 마우스의 머리를 프레임에 고정시하십시오. 그런 다음 안구 보호 윤활유를 눈에 바르고 마지막으로 순차적인 포비도네 요오드와 70 % 에탄올 스크럽으로 노출된 피부를 청소하십시오.멸균 메스를 사용하여 두개골을 노출하고 골격을 bregma 지점으로 보정합니다. 2.9밀리미터의 중간 좌표로 드릴링하고, 전방 후방 좌표가 영하 2.7밀리미터의 좌표를 사용하여 해마를 표적으로 한다. 뇌가 노출되면 마이크로 인젝터를 사용하여 마이크로 인젝터를 사용하여 adenoassociated 바이러스의 90 나노리터를 영하 3mm의 등쪽 복부 깊이에서 해마에 일방적으로 주입하십시오.그런 다음 나일론 봉합사로 절개를 닫고 진통 투여를 위해 프레임에서 동물을 제거합니다. 반복적인 CNO 전달의 경우, 4주 후 주입을 시작으로, 각 마우스를 3~4일 동안 매일 3분씩 스크러핑하여 동물을 처리하도록 적응한다. 마우스가 처리에 익숙해지면, 각 마우스의 무게를 측정하여 체체중 농도의 킬로그램당 CNO의 1밀리그램을 달성하기 위해 전달되는 적절한 양의 CNO를 결정한다.비활성 단계에서 불이 꺼지기 2시간 전에 준비된 CNO 용액의 1~3마이크로리터를 P10 마이크로파이프에 적재하고 스크러핑을 통해 마우스를 고정합니다. 파이펫 팁에 안정된 액적이 형성될 때까지 용액을 천천히 배출하고 피펫 끝을 마우스눈에 건드리지 않고 용액이 전달될 때까지 물방울을 각막 가까이에 두십시오. 그런 다음 다음 동물의 눈에 CNO 안약을 적용하기 전에 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.마우스 활성 단계에서 CNO를 전달해야 하는 경우 적절한 동물 취급 및 CNO 전달을 위해 희미한 빨간색 표시등이 있는지 확인합니다. 만성 CNO 치료의 경우, 4 주 후 주입 및 치료를 시작하기 3 일 전에 일반 물병을 고무 주물로 멈추고 일반 물 10 밀리리터가 들어있는 알루미늄 호일로 덮인 작은 병으로 교체하십시오. 쥐가 병에 적응할 수 있도록 테이프로 케이지에 고정하십시오.각 마우스의 일일 물 소비를 측정하고 각 마우스의 무게를 측정합니다. 최소한의 CNO 농도로 최대 효과를 표시하는 용량을 결정하기 위해 다양한 CNO 농도를 테스트합니다. 그런 다음 각 작은 병을 8 밀리리터의 일반 물과 필요한 양의 CNO로 채웁니다.제한된 CNO 치료의 경우, 4 주 후 주입을 시작하고 치료를 시작하기 3 일 전에, 동물의 활성 단계의 마지막 부분 동안 원래 물 병에서 멀리 10 밀리리터 플러스 1 %의 자당을 포함하는 작은 병을 케이지에 놓습니다. 노출이 끝나면 각 케이지에서 물과 자당 용액을 제거하고 각 동물에 대한 자당 물 소비를 측정합니다. CNO 배달의 경우 병을 5 밀리리터의 물과 1% 자당, CNO 킬로그램당 1밀리그램으로 채우하십시오.활성 단계의 마지막 부분 동안 설탕 물 적응 기간 동안과 동일한 위치에 병을 배치, 병을 제거하고 활성으로 소비 된 물, 자당 및 CNO의 양을 측정. 실험이 끝나면 치료된 동물 뇌를 신선한 고정제로 수확하십시오. 9~12시간 후에, 냉동은 30% 자당 용액으로 뇌 조직을 보호합니다.뇌가 가라앉으면 극저온에 샘플을 섹션으로 바침합니다. 모든 뇌 단면이 얻어지고 비특이적 결합이 막히면, 조직 샘플을 지속적인 동요로 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 항-C-Fos 항체 용액으로 배양한다. 다음 날 아침, 적절한 형광이 결합된 이차 항체로 시료를 배양하기 전에 세척당 신선한 PBS로 3개의 5분 세척으로 샘플을 세척합니다.실내 온도에서 1 시간 후 빛으로부터 보호 일정한 동요, 형광 공초점 현미경 에 의해 표시 된 조직 섹션의 디지털 이미지를 얻을. ImageJ에 이미지를 로드한 후, 아데노-연관된 감염된 mCherry 양성 세포의 영역을 측정하고 영역당 활성화된 세포 수를 얻기 위해 이 영역 내의 C 거짓 양성 세포의 수를 정량화한다. 점안액을 이용한 반복적인 CNO 전달은 CNO 전달의 효과가 반복노출 중에 지속된다는 것을 보여주는 대부분의 감염된 뉴런에서 cFos 발현의 강력한 유도를 유도합니다.더욱이, CNO 노출 후 6시간 후에 수득된 시료에 비해 CNO 처리 후 2시간 후에 수집된 샘플에서 cFos의 중요한 유도가 관찰되며, 이는 CNO에 의해 유도된 변화가 시간에 따라 달라진다는 것을 나타낸다. 물과 CNO의 일일 소비량은 소비된 일반 물의 총 부피와 크게 다르지 않습니다. 유사하게, 밤에 소비되는 물량과 1%의 자당은 CNO의 첨가에 의해 영향을 받지 않으며, 5일간의 실험 기간 동안 관찰된 물 플러스 CNO, 물 플러스 자당 플러스 CNO의 일일 소비에 차이가 없습니다.CNO 점안액의 적용과 유사하게, cFos의 강력한 유도는 2 후에 관찰됩니다, 그러나 CNO 식수 접근의 6 시간. 또한, CNO 투여량이 낮을수록 식염수 조절에 비해 cFos 활성화를 유도하지 않는 반면, 더 높은 용량은 견고하고 유사한 cFos 유도를 유도하기 때문에 CNO에 대한 명확한 효과 임계값이 있다. 신경 활성화를 크게 감소시키지 않는 가장 낮은 CNO 용량을 정의하기 위해 용량 반응 분석을 수행하고, 리간드로서의 사용 클로자핀을 고려하는 것이 좋습니다.여기에서 우리는 신경 활성화의 결과로 CNO 매개 cFos 유도를 사용하여 시연했습니다. 그러나, 이러한 프로토콜은 전기 생리학적 분석 또는 행동 시험에 쉽게 채택될 수 있다. DREADD 기술은 신경 활동의 원격 제어를 위한 강력한 도구이며 CNO 전달을 위한 대체 전략을 설계합니다.우리는 실험 적인 설정 및 잠재적인 임상 내정간섭을 위한 선택권의 스펙트럼을 증가할 것입니다.

non-invasive-strategies-for-chronic-manipulation-dreadd-controlled

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Zhan, J., et al. DREADD로 제어되는 신경 활동의 만성 조작을 위한 비침습적 전략. J. Vis. Exp. (2019) 이 비디오는 표적 신경 조절을 위한 비침습적 안과 약물 전달 방법을 보여줍니다. 약물은 점안액을 통해 전달되어 순환계로 흡수되어 혈액뇌 장벽을 통과하고 특정 신경 수용체를 활성화합니다.

마우스 모델에서 비침습적 신경조절을 위한 안과용 약물 전달

목적은 새로운 방법, neuropathic 고통과 spasticity의 관리를위한 호흡 제어 전기 자극 (BreEStim)를 제시하는 것입니다.

Neuropathic 고통과 Spasticity의 관리를위한 호흡 조절 전기 자극 (BreEStim)

여기에서는 약물의 미세 주입에 의한 뇌 심부 구조 억제와 동시 전기 생리학적 기록을 통한 실시간 모니터링이라는 두 가지 기능을 가진 유리 피펫을 제작합니다.

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이 프로토콜 영구 epicranial 전극 소켓 설치류에 이식된 가슴 전극에 대 한 수술 설정을 설명합니다. 두 번째 전극 소켓에 두어서 transcranial 전기 두뇌 자극의 종류 그대로 두개골을 통해 경고 동물에서 모터 시스템에 전달할 수 있습니다.

경고 설치류에 Transcranial 전기 두뇌 자극

이 상세한 프로토콜 transcranial 전기 자극 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 단기 및 장기 효과 조사 하기 위하여 측 뼈에 transcranial 자극 전극 배치를 설명 합니다.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

프로토콜의 목표는 뇌에서 비 침습적 신경 병변을 생산하기위한 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 자기 공명 유도 집중 초음파 (MRgFUS)를 사용하여 뇌 의 parenchyma에 순환 신경 독소를 제공하기 위해 일시적이고 초점 방식으로 혈액 뇌 장벽을 엽니 다.

뇌 회로의 비 침습적 단절에 대한 표적 신경 부상

이 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐에서 이식된 배근 신경절(DRG)을 수확하고 배양하는 기술을 제공합니다.

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

여기에서는 화학적으로 재프로그래밍된 줄기세포를 엔지니어링하여 이러한 세포를 도파민성 전구세포로 분화하고, 파킨슨병의 마우스 모델에 이식하고, 이식된 세포의 성공적인 통합 및 기능적 효과를 확인하기 위해 행동 및 전기생리학적 결과를 평가함으로써 정확한 신경 조절을 달성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

신경퇴행성 질환 치료에서 재프로그래밍된 줄기세포 유래 전구세포의 화학유전학적 조절

배우세요 생쥐에서 비침범성 CNO 투여를 통한 만성 신경 활성 조절 방법입니다. 안약과 음수를 활용한 이 프로토콜은 동물 스트레스를 최소화하면서 DREADD 기반 화학유전학 연구의 효율성을 높입니다.

공포 대조 신경 활동의 만성 조작을 위한 비침범성 전략

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