VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

장내 바이러스는 주로 지하수, 여전히 물, 하천, 강 및 r 물을 포함한 다른 수생 저수지에서 발견됩니다. 그(것)들은 건강 위험과 연관되고 인간에 있는 감염에 책임 있습니다. 장 내 바이러스는 일반적으로 위장염을 일으키는 원인이 되고 주로 배설물 경구 경로를 통해 전달됩니다.

그밖 수인성 질병은 특히 임산부에 있는 E형 간염에 관하여 중요한 관련된 사망과 가진 A형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스에 의하여 심각한 간염을 일으키는 원인이 됩니다. 인도주의적 맥락에 제안된 수질을 모니터링하기 위한 실제 프로토콜은 대장균과 같은 박테리아를 배설물 오염의 지표로 유지하도록 설계되었습니다. 그러나 많은 활성화 과정에 더 강한 바이러스와 같은 그밖 미생물과 아무 상관관계가 없다는 것을 이미 알려져 있습니다.

지금까지 인도주의적 위기 환경에서 바이러스의 검출은 기존의 프로토콜을 이러한 맥락의 조건에 적응하고, 바이러스의 분자 검출을 위한 참조 실험실에 샘플을 배송함으로써 수행되었습니다. 공중 보건 위험을 줄이고 발병을 예방하며 인도주의적 개입의 효율성을 높이기 위해 관점에 바이러스 성 병원균및 바이러스 성 지표를 감지하는 방법이 필요합니다. 바이러스 농도, 핵산 추출 및 바이러스 검출의 세 단계로 나뉘는 10리터 수질 샘플에서 바이러스 검출 방법을 제안합니다.

이러한 모든 단계는 현재 당사 실험실에서 사용 중인 방법에서 적용되었으며 휴대용 시약 및 장비를 사용하여 전원 공급 장치 및 냉동고의 부양 을 생성하여 시야에서 수행 할 수 있습니다. 또한, 방부제 용액이 필요한 경우 참조 실험실에 대한 선적에 대한 핵산의 안정성을 보증하는 방법에 추가되었다. 우리가 제안하는 방법은 VirWaTest라고하며 GenIUL과 인터논 옥스팜의 협력으로 개발되었습니다.

시작하기 전에 시약 및 재료의 준비를 위해 테스트할 샘플 수를 고려해야 합니다. 대표적인 결과를 얻기 위해 각 물 샘플의 두 복제를 수집하는 것이 좋습니다. 적절한 양의 재료를 사용할 수 있는 경우 여러 샘플을 동시에 테스트할 수 있습니다.

시약 및 재료는 이동하거나 방법이 필요한 곳으로 배송되기 전에 준비 및 포장해야합니다. 포장해야 하는 재료 및 소형 장비 목록은 표 에 설명되어 있습니다. 해당 ISO 방법을 따라 공정 제어로서 각 물 샘플에 첨가되는 박테리오파지 MS2 스톡을 준비한다.

그런 다음 10mL 튜브에 미리 제작된 10~10개의 플랫폼 유닛을 포함하는 서스펜션 10마이크로리터를 분배하고 물을 건조하게 한다. 물 샘플 당 하나의 튜브가 필요합니다. 또한 수집된 샘플당 멸균 증류수 10mL를 포함하는 튜브 1개를 준비합니다.

미리 탈약된 탈지 우유 용액의 경우 탈지 우유가 들어 있는 튜브, 바다 소금을 함유한 지퍼 비닐 봉지, 증류수를 함유한 플라스틱 병을 준비합니다. pH 조정을 위해 구연산을 함유한 튜브, 수산화나트륨을 함유하는 튜브, 증류수 25및 50mL의 플라스틱 용기 2개를 준비한다. 시험할 각 물 샘플에 대해, 지퍼 비닐 봉지에 바다 염과 구연산을 추가하여 컨디셔닝 봉지를 준비하고, 용해 완충제 및 핵산 방부제를 5mL 튜브에 첨가하여 보존용액을 제조한다.

마지막으로 4개의 중화 봉지를 준비하여 4개의 지퍼 비닐 봉지에 파워 세제를 추가합니다. 추출할 각 수질 샘플에 대해, 자기 입자와 에탄올을 함유한 5mL 튜브 1개, 500, 600 및 200마이크로리터를 포함하는 3개의 2mL 튜브를 각각 1, 2, 3, 및 용출 완충제를 함유하는 1개의 튜브를 제조한다. 뉴웰 열순환기가 사용되는 경우 두 개의 상이한 핵산 추출은 각 PCR 분석에서 동시에 분석될 수 있다.

모든 PCR 에세이의 경우 분자 생물학 수를 준비하십시오. 프로토콜에 기재된 부피 및 농도에 따라 각 표적 바이러스에 대해 2개의 프라이머와 1개의 증거 특이적 증거를 포함하는 혼합을 준비한다. 각 바이러스에 대해 표시된 볼륨을 튜브 트레이의 1~8개 튜브에 추가합니다.

스트립을 잘라 두 개의 스트립으로 나눕습니다. 튜브 는 1 ~ 5, 튜브 6 ~ 8. 각 바이러스에 대해, 공기 건조 DNA 현탁액은 10 에서 5, 10 에서 7, 및 10 에서 9를 포함하고 알려진 사본은 6, 7 및 8 튜브로 미리 만들어진.

이러한 농도 프로토콜은 낮은 pH 및 고전도 조건이 탈지 우유 단백질을 구동하여 바이러스가 흡수하는 플록으로 구성되는 유기 플러충의 원리를 기반으로 합니다. 플록이 정착되면 쉽게 수집 할 수 있습니다. 뚜껑이 있는 평평한 바닥 양동이에 10리터 의 물 샘플을 채집합니다.

파이프에서 수집하는 경우 물을 수집하기 전에 물을 몇 초 동안 실행하십시오. 투명 버킷을 사용하여 펠릿을 시각화하는 것이 중요합니다. 직사광선과는 거리가 먼 신선한 장소에서 평평한 공간을 찾아 버킷 지지체 아래에 배터리에 연결된 자기 교반기를 넣고 각 지지대에 물 샘플을 포함하는 양동이를 놓습니다.

구연산과 수산화 나트륨을 재고하고 완전히 용해 될 때까지 흔들어 주세요. 증류수 500mLs를 스탠드업 백에 붓고 가방을 자기 교반기 위에 놓습니다. 바다 소금 봉지 1개내용과 탈지 우유튜브 1개 내용물 추가, 중간 속도로 5분간 저어줍니다.

구연산과 수산화나트륨을 사용하여 플립탈지 우유의 pH를 3.4와 3.6 사이의 pH로 조정한다. 자기 교반기끄기와 플록이 보이는지 확인합니다. 손전등은 플록을 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

교반 자석을 물에 떨어뜨립니다. 마그네틱 교반기는 최대 속도로 설정하고 켭니다. 공정 제어 튜브에 증류수 10mL를 추가합니다.

그것을 몇 번 반전하고 물에 용액을 부어. 한 샘플 컨디셔닝 봉지의 내용물을 물에 붓고 5 분간 저어줍니다. 3.4에서 3.6 사이여야 하는 물 샘플의 pH가 있는지 확인하십시오.

필요한 경우 pH를 조정합니다. 100mLs의 미리 flocculated 탈지 밀크 용액을 추가하고 뚜껑으로 양동이를 밀봉하고 최소 속도로 8 시간 동안 물을 저어 둡니다. 8시간 후, 자기 교반기를 끄고 플록이 최소 5시간 이상 정착할 수 있도록 합니다.

파이펫 컨트롤러, 플라스틱 튜브 및 파이프 몇 개 의 사용에 따라 시스템을 사용하여, 양동이 바닥에 flocs를 방해하지 않도록주의, 슈퍼 나탄을 폐기. 수위가 교반 자석에 도달하려고 할 때, 물 흐름을 중지플라스틱 튜브를 짜내고 양동이에서 파이펫을 멀리 이동합니다. 양동이를 흔들어 플록을 다시 부수고 스탠드업 비닐 봉지에 붓습니다.

플로크가 1시간 더 정착하도록 허용합니다. 플로크를 방해하는 파이펫을 사용하여 물 슈퍼네탄을 조심스럽게 흡인시합니다. 파이펫을 사용하여 플로크를 흡입하고 원물 튜브로 옮기십시오.

샘플 농축액의 최종 부피를 기록하고 방부제를 포함하는 튜브로 1mL을 이송한다. 현탁액은 현장에서 핵산 추출을 수행하거나 추가 분석을 위해 기준 실험실로 발송하는 데 사용될 수 있다. 플로크를 수거하는 동안 버려진 물은 폐기 전에 처리해야합니다.

중화 제봉지의 내용을 버려진 물이 들어 있는 양동이에 추가합니다. 물을 섞고 30 분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 처리된 물을 일반 폐기물로 처리합니다.

자기 입자는 자기 파이펫을 사용하여 한 튜브에서 다른 튜브로 전송될 수 있습니다. 추출을 수행하기 전에 자기 파이펫의 작동에 익숙해. 랙에서 추출하는 데 필요한 시약을 포함하는 튜브를 정렬합니다.

즉, 왼쪽에서 오른쪽으로 바인딩 버퍼, 세척 버퍼 및 용출 버퍼입니다. 일회용 플라스틱 파이펫을 사용하여 결합 버퍼를 포함하는 튜브에 1mL의 샘플 농축액을 전달한다. 튜브를 10번 반전하여 솔루션을 최적화합니다.

솔로 궤도또는 수동으로 혼합하면서 10분 동안 실온에서 용액을 배양합니다. 자기 파이펫과 세 가지 세척 버퍼에 대해 재사용할 수 있는 깨끗한 팁을 사용하여 자기 입자를 수집하고 자성 입자를 세척 버퍼 1개를 포함하는 튜브로 방출한다. 30초 동안 팁으로 용액을 부드럽게 흔들어 서늘하게 씻고 수집합니다.

버퍼 2개와 3개를 세척하기 위한 이 세척 절차를 반복하십시오. 3개의 세척 버퍼에서 자기 입자를 수집하고 용출 버퍼를 포함하는 튜브로 방출합니다. 그런 다음 팁을 버립니다.

솔로 궤도를 사용하여 지속적으로 혼합하면서 실온에서 5 분 동안 용액을 배양합니다. 자기 파이펫의 끝을 하나 하나하나으로 교체하고 용출 버퍼에서 모든 자기 입자를 수집합니다. 파티클이 부착된 팁을 폐기합니다.

핵산은 용출 완충제에 남아 있으며, 이는 추가 분석 또는 선적을 위해 보관되어야 합니다. 인간 아데노바이러스를 검출할 수 있는 5관과 3관 스트립을 사용하십시오. 프로토콜에 따라 1~5개의 튜브에 물, PCR 혼합 및 핵산 외산을 추가합니다.

그 후 6~8번 튜브에 물과 PCR 믹스를 추가합니다. 온도 순환기에 두 스트립을 넣고 적절한 실행을 선택합니다. 실행이 완료되면 결과를 수집하고 얻은 데이터를 분석합니다.

바이러스 성 테스트가 음수로 초래된 경우에만 MS2 감지를 수행해야 합니다. MS2 감지를 위해 준비된 튜브 스트립을 사용하고 PCR에 적합한 열 프로파일을 선택합니다. VirWaTest 자기 핵산 추출은 QIAgen 바이러스 RNA와 비교되었으며, 인간 아데노바이러스 및 MS2로 스파이크된 물 샘플을 테스트하여 모방하였다.

감소 테스트 p-값은 테스트 된 두 바이러스에 대한 추출 방법으로 QiAgen보다 VirWaTest를 사용하여 상당히 높은 바이러스 복구를 보여줍니다. 바이러스 농도에 대한 개발 된 방법은 방기, 중앙 아프리카 공화국과 페데르날레스, 에콰도르에 위치한 옥스팜 세척 팀의 협력으로 현장에서 테스트되었으며, 물 샘플을 수집하고 개발 된 농도 방법을 적용하여 농축하여 바르셀로나의 실험실로 보내 핵산 추출 및 바이러스 정량화를 위해 시험했습니다. 에콰도르에서는, 인간 아데노바이러스는 시험된 모든 견본에서 검출되었습니다, 반면 5개의 견본 중 1개는 인간 아데노바이러스를 위해 양성 반응을 보인 Bangui에 집합되고 집중된 반면.

개발 된 방법은 방기, 중앙 아프리카 공화국의 옥스팜 인터론의 워시 팀과 에콰도르 페데르날레스의 다른 팀에 의해 평가 되었을 때 유용 한 것으로 판명되었습니다. VirWaTest는 조기 경보 시스템의 일부이거나 물 위생에 관련된 조직에 의한 발병 조사에 사용될 수 있습니다. 이 장비는 인도주의적 위기 상황에서 바이러스 성 질병의 사고를 줄이기 위한 목적으로 물에서 바이러스 성 병원균의 분석과 물 안전 관리의 개선을 용이하게합니다.