Name: 로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 학습하세요 Rho-kinase 억제제를 이용한 hiPSC 유래 심근 세포의 생착 강화 방법을. 마우스 심근 경색 모델에서 세포 이식 효율을 높이는 저비용 효율적인 기술입니다.

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저자는 조셉 C. 우 박사에게 감사드립니다 (스탠포드 대학) 친절하게 Fluc-GFP 구조와 박사 얀웬 리우 우수한 기술 지원을 제공. 이 연구는 국립 보건원 에서 지원되는 HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (J.Z.), HL121206A1 (L.Z.), R56 보조금 HL142627 (미국 하트 협회) 16SDG30410018, 버밍엄 학부 개발 보조금에서 앨라배마 대학 (W.Z.에).

이 연구결과의 모든 동물 절차는 버밍엄에 있는 알라바마 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 건강 실험실 동물 관리 및 사용 지침의 국립 학회 (NIH 간행물 No)에 근거를 두어 85-23).
1. 문화미디어및문화판의준비
<ol><li>
중간 준비
	<ol>
<li>hiPSC 배지의 경우, 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 기저 배지 (재료표1) 및 hPSC 5x 보충제 의 100 mL의 400 mL를 혼합; 혼합물을 4 °C에 보관하십시오.</li>
		<li>RPMI 1640/B27 마이너스 인슐린(RB-) 매체의 경우, RPMI 1640 의 500 mL과 B27 보충제의 10 mL을 혼합하여 인슐린을 빼내.</li>
		<li>RPMI 1640/B27(RB+) 매체의 경우, RPMI 1640, B27 보충제 10 mL, 페니실린-스트렙토마이신(펜 스트렙) 항생제 5mL를 혼합합니다.</li>
		<li>정화 매체16의경우, 무포도당 RPMI 1640, B27 보충제 10 mL, 펜 스트렙 항생제 5 mL 및 DL-젖산 나트륨 용액 1,000 μL (최종 농도 4 mM)을 혼합하십시오.</li>
		<li>중화 용액의 경우, RPMI 1640, 태아 소 혈청 50 mL (FBS), 2.5 mL의 펜 스트렙 항생제, 50 μL의 Y-27632 (최종 농도 10 μM)를 혼합하십시오.</li>
		<li>동결 매체의 경우, FBS 9 mL, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 1mL, Y-27632 10 μL(최종 농도 10 μM)을 혼합합니다.</li>
		<li>세포외 매트릭스 용액(EMS)의 경우, 4°C에서 집중된 세포외 매트릭스(재료표1)를 균일하게 일관된 액체 상태에 도달할 때까지 해동합니다. 얼음에 각각 350 μL의 매트릭스 aliquots를 만들기 전에 예냉각 파이펫 팁과 튜브, -20 °C에서 알리쿼트저장. 플레이트를 코팅하기 전에, 얼음 차가운 DMEM / F12 배지 (EMS)의 24 mL로 해동 된 알리쿼트 하나를 희석하십시오. EMS를 최대 2주 동안 4°C로 유지하십시오. 참고: 지하 멤브레인 매트릭스 응고를 방지하기 위해 얼음에 모든 코팅 단계를 수행합니다.</li>
		<li>Tyrode의 용액의 경우, 최종 필요한 양의 조직 배양 등급의 물을 취하고, 다음 시약의 적당량을 추가하고, 용해될 때까지 저어줍니다. 그런 다음 1 N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 염화나트륨 140 mmol/L, 염화마그네슘 1mmol/L, 염화마그네슘 10m몰/L HEPES, 염화칼륨 5mmol/L, 염화10mmol/L, 염화칼슘 1.8mmol/L의 최종 농도에 물을 추가합니다. 0.22 μm 멤브레인을 사용하여 여과에 의한 살균.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 배양 플레이트 코팅
	<ol>
<li>hiPSC 배양 플레이트의 경우, 6웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 EMS를 적용하고 37°C에서 적어도 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 세포를 시드하기 전에 흡인 DMEM / F12 용액.</li>
		<li>젤라틴 코팅의 경우, 0.2 g의 젤라틴 분말을 조직 배양 등급의 물에 용해하여 0.2% (w/v) 용액을 만듭니다. 121°C, 15psi에서 30분 동안 오토클레이브하여 멸균. 용액의 2 mL로 6웰 플레이트의 각 웰을 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 통과하기 전에, 용액을 흡인하고 플레이트가 조직 배양 후드 내부의 실온에서 적어도 1 시간 동안 건조되도록한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hiPSC 유지 보수 및 심근 세포 분이
<ol><li>hiPSC 배지에서 hiPSCs를 배양(단계 1.1.1 참조)을 세포가 웰당 80%-90% 합류에 도달할 때까지 일일 배지 변화를 배양합니다. 참고: 유지 보수를 위해 hiPSCs는 일반적으로 4 일마다 통과 할 준비가되어 있습니다.</li>
	<li>hiPSCs를 통과하려면 배지를 흡인하고 1x 인산완식염수(PBS)로 잘 1x를 세척합니다. 0.5 mL의 줄기 세포 분리 용액을 추가 (재료의 표1) 각 우물에 5-7 분 동안 37 °C에서 배양. 참고: 배양 시간은 현미경으로 관찰 할 수있는 세포의 밀도와 해리 속도에 달려 있습니다.</li>
	<li>5 μM Y-27632로 보충된 hiPSC 배지 1 mL로 줄기 세포 분리 솔루션을 중화하십시오. 혼합물을 15 mL 원심분리기 튜브에 모읍니다. 200 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상월체를 흡인한 다음, 5 μM Y-27632를 함유하는 hiPSC 배지의 1 mL에서 세포를 재중단한다.</li>
	<li>hiPSCs를 1:6 에서 1:18 사이의 비율로 새로운 EMS 코팅 된 6 웰 플레이트에 시드합니다. 24시간 후에 Y27632 없이 배지를 hiPSC 매체로 변경합니다.</li>
	<li>세포를 동결시키기 위해, 0.5-1백만/500 μL의 농도로 동결 배지에 해리된 hiPSCs를 다시 중단하고, 현탁액을 극저온에 놓고-80°C 냉동실에 보관하십시오. 24 시간 후에 액체 질소로 냉동 된 바이알을 옮김.</li>
	<li>분화하기 위해, hiPSC 배지를 80%-90% 세포 합류에서 10 μM GSK-3β 억제제 CHIR99021(CHIR)으로 보충한 2 mL의 RB-배지로 대체한다. 배지를 24시간 후 RB-배지의 3 mL로 교체하고 추가로 48시간(3일째)을 배양한다.</li>
	<li>3일째에, 48시간(5일째)에 대해 10 μM Wnt 억제제 IWR1로 배지를 3 mL로 바꾼 다음, 배지를 RB-배지의 3 mL로 교체하고 48시간(7일째)동안 유지한다.</li>
	<li>7일째에는 배지를 RB 배지 3mL로 교체하고 3일마다 배지를 변경합니다. hiPSC-CMs의 자발적인 박동은 일 7-10 사이에서 관찰되어야 합니다.</li>
</ol>3. hiPSC-CM 정화 및 소분자 전처리
참고: 고도로 정제된 재조합 세포 해리 효소(표1)를 hiPSC-CM을 해리하는 데 사용하였다.
<ol><li>hiPSC-CM 분화 후 21일째에 배지를 흡인하고 세포를 멸균 된 PBS로 1 x 씻어 내다. 37 °C에서 5-7 분 동안 잘 당 0.5 mL의 세포 해리 효소로 세포를 배양하십시오. 세포를 철저히 해리시키기 위해 1 mL 파이펫을 사용하여 셀 현탁액을 반복적으로 피펫.</li>
	<li>세포가 해리 된 후, 각 우물에 중화 용액 1 mL을 추가하고, 3 분 동안 200 x g에서 15 mL 원심 분리튜브 및 원심 분리기로 세포 혼합물을 수집합니다.</li>
	<li>웰 당 2 백만 셀의 밀도에서 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 세포를 다시 심는다.</li>
	<li>24-48 시간 후, 배양 배지를 3-5 일 동안 정제 배지로 대체하십시오. 참고: 각 현미경 시야에서 세포의 90% 이상이 박동할 때 정화가 완료됩니다. 심근 세포의 추가 손상을 방지하기 위해 5 일 이상 정화 기간을 연장하지 마십시오. 첫 번째 라운드가 필요한 순도를 산출하지 않으면 정제 배지를 1 일 동안 RB + 매체로 교체한 다음 두 번째 정화를 완료하십시오.</li>
	<li>이식 에 앞서, 10 μM Y-27632로 보충된 RB+ 배지에서 12시간 동안 치료군에서 세포를 배양하였다. 유사하게, 12 시간 동안 1 μM 베라파밀 (hiPSC-CMs +VER)로 RB+배지의 세포에 베라파밀 치료를 수행합니다.</li>
	<li>처리 후, HIPSC-CMs 1x를 PBS로 세척하고 최대 2 분 동안 잘 당 0.5 mL의 세포 해리 효소로 세포를 배양하십시오. 중화 용액으로 세포를 중화시키고, 15 mL 원심 분리관에서 세포 혼합물을 수집하고, 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를. 주입을 준비하는 동안 0.1 백만 세포 / 5 μL의 농도로 PBS에서 세포를 다시 중단하십시오.</li>
</ol>4. 심근 경색 및 세포 이식
참고: 모든 수술 기구는 오토클레이브로 사전 살균되며 뜨거운 비드 멸균기를 통해 여러 수술 중에 무균 상태로 유지됩니다 (재료표2).
<ol><li>흡입 된 이소플루란 (1.5 %-2 %)으로 NOD / scid 마우스 (재료표2)를 마취시킵니다. 발가락 핀치에 마우스의 반응에 의해 마 취 수준을 모니터링 합니다. 수술 중 건조하지 않도록 수의사에게 광학 연고를 눈에 놓습니다.</li>
	<li>공급 0.1 mg/kg buprenorphine 피하 수술 전에 통증 관리를 위한.</li>
	<li>가열된 수술대에 마우스를 고정시키고, 제모 크림을 사용하여 복부 목 부위와 왼쪽 흉부에서 모발을 제거하고, 피부를 노출시키고, 70% 알코올로 소독한다.</li>
	<li>외과 용 가위를 사용하여 목 중앙에 0.5cm 절개를 자르고 피하 지방을 멸균 집게로 분리하고 기관을 노출시다. 기관에 구두로 삽관 캐뉼라를 도입하고, 캐뉼라를 작은 동물 인공호흡기에 연결하고, 환기 설정을 조정합니다(조수량을 100-150 μL로 설정하고 호흡 속도를 분당 100x-150x로 설정).</li>
	<li>마우스가 안정된 후 왼쪽 가슴 피부 의 중간에 0.5 cm 절개를 잘라. 집게를 사용하여 근육 층을 무뚝뚝하게 분리하고 다섯 번째 늑간 공간에서 작은 절개를 하여 흉강을 노출시십시오. 절개에 리트랙터를 배치하여 흉강을 열고 왼쪽 내림차순 관상 동맥 (LAD)을 찾습니다. 해부 수술 현미경으로, 8-0으로 LAD를 리게이트 흡수할 수 없는 봉합사.</li>
	<li>MI 유도 직후, hiPSC-CM-RI,hiPSC-CM+RI,hiPSC-CM-VER,hiPSC-CMs+VER또는 각 부위에 마우스의 심근에 동일한 양의 PBS를 주입합니다(3 x 105 세포/동물, 1 x 105 세포 / 사이트), 경색 지역에 하나 와 경색 주변 지역에 두. 참고: 5 μL은 매우 작은 부피이기 때문에 주사기로 직접 빨아서 부피를 정확하게 제어하는 것은 쉽지 않습니다. 멸균 페트리 접시의 뚜껑을 뒤집을 수 있으며, 세포의 5 μL은 먼저 피펫으로 뚜껑에 증착 될 수있다. 표면 장력으로 인해 확산되지 않지만 작은 액체 덩어리로 응축됩니다. 이것은 마우스의 심근에 쉽게 흡수되고 주입될 수 있습니다.</li>
	<li>따뜻한 소독식 식염수로 채우어 흉부 구멍의 잔류 공기를 제거합니다. 6-0 흡수성 봉합사로 갈비뼈, 근육 및 피부를 순차적으로 바느질하십시오. 이소플루란 마취 주사를 끕니다. 가열 패드에 수술 동물을 유지하고 밀접하게 그들이 전체 의식을 회복하는 동안 그들을 관찰. 그런 다음 동물을 깨끗한 케이지에 놓습니다. 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 동물을 돌려보내지 마십시오.</li>
	<li>수술 후, 부프레노르핀(0.1 mg/kg)으로 생쥐를 12일 동안 12회 씩 연속적으로 주입하고 12시간마다 이부프로펜(5 mg/kg)으로 주사하십시오. 지정된 시점에서 후속 해석 스터디를 수행합니다. 참고: 지역 동물 관리 위원회 지침을 따라 진통제를 확인하십시오.</li>
</ol>5. 칼슘 과도 및 수축력 기록
<ol><li>오토클레이브 15 mm 직경 커버립 (재료의 표2) 및 핀셋은 121 ° C에서 작은 유리 비커에, 15 분 동안 15 psi. 4 °C에서 커버 립과 핀셋을 미리 냉각.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣고 각 커버슬립에 세포외 매트릭스의 파이펫 300μL을 놓습니다. 참고: 매트릭스가 매트릭스 코팅 량을 줄이는 것을 방지하기 위해 커버 슬립의 가장자리를 초과하지 마십시오. 12웰 플레이트를 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였다.</li>
	<li>정제 된 hiPSC-CS로 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 PBS로 1 x 씻어 낸 다음 0.5 mL의 세포 해리 효소로 1.5 분 동안 소화합니다. 중화 액 1 mL을 추가하고 1 mL 파이프로 5x -10x 를 반복적으로 피펫을 추가하십시오. , 혼합물을 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리한다.</li>
	<li>커버립에서 코팅 된 세포 외 매트릭스를 흡인합니다. 세포 수를 계산하고 중화 용액에서 세포를 40,000/300 μL의 농도로 다시 일시 중단한 다음 각 커버슬립에 300 μL의 셀 현탁액을 추가합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 배양하였다.</li>
	<li>24 시간 후, 부드럽게 중화 된 용액을 흡인하고, 플레이트의 각 우물에 500 μL의 RB + 배지를 추가하고 2 일 동안 배양을 계속합니다.</li>
	<li>Y-27632 (10 μM), 로키나아제 활성제 (RA, 100 nM), 베라파밀 (1 μM) 또는 HIPSC-CM의 배양 배지에 동일한 부피의 PBS를 첨가하고, 칼슘 과도 및 수축성 검출 전에 12 시간. 참고: 화학적 처리 의 12 시간 후에 세포의 칼슘 과도 및 수축성의 검출 이외에, 이들 파라미터의 검출은 또한 화학적 금단 후 12, 24, 48 및 72 시간에서 시험되었다.</li>
	<li>접시를 꺼내 매체를 버리고 PBS로 플레이트를 1x 씻습니다. 계면활성제 폴리올(재료표1), 5 μM 칼슘 표시기(재료표1), 해당 Y-27632(10M), RA(100 nM), 베라파밀(1 μM) 또는 동일한 부피를 함유하는 페놀-적색 이물질이 없는 DMEM으로 배지를 변경 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>상판액을 버리고, 세포를 염료가 없는 DMEM 배지로 3x 세척하고, 배지를 30분 간 쉬게 하여 매핑 염료를 제거한다.</li>
	<li>세포 씨드 커버슬립을 개탕 챔버에 넣고 자동 온도 조절기(재료표2)로 37°C에 평형으로 조정된 마이크로 인큐베이션 시스템에 챔버를 삽입하고 Tyrode의 용액과 함께 주입하고 지속적으로 추가합니다. 로키나아제 억제제(RI), RA, 또는 PBS를 관류 용액으로.</li>
	<li>거꾸로 된 형광 현미경 (재료표2)과 레이저 스캐닝 헤드 (재료표2)를 사용하여 x-t 라인 스캔을 사용하여 자발적인 칼슘과 과도성을 기록하고, 염료 여기및 515 ± 10 nm에 대한 488 nm 아르곤 레이저를 사용하여 배리어 필터를 사용하여 방출 광을 수집합니다. 공초점 현미경의 차동 간섭 대비 기능을 사용하여 hiPSC-CM의 자발적인 수축을 기록합니다(재료표2). 참고: 칼슘 과도 기록은 MATLAB R2016A 소프트웨어(재료표 4)를사용하여 처리 및 분석하였다. 세포 수축 변화 분석제는 ImageJ 소프트웨어를사용하여 수행하였다(자료표 4).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 연구의 주요 단계는 순수한 hiPSC-CM을 획득하고, Y-27632 전처리를 통해 hiPSC-CM의 활성을 개선하고, 마지막으로 정확한 양의 hiPSC-CM을 마우스 MI 모델로 이식하는 것을 포함합니다.
여기서 해결된 주요 이슈는 우선 포도당 없는 정제 방법19를 최적화하고 새로운 효율적인 정화 시스템을 구축했다는 것입니다. 시스템 절차에는 세포 해리 효소를 적용하고, 젤라틴 코팅 플레이트에 세포를 이식하고, 반응 후 24 시간 동안 중화 배지에서 세포를 배양하고, 이식 전에 세포의 소화 시간을 최소화하는 것이 포함되었습니다. 그 중 순수한 심근 세포를 얻는 동안 세포의 가장 높은 활성을 달성하기 위해 수행되었다.
둘째, 우리는 세포 주입 전에 12 시간에서 Y-27632를 가진 hiPSC-CM의 전처리에 정교하게 했습니다. anoikis는 일반적으로 세포 '접착 단백질의 변형에 ...

줄기 세포 기지를 둔 치료는 MI 1에 기인한 심장손상을 위한 처리로 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 차별화된 hiPSCs의 사용은 hiPSC-CMs2의 무한한 공급원을 제공하고 획기적인 치료법의 신속한 발전을 위한 문을 엽니다. 그러나, 이식된 세포의 심각하게 낮은 생착 율의 도전을 포함하여 치료 번역에 많은 한계가 남아 있습니다.
트립신과 세포를 해리하는 것은 anoikis를시작합니다 3, 이는 이 세포가 허혈성 심근과 같은 가혹한 환경에 주입되면 가속되는, 저산소 환경은 세포 죽음을 향한 과정을 가속화. 나머지 세포의, 큰 비율은 혈 류로 이식 사이트에서 밖으로 세척 하 고 주변에 걸쳐 확산. 주요 apoptotic 경로 중 하나는 RhoA/ROCK통로 4. 이전 연구에 기초하여, RhoA/ROCK통로는 세포 기능 장애7,8을담당하는 액틴 세포골격 조직5,6을조절한다. 이 록 억제제 Y-27632는 체세포 및 줄기세포 해리 및 패시징 시 널리 사용되며, 세포 부착을 증가시키고 세포 세포 사멸을 감소시키는데9,10,11. 본 연구에서, Y-27632는 세포 생착 속도를 증가시키기 위한 시도로 이식 전에 hiPSC-CM을 치료하는 데 사용된다.
열 충격 및 지하 막 매트릭스 코팅(12)과 같은세포 생착 속도를 개선하기 위한 여러 가지 방법이 수립되었다. 이러한 방법 외에도, 유전 기술은 또한 심근세포 증식(13)을 촉진하거나 비근신세포(14)로 역전시킬 수 있다. 생명공학적 관점에서, 심근세포는 이식효율을향상시키기 위해 생체 재료 스캐폴드상에 시드된다(15). 불행히도, 이러한 방법의 대부분은 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 반대로, 여기에 제안 된 방법은 간단하고 비용 효율적이며 효과적이며 이식 전 기저 치료뿐만 아니라 다른 기술과의 활용에도 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase (줄기세포 분리 용액)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07920</td><td></td></tr><tr><td>B27 마이너스 인슐린</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(1x), 고포도당, HEPES, 페놀 레드</td><td>없음 Thermofisher</td><td>20163029</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM (칼슘 지시약)</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>무포도당 RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>줄기세포 기술</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (extracellular matrix)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR (human pluripotent stem cells medium)</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep antibiotic</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (surfactant polyol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Rho activator II Cytoskeleton (Rho activator II</td><td>Cytoskeleton</td><td>)CN03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Sodium DL-lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (cell-dissociation enzymes)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-010</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>장비 및 용품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III 생물 발광 기기</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>15mm Coverslips</td><td>Warner</td><td>CS-15R15</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Thermo Scientific</td><td>NX50</td><td></td></tr><tr><td>이중 자동 온도 컨트롤러</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 전원 공급 장치</td><td>BIO-RAD</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>pco</td><td>1200 s</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캔 헤드</td><td>Olympus</td><td>FV-1000</td><td></td></tr><tr><td>로우 프로파일 개방형 목욕 챔버(위의 미세 배양 시스템에 장착)</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-42LP</td><td></td></tr><tr><td>미세 배양 시스템</td><td>Warner Instruments</td><td>DH-40iL</td><td></td></tr><tr><td>Minivent 마우스 인공호흡기</td><td>Harvard 장치</td><td>845</td><td></td></tr><tr><td>NOD/SCID 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>프리캐스트 단백질 겔</td><td>BIO-RAD</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 트랜스퍼 팩</td><td>BIO-RAD</td><td>1704156</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot 시스템</td><td>BIO-RAD</td><td>Trans-Blot Turbo</td><td></td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td> 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>ab198580</td><td></td></tr><tr><td>심장 트로포닌 T</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB1874</td><td></td></tr><tr><td>심장 트로포닌 C</td><td>Abcam</td><td>ab137130</td><td></td></tr><tr><td>심장 트로포닌 I</td><td>Abcam</td><td>ab47003</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-당나귀 안티 마우스</td><td>잭슨 면역 연구소</td><td>715-175-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-당나귀 안티 토끼</td><td>잭슨 면역 연구소</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Fitc-당나귀 안티 마우스</td><td>잭슨 면역 연구 실험실</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab22555</td><td></td></tr><tr><td>인간 심장 트로포닌 T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Integrin &beta; 1</td><td>Abcam</td><td>ab24693</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>EMD Millipore</td><td>ab9260</td><td></td></tr><tr><td>N-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab18203</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Myosin Light Chain 2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3671s</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2016A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.52g</td><td></td></tr></tbody></table>

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

심근 재생을 위한 세포 치료 효과 향상에 있는 결정적인 요인은 세포 생착 비율을 안전하고 효율적으로 증가하는 것입니다. Y-27632는 로-관련, 코일 코일 함유 단백질 키나아제(RhoA/ROCK)의 매우 강력한 억제제이며 해리-유도 세포 세포 세포 사멸(anoikis)을 예방하는 데 사용됩니다. 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs+RI)에대한 Y-27632 전처리가 급성 심근경색(MI)의 마우스 모델에서 세포 생착율 향상을 초래한다는 것을 입증한다. 여기서, 우리는 Y-27632를 가진 hiPSC-CM 분화, 정화 및 세포 전처리의 완전한 절차, 뿐만 아니라 생성된 세포 수축, 칼슘 과도 측정 및 마우스 MI 모델로의 이식에 대해 설명합니다. 제안된 방법은 세포 생착 속도를 현저하게 증가시키는 간단하고 안전하며 효과적이며 저렴한 방법을 제공한다. 이 방법은 세포 이식 효율을 더욱 향상시키기 위해 다른 방법과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 심장 질환의 메커니즘에 대한 연구에 유리한 기반을 제공합니다.

본 연구에 사용된 hiPSC-CM은 루시퍼라제 리포터 유전자를 가진 인간 기원으로부터 유래되었다; 따라서 생체 내 이식 된 세포의 생존율은 생물 발광 이미징 (BLI)17 (도 1A,B)에 의해 검출되었다. 조직학적 심장 절편을 위해, 인간 특이적 심장 트로포닌 T(hcTnT) 및 인간 핵 항원(HNA) 이중 양성세포는 이식된 hiPSC-CM으로 분류하였다(그림 1C). 두 결과 모두 Y-27632 전처리가 세포 생착 속도를 현저하게 향상시켰습니다. hiPSC-CM+RI 군의 루시퍼라아제 활성은 이식 후 3일, 7일 및 28일에 대략 6배 증가하였으며, hiPSC-CM-RI 군의 그것과 비교하였다(도 1B).</st...

이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

우리의 데이터는 Rho-kinase 활동의 일시적인 억제가 극단적 인 동물 심장으로 이식 된 후 hiPSC 유래 심근 세포의 접착, 생존 및 이식을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 우리는 간단한, 저렴한 비용, 부상당한 동물 심혼에 이식 된 hiPSC 유래 심근 세포의 이식을 증가 하는 매우 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 기술은 급성 심장 경색및 심부전에서 세포 이식 속도를 안전하고 효율적으로 향상시킬 수 있으므로 심장 기능, 혈관 및 세포 마비의 결과로 개선됩니다.우리는 hiPSCs에서 우리의 프로토콜을 시험하더라도, 이 방법은 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 등 세테라와 같은 세포의 그밖 모형에 적용될 수 있습니다. Y-27632 치료의 용량 과 기간은 매우 중요합니다. 시각적 데모는 프로토콜의 모든 주요 단계를 자세히 설명할 수 있으며, 이는 이전에 이 기술을 수행한 적이 없는 사람에게 유용합니다.hiPSC-CM 분화 후 21일째에, 배지를 흡인하고 멸균 PBS로 세포를 한 번 세척한다. 세포에 세포를 배양하 0.5 밀리리터의 세포 해리 효소는 섭씨 37도에서 5~7분 동안 잘 섭취합니다. 인큐베이션 시간 후, 세포를 철저히 해리시키기 위해 1밀리리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 반복적으로 피펫한다.그런 다음 각 웰에 1 밀리리터의 중화 용액을 추가하고, 15밀리리터 원심분리기 튜브에 세포 혼합물을 수집하고, 원심분리기는 3분 동안 200배 g에서 수집합니다. 원심 분리 후, 상신체를 폐기하고 중화 용액에서 세포를 다시 중단합니다. 그런 다음, 젤라틴 코팅, 6웰 플레이트에 세포를 잘 당 2백만 개의 세포밀도로 심는다.24~48시간 후, 배양배지를 3~5일 동안 정화배지로 교체한다. 이식 전에, 10 마이크로몰러 Y-27632로 보충된 RB 플러스 배지에서 12시간 동안 치료군에서 세포를 배양한다. 유사하게, 12 시간 동안 verapamil의 1 개의 마이크로몰로 RB 플러스 배지의 세포에 verapamil 처리를 수행합니다.치료 후, PBS로 hiPSC-CM을 한 번 세척하고 세포 해리 효소의 0.5 마이크로리터로 세포를 최대 2분 동안 배양한다. 세포를 철저히 해리하기 위해 1밀리리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 반복적으로 피펫합니다. 다음으로, 중화 용액으로 세포를 중화시키고, 15밀리리터 원심분리기 튜브에서 세포 혼합물을 수집하고, 원심분리기는 3분 동안 200배 g에서 수집한다.원심분리 후, 주입을 준비하기 위해 5개의 마이크로리터 당 0.1백만 개의 세포의 농도로 PBS의 세포를 다시 중단한다. 심근 경색 유도 직후, 제어 hiPSC-CM, Y-27632-pretreated hiPSC-CM, verapamil 처리 hiPSC-CM, 또는 각 부위의 마우스 심근에 PBS의 동등한 부피, 각 부위에 있는 마우스의 심근막에 PBS의 동등한 부피, 원거리 지역에 1개, 그리고 그 주변 지역에 있는 2개의 마이크로리터를 주입한다. 칼슘 일시및 수축 검출을 수행하기 12시간 전에, 10마이크로몰러 Y-27632, 100나노몰라 RA, 1마이크로몰러 베라파밀 또는 동일한 양의 PBS를 hiPSC-CM의 배양 배지에 추가한다.다음으로, 매체를 버리고, 한 번 PBS로 접시를 씻는다. 계면 활성제 폴리올의 부피 퍼센트당 0.02 중량을 함유한 페놀 무적DMEM, 5마이크로몰라 칼슘 표시기 및 해당 Y-27632, RA, verapamil 또는 PBS의 동일한 부피를 포함하는 페놀 무적DMEM으로 배지를 변경하고 30분 동안 37°C에서 플레이트를 배양한다. 인큐베이션 후, 상체를 버리고, 염료가 없는 DMEM으로 세포를 세 번 세척하고, 중간 체질을 30분 동안 쉬게 하여 매핑 염료를 제거한다.세포 씨 덮개 슬립을 열린 목욕 챔버에 놓고 자동 온도 컨트롤러로 섭씨 37도에 달하는 미세 배양 시스템에 챔버를 삽입합니다. Tyrode의 솔루션으로 퍼퓨즈하고 관류 용액에 RI, RA 또는 PBS를 지속적으로 추가합니다. 반전형 형광 현미경과 레이저 스캐닝 헤드를 사용하여 X-t 라인 스캔을 사용하여 자발적인 칼슘 과도를 기록합니다.공초점 현미경의 차동 간섭 대비 기능을 사용하여 hiPSC-CM의 자발적인 수축을 기록합니다. 이식된 세포의 생존율은 증가된 루시파아제 활성에 의해 확인되었다. 증가 된 인간의 심장 트로포닌 T와 인간의 핵 항 원 발현 Y-27632 전처리 세포 이식 속도를 크게 향상 시킬 수 있음을 보여주었다.Y-27632 전처리 된 세포는 더 크고 더 정의 된 막대 모양의 사이토켈레탈 구조를 나타냈다. 또한, Y-27632 전처리는 TUNEL 양성 세포를 감소시켰으며, 이는 생체내에서 이식된 hiPSC-CM 세포멸을 나타낸다. 웨스턴 블롯은 Y-27632 전처리가 인테그린 베타-1 및 N-cadherin의 발현을 증가시키고 인산 미오신 광사슬 2의 발현을 감소시켰다.이 변경은 Y-27632 철수 후 72 시간 정상화되었다. 시험관 내 마우스 HL-1 세포 부착 실험은 Y-27632 전처리가 HL-1에 비해 hiPSC-CM 준수를 현저히 증가시켰다는 것을 나타냈다. Y-27632 전처리는 수축력, 피크 칼슘 과도 형광 및 칼슘 과도 지속 시간을 감소시었습니다.Y-27632 전처리는 cTnI 및 cTnT의 발현을 현저히 감소시킴으로써 심근세포 수축을 조절했다. Y-27632와 마찬가지로, 베라파밀 전처리는 루시파라제 활성및 hcTnT/HNA 이중 양성 세포의 수를 증가시켰습니다. 가장 중요한 단계는 10 마이크로몰라 Y-27632로 보충된 Rb 플러스 배지에서 12시간 동안 치료 군내 세포를 배양하는 것이다.이 방법에 기초하여, 세포 이식 속도를 더욱 높이기 위해 Y-27632의 느린 방출은 유망한 전략이다. 이 기술은 연구원이 생체 내 CM의 hiPSC의 생리학 그리고 기능을 연구하는 쪽을 포장합니다. 심근세포 분화에 사용되는 작은 분자 CHIR99021은 호흡기 자극을 일으킬 수 있는 위험합니다.어떤 식으로든 흡입하거나 흡입하지 마십시오.

enhancing-engraftment-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

여기에서는 소분자 조절 심장 분화와 포도당 결핍 매개 심근세포 정제를 결합하여 심혈관 질환 모델링 및 약물 스크리닝을 위해 정제된 심근세포를 생산할 수 있는 인간 심근세포 유도를 위한 강력한 프로토콜을 설명합니다.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

학습하세요 Rho-kinase 억제제를 이용한 hiPSC 유래 심근 세포의 생착 강화 방법을. 마우스 심근 경색 모델에서 세포 이식 효율을 높이는 저비용 효율적인 기술입니다.

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

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