Name: 바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 학습하세요 AAV 바이러스 벡터를 이용해 뇌 내 상주 신경교 세포를 파발부민 양성 인터뉴런으로 직접 재프로그래밍하는 방법을. 이 기술은 정신질환 연구와 세포 치료 개발에 활용됩니다.

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마르첼라 비르텔레는 마리 스크와도우스카-퀴리 혁신 교육 네트워크 및 보조금 협정 제676408호하에 유럽 연합 호라이즌 2020 프로그램(H2020-MSCA-ITN-2015)의 자금을 지원받았습니다. 다니엘라 릴란더 오토슨은 스웨덴 연구위원회 (2017-01234)의 지원을 받았습니다.

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

생체 내 직접 재프로그래밍은 Cre-발현 마우스 균주에서 AAV FLEX 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. 재프로그래밍 효능에 관해서는 마우스 균주 간의 차이가 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 줄무늬에서 생체 내 재프로그래밍의 경우, NG2-Cre 마우스 라인은 다른 균주와 비교할 때 더 효율적인 것으로 입증되었습니다. 새로운 동물 균주를 사용하기 전에, 동물의 나이가 종종이 단백질 발현의 특이성에 영향을 미치기 때문에 시간이 지남에 따라 Cre 발현에 관한 마우스 제공 자 지침을 확인하는 것이 중요합니다. 우리의 연구에서, 12주 이상 된 동물은 NG2 glia 이외의 세포에서 Cre 발현에 대한 위험이 있었기 때문에 생체 내 재프로그래밍에 사용되지 않았다. 시냅신-FLEX-GFP 시제만주입된 대조군 동물의 지속적인 존재 및 모니터링이 권장된다. 이것은 더 재프로그래밍 유전자 (ALN)가 사용되지 않는 경우에 나타나서는 안 되는 GFP 양성 세포를 위한 동물의 감시를 허용합니다.
새로 프로그래밍된 뉴런을 식별하기 위해 이 프로토콜에 설명된 뉴런과 같은 뉴런 특이적 식별 방법이 가장 중요합니다. 이는 동성애자 영역에서 재프로그래밍할 때 특히 관련성이 있는 내인성 주변 세포로부터 재프로그래밍된 뉴런을 적절히 식별하고 구별할 수 있게 한다.
그것은 또한 바이러스 성 주입에 대 한 올바른 구조를 대상으로 하는 것이 중요 하다. 따라서, 바이러스 성 주입을 위한 입체 외과는 중요하고 두뇌의 더 작은 구조물을 표적으로 할 때 특히 정확하게 접근할 필요가 있습니다.
우리는 이전에동일한 재프로그래밍 인자를 사용하여 생체 외 재프로그래밍 실험을 기반으로 생체 내 재프로그래밍의 결과를 예측하는 것이 신뢰할 수 없다는 것을 11을 보여주었습니다. 따라서 관심있는 모든 요소는 생체 내에서 테스트해야합니다. 우리의 손에, 많은 다른 요인 조합은 뉴런의 동일한 아류형을 제공 (즉, 생체 내에서 interneurons11) 이러한 유전자는 다른 뉴런의 개발에 연루 된 사실에도 불구하고.
재프로그래밍된 뉴런에 대한 전세포 패치 클램프는 섬세한 기술이며 조직 처리는 좋은 결과를 위해 중요하다. 얼음 차가운 Krebs 용액을 가진 관류는 조직 질을 향상시킵니다. 또한 패치 된 뉴런은 신중하게 치료해야합니다. 재프로그래밍된 뉴런의 성숙 및 표현형 정체성이 전체 세포 패치 클램프를 사용하여 다소 평가될 수 있더라도, 이들 세포는 그들의 내인성 대조물과 완전히 비교할 수 없다. 게놈 시퀀싱(예를 들어, RNA 시퀀싱)과 같은 추가유형의 분석은 다시 프로그래밍된 세포 정체성을 추가로 확인하기 위해 사용되어야 한다.
본 명세서에 기재된 기술은 뇌에서 신경 대체가 필요한 미래 치료법의 개발을 위해 고려될 수 있다. 생체 내 재프로그래밍은 아직 초기 단계에 있으며 인간으로의 번역은 아직 예측되지 않았지만,이 기술은 뇌의 외인성 유전자 기능을 평가하고 생체 내에서 세포 성숙을 연구하는 방법을 제공 할 수 있습니다.

이 방법의 전반적인 목표는 효율적으로 parvalbumin 발현 인터뉴런과 같은 기능및 아류형 특정 뉴런으로 생체 내 뇌 상주 glia를 변환하는 것입니다. 이것은 외인성 세포 공급원에 대한 필요 없이 뇌 질환에 대한 대체 세포 대체 요법의 개발을 향한 한 걸음을 제공합니다. 또한 세포 운명 스위치를 연구하는 도구를 만듭니다.
뇌는 새로운 뉴런을 생성하기위한 제한된 용량을 가지고. 따라서, 신경 질환에서, 뇌 수리를 위한 외인성 세포 소스의 필요성이 있다. 이를 위해, 세포의 상이한 공급원은 1차 조직, 줄기세포 유래 세포 및 재프로그래밍된 세포로부터의 세포를 포함하여 수년에 걸쳐 강렬한 연구를 거쳤으며 1,2,3. 뉴런으로 상주 하는 뇌 세포의 직접 리프로그래밍은 뇌 내부의 새로운 뉴런을 생성 하기 위한 환자의 자신의 세포를 사용 하 여 뇌 수리에 대 한 매력적인 방법을 제공할 수 있는 최근 접근. 현재까지, 몇몇 보고는 두뇌에 있는 바이러스성 벡터 납품을통해 생체 내 재프로그래밍에서 보여주었습니다 4, 5,6,78,9 와 같은 다른 두뇌 지구에서 피질, 척수, 줄무늬 및 중뇌 5,10,11뿐만아니라 손상되지 않은 병변 뇌 5,8,11,12. 억제 및 흥분성 뉴런 모두4,8,그러나 이들 세포의 정확한 표현형 또는 기능은 아직 상세히 분석되지 않았다.
이 프로토콜에서, 우리는 생체 내 재프로그래밍 된 뉴런의 보다 효율적인 재프로그래밍 및 세포 별 식별을 설명합니다. 우리는 기능성 및 면역 조직 화학적 특성에 기초한 신경 성숙 및 표현형 특성의 기능 평가를 위한 프로토콜을 제공합니다.
우리는 생체 내 재프로그래밍 된 뉴런을 확인하기 위해 Cre-유도성 AAV 벡터와 GFP 리포터를 사용했습니다. 이러한 바이러스 벡터의 선택은 레트로바이러스7,8의사용에 대한 대안으로서 뇌의 분할 및 비분할 세포 모두를 감염시키고, 표적 세포의 수를 증가시키는 장점이 있다. 뉴런 특이적 시냅신 구동 FLEX 리포터(GFP)를 통해 새로 생성된 뉴런을 구체적으로 검출할 수 있었습니다. 이전 연구는 생체 내 재프로그래밍7,9에 대한 아류형 특이적 프로모터를 사용했으며, 이는 또한 특정 세포 유형에서 유전자 및 리포터의 재프로그래밍을 허용한다. 그러나, 그 방법은 리포터 및 뉴런 마커의 공동 발현의 사후 분석에 의해 재프로그래밍된 뉴런의 추가 식별을 요구한다. 본 명세서에 기재된 것과 같은 뉴런 특이적 리포터의 사용은, 직접적인 식별을 허용한다. 이는 성공적인 변환에 대한 직접적인 증거를 제공하며 패치 클램프 전기 생리학에 필요한 라이브 세포 식별을 허용합니다.

<table><tbody><tr><td><AAV5 클로닝 및 바이러스 벡터 준비용 강력>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP(FLEX) 서열 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaagacgcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP(FLEX) 서열 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal bovine serum)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190094</tr><tr><td>HEK293 셀</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>플라스크</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> TE 버퍼의 경우 10mM, pH 8.0 사용; 용해 버퍼의 경우 50mM, pH 8.5 사용; IE 버퍼의 경우 20mM, pH 8.0 사용; 용리 버퍼의 경우 20mM, pH 8.0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA: Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> TE 버퍼 사용, 1mM EDTA </td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td><td> 참조: 초순수 시스템 </td></tr><tr><td>CaCl2</td>, <td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td>, <td>2.5 M</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s 인산염 완충 식염수 (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>는 HBS에 140 mM을 사용합니다. 용해 버퍼는 150 mM을 사용합니다. IE 버퍼는 15 mM을 사용합니다. 용출 버퍼에는 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td>를 사용합니다. <td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>는 용해 버퍼에 대해 다음을 수행합니다: 1 mM </td></tr><tr><td>초원심분리 밀봉 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg; &nbsp; 폴리프로필렌 튜브</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&trade; &nbsp; 밀도 그라디언트 매체</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>10-mL 주사기-18G 바늘</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>실험실 유리병</td><td>VWR</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>음이온 교환 필터</td><td>PALL 실험실</td><td>MSTG25Q6</td><td> Mustang Q 멤브레인이 있는 Acrodisc 장치 </td></tr><tr><td>Centrifugal filter unit</td><td>Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Amicon Ultra-4 device </td></tr><tr><td>Endotoxin-Free Plasmid DNA Isolation Kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>팔콘 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>ITR(Inverted Terminal Repeat) 시퀀스</td><td></td><td></td>용 포워드 프라이머 <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>ITR(Inverted Terminal Repeat) 시퀀스</td><td></td><td></td><td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&acute에 대한 역 프라이머; FAM / 3&급성; BHQ1 프로브</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 mm 필터</td><td>Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV 필터</td></tr><tr><td>EQUIPMENT AAV5 VIRAL VECTOR PREPARATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer -20 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉동고 -80 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장고 +4 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV 바이러스 성 방</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>초순수 시스템</td><td>Merck</td><td>Milli-Q &reg; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K 초원심분리기</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>중합효소 연쇄 반응 (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>정량적 PCR (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 시스템</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>ANIMAL MODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre 마우스</td><td>Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, 재고 #008533</td><td></td></tr><tr><td>뇌에 재프로그래밍 인자를 주입하기 위한 시약</ 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>식염수</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr> <tr><td>에탄올</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> 따뜻한 물로 1% 용액으로 희석합니다. </td></tr><tr><td>버콘</td><td>비로데름</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> 60 mg/ml의 복용량으로 말단 절차를 위한 i.p. </td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>STRONG>BRAIN에 재프로그래밍 인자를 주입하기 위한 장비</td><td></td><td></td><td> RSG Solingen에서. </td></tr><tr>가<td>위</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>from Biochem.</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>포셉</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>메스 홀더</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>번호 20.</td></tr><tr><td>메스</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>입체 프레임</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>마우스 이어 바</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>탈</td></tr><tr><td>착식 바늘이 있는 5 ul 주사기</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 내경 및 1.5 외경. </td></tr><tr><td>유리 모세</td>관 <td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 풀러</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>치과 드릴</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>면도기</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 챔버 및 펌프</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>니들스</td><td>머크</td><td>Z192414&nbsp; Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>마우스 및 신생아 쥐 어댑터 입체 택시 프레임</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> Covidien 2187에서. </td></tr><tr><td>면 거즈</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>고무 튜브</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td>전체 세포 패치 클램프 기록용 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO<>4-H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2-6 H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> 초순수 시스템 참조 </td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td> 1M <td>또는 2M를 준비합니다.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-글루코네이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>G4500&nbsp; 시그마</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (에틸렌 글리콜-비스-N-테트레이틱산)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E3889&nbsp; 시그마</td><td></td></tr><tr><td>KOH- 헤페스 산 (N-2- 히드 록시 에틸 피페 라진 -N'-2- 에탄 술폰산)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>바이오 시</td><td>틴 시그마 - 알드리치</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>피크로톡신</td><td>머크</td><td>P1675&nbsp; 시그마</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>머크</td><td>C239&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 피펫</td><td>Sutter Company</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 풀러</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>WaterBath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS for immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td> 4%의 농도에서 사용하십시오. 주의:&nbsp; PFA는 강력한 정착제입니다. 섭취 및 피부 접촉을 피하십시오. </td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td> 0.1%의 농도로 사용합니다. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td> Donkey.1 : 400의 농도에서 사용합니다. </td></tr><tr><td>Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> Milli-Q 물의 분말을 1mg/mL로 재구성합니다. 부분 표본 및 -20°C에 저장; 씨,&nbsp; 빛에 민감합니다. 1 : 500의 농도에서 사용하십시오. </td></tr><tr><td>4&프라임;,6-디아미디노-2&프라임;-페닐린돌 디하이드로클로라이드(DAPI)</td><td>시그마 알드리치</td><td>D9542</td><td> 1:600 in KPBS-T. </td></tr><tr><td>streptavidin- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434315</td><td>1:5000, 토끼.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, 마우스.</td></tr><tr><td>안티 PV</td><td>시그마</td><td>P3088</td><td>1:200, 염소.</td></tr><tr><td>안티 채팅</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000, 토끼.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, 치킨.</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 솔루션</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> DABCO가 포함된 폴리비닐 알코올 마운팅 매체, </td></tr> 안티페이딩 <tr><td>OCT</td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>부동액</td><td>Tissue Pro Technology</td><td>AFS05-1000N, 1000 mL/개</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경.</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

생체 내에서 뇌의 상주 신경교를 기능및 아류형 특이적 뉴런으로 변환하는 것은 대체 세포 대체 요법의 개발을 향한 한 걸음을 내딛는 동시에 구내에서 세포 운명을 연구하는 도구를 만듭니다. 현재까지 생체 내 재프로그래밍을 통해 뉴런을 얻을 수 있었지만, 이러한 뉴런의 정확한 표현형이나 성숙 하는 방법은 자세히 분석되지 않았습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 AAV 기반 바이러스 벡터 시스템을 사용하여 생체 내 재프로그래밍 된 뉴런의 보다 효율적인 변환 및 세포 별 식별을 설명합니다. 우리는 또한 재프로그래밍된 세포의 신경 성숙에 대한 기능적 평가를 위한 프로토콜을 제공한다. 플립-절제(FLEX) 벡터를 주입함으로써, 세포 리프로그래밍의 표적역할을 하는 뇌의 특정 세포 유형에 리프로그래밍 및 시냅신 구동 리포터 유전자를 함유한다. 이 기술은 새로 프로그래밍 된 뉴런의 쉬운 식별을 할 수 있습니다. 결과는 수득된 재프로그래밍된 뉴런이 시간이 지남에 따라 기능적으로 성숙하고, 시냅스 접촉을 받고, 다른 유형의 인터뉴런의 전기 생리학적 특성을 보여준다는 것을 보여준다. 전사 인자 Ascl1, Lmx1a 및 Nurr1을 사용하여, 재프로그래밍된 세포의 대다수는 빠른 스파이크, 파르브알부민 함유 인터뉴런의 특성을 갖는다.

AAV 벡터의 주사는 NG2-Cre 마우스 줄무늬(도1A)에서뉴런으로 상주하는 NG2 글리아 세포를 성공적으로 재프로그래밍하는 데 사용된다. 구체적으로 NG2 glia를 표적으로 하기 위해, 리프로그래밍/리포터 유전자를 가진 FLEX 벡터는 안티센스 방향으로 삽입되고 두 쌍의 안티병렬,이종 성 loxP 부위에 의해 측면에 삽입된다(그림 1B). 3개의 재프로그래밍 유전자(Ascl1, Lmx1a 및 Nurr1)는 각각 의 개별 벡터에 대한 유비쿼터스 cba 프로모터의 제어 하에 배치된다. GFP 발현이 Cre 발현 세포로부터 유래된 재프로그래밍된 뉴런으로 제한되도록 하기 위해, GFP는 뉴런 특이적 시냅신 프로모터의 제어하에 배치된다(또한 FLEX 벡터에서).
리프로그래밍 및 리포터 구문의 조합의 사용은 마우스 줄무늬에서 GFP 양성 뉴런의 생성을 허용한다(도1C,C'). 재프로그래밍 유전자의 존재 없이 리포터 구조의 사용은 GFP 양성 뉴런을 생성하지 않는다(도1D).
바이오시틴이 채워진 재프로그래밍된 뉴런은 사후 면역 염색 후 볼 수있다(도 2A). 변환이 성공하면 광범위한 신경 형태가 있어야합니다. 재프로그래밍된 뉴런의 전기생리학적 기록은 자발적인 활성 측정을 가진 후발성 기능적 연결의 존재를 보여준다(도2B,C). 이 ionotropic GABAergic 또는 글루타마테르지 차단제와 함께 차단 될 수 있습니다 (Picrotoxin 또는 CNQX), 다시 프로그래밍 된 뉴런에 흥분 성 및 억제 시 냅 스 입력을 제안. 자발적인 활동의 발생은 시간 후바이러스 주사 (그림 2D)와 함께 증가하여 점진적 인 성숙을 나타냅니다.
전류 유도된 활동 전위는 기능적인 뉴런에서 존재합니다. 변환 후 시간이 지남에 따라 작업전위가 증가합니다(그림 2E). 이것은 또한 신경 기능의 성숙을 나타냅니다. 미성숙한 뉴런에서, 전류는 없음 또는 극소수의작용 전위를 유도한다(도 2F).
뉴런의 발사 패턴은 세포의 형태와 채널 발현(15)과 같은인자에 의존하기 때문에 세포 유형별이다. 생체 내 재프로그래밍된 뉴런에서 기록된 패턴은 내인성 뉴런 아류형과 비교하여, 예를 들어 빠른 스파이크 인터뉴런(Cell Type B, 도 3B)또는 다른 세포 유형(그림3A,C, D) ). 관찰된 전기생리학적 차이는 GFP와의 특정 아류형 마커 및 공동 발현의 존재에 의해 확인될 수 있다(도 3E-H). 전부, 이 데이터는 줄무늬에 존재하는 재프로그래밍된 뉴런이 Parvalbumin-, ChAt- 및 NPY-발현과 같은 다른 유형의 인터뉴런의 특성을 가지고 있음을 나타내며, 줄무늬 배지 가시 뉴런 정체성(DARPP32+) 그림 3E -H)를참조하십시오.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> 그림 1: 상주 NG2 글리아의 생체 내 재프로그래밍을 뉴런으로. (A) AAV 바이러스-줄무늬 NG2 글리아의 생체 내 재프로그래밍에서 매개된 회로도 표현. (b) 생체 내 재프로그래밍에 사용되는 AAV5 FLEX 구조체의 개략적 표현은 표적 세포에서 의 유전자 발현에 의해 유전자 발현이 조절된다. (C 및 C')생체 내에서 신경세포를 다시 프로그래밍하여, 신-GFP + ALN 주사를 줄무늬로 주입하였다. (D) 바이러스 성 칵테일에 재프로그래밍 요인이 첨가되지 않은 경우 재프로그래밍 된 뉴런의 부재, 오직 리포터 구성만이 생체 내에서 주입된다. 축척 막대 = 100mm(C), 25mm(C'), 25mm(D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> 그림 2: 생체 내 재프로그래밍된 뉴런은 기능적이며 시간이 지남에 따라 성숙을 보여준다. (A) 바이오시틴이 채워진 재프로그래밍 된 뉴런은 수지상 척추를 포함하는 성숙한 신경 형태를 나타낸다. 트레이스는 (B) 억제 (GABAergic) 활성은 PICrotoxin으로 차단되는 활성, GABAA 수용체 길항제 및 (C) CNQX, AMPA 수용체 길항제로 차단되는 흥분성 활성. (D) 후시냅스 활동이 있는 뉴런의 수는 시간이 지남에 따라 증가합니다. (E) 패치 된 뉴런은 이미 5 주 후 주입 후 (w.p.i.)에서 반복적 인 발사를 보여주고 8 및 12 w.p.i. (F) 미성숙 뉴런의 현재 유도 된 행동 전위 및 후발성 활성을 보여 줄 수 있으며, 시냅스 (saptic)는 거의 시냅스를 보이지 않습니다. 이벤트 및 B 및 D. 규모 막대 = 25mm에 비해 몇 가지 작업 잠재력이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> 그림 3: 생체 내 재프로그래밍된 뉴런은 줄무성 인터뉴런의 면역조직화학적 및 전기생리학적 특성을 보여준다. (A-D) 생체 내 재프로그래밍 된 뉴런의 발사 패턴은 뚜렷한 유형일 수 있습니다: (A) 유형 A는 내인성 배지 가시 뉴런 (DARPP32+)과 유사합니다; (B) 빠른 스파이크와 유사 (PV +) 인터 뉴런; (C) 눈에 띄는 처짐 (NPY+)와 낮은 임계 값 스파이크 뉴런과 유사; (D) 큰 과분극 (채팅 +)로 발사 뉴런. (E-H) GFP 및 인터뉴런 마커 PV(E), ChAT(F), NPY(G), 및프로젝션 뉴런 마커 DARPP32(H)의 공동 국소화를 나타내는 공초점 이미지. 모든 축척 막대 = 50mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 생체 내에서 직접 다시 프로그래밍 된 인터뉴런을 생성하는 것을 목표로, 뇌의 AAV 기반 바이러스 시스템과 생체 내에서 세포 식별 및 추가 분석을 허용하는 FLEX 시냅신 구동 GFP 리포터를 사용하여.

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

이 프로토콜은 상주 신경교에서 두뇌에 직접 새로운 뉴런을 생성할 수 있고 이 재프로그래밍된 세포가 하위 형 특정 뉴런으로 성숙한다는 것을 보여줍니다. 주요 장점은 NG2-glia와 분석을 위해 다시 프로그래밍된 뉴런에 라벨을 붙이는 GFP 리포터의 특정 타겟팅을 가능하게 하는 cre-의존하는 AAV 바이러스입니다. 두뇌에 있는 새로운 뉴런을 생성하는 것은 두뇌에 있는 세포 보충 치료를 위한 미래 발달로 이끌어 낼 수 있습니다.우리의 프로토콜에서 우리는 정신 장애에 대한 의미가 parv알부민 양성 인터뉴런을 생성합니다. 생체 내에서 리프로그래밍은 어떤 신경 표현형 및 당신이 표적으로 하고 싶은 신경 조건에 따라서 그밖 두뇌 영역 및 회로에 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 제니 요한슨입니다 : 기술자, 마리아 페레이라 : 전 박사 과정 학생, 마르첼라 Birtele : 우리의 실험실에서 박사 과정 학생.AAV5 바이러스 벡터를 생성하기 위해 5개의 T175 플라스크에서 표준 배양 배지를 가진 시드 HEK293T 세포. 세포가 50 ~ 70 %의 합류에 도달하면 변환을 위해 다음 혼합을 준비하십시오. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 동일한 양의 벡터 플라스미드와 pDG 시리즈 도우미 플라스미드를 추가합니다.Tris-EDTA 버퍼를 144 마이크로리터의 최종 부피에 추가한 다음 초순수 수를 추가하여 총 1296마이크로리터를 혼합합니다. 다음으로, 2.5 어금다 칼슘 염화칼슘의 144 마이크로리터를 추가하고 혼합합니다. 그 후, DNA 용액과 소용돌이에 즉시 HBS의 1.92 밀리리터를 추가합니다.정확히 60 초 동안 실온에서 배양. 이어서, 용액을 신선한 세포 배양 배지의 28 밀리리터로 이송하고 혼합한다. 플라스크의 배지를 트랜스빙 믹스를 포함하는 매체로 바꿉다.3 일 동안 기다렸다가 미디어를 낭비로 옮기. 각 플라스크에 5밀리리터의 수확 버퍼를 추가한 다음 각 플라스크에 4밀리리터의 DPBS를 추가하여 나머지 셀과 풀을 셀 용액으로 헹구세요. 수확한 세포를 섭씨 4도에서 5분간 1, 000 x g에서 원심분리합니다.원심 분리 후, 상체를 제거하고 용해 버퍼의 15 밀리리터에 펠릿을 용해. 50 밀리리터 원심분리기 튜브를 드라이 아이스에 15분간 얼리고 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 사용하기 전에 수확한 셀을 섭씨 37도에서 수조에 담근 해동하십시오.이 절차에서는 iodixanol 그라데이션 극심분리에 의한 AAV 정화를 수행하고 실온에서 1시간 45분 동안 350, 000 x g의 원심분리가 있는 초원심분리기 천장 튜브를 사용합니다. AAV 함유 위상을 추출하려면 10 밀리리터 주사기를 18 게이지 바늘로 삽입하여 40 내지 60%의 위상 테두리 아래 약 2밀리미터에서 배꼽을 위쪽으로 향하고 철회한다. 바이러스 벡터의 5 ~6 밀리리터가 추출 된 후 단백질 밴드에 도달하기 전에 중지해야합니다.이어서, 희석된 이오디산올 그라데이션을 애니메이션 교환 필터를 통해 정화하고 농축하여 초당 1방울 이하로 빠르게 밀어내지 않는다. 그 후 필터를 통해 IE 버퍼 3밀리리터를 천천히 밀어 씻어내도록 합니다. 다음으로, 용출 버퍼의 1 ~ 2 밀리리터와 원심 필터 단위로 혼합물을 엘테.장치에 DPBS를 추가하여 4밀리리터의 최종 볼륨에 추가합니다. DPBS의 0.5 밀리리터 미만이 필터에 남아있을 때까지 실온에서 2, 000 x g의 원심분리기. 그 후, 튜브의 바닥에서 액체를 제거하고 DPBS의 4 밀리리터로 리필하고 원심분리기를 다시 작성합니다.이 단계를 두 번 더 반복하면 필터에 집중된 벡터의 부피가 마지막 원심 분리 후 약 200 마이크로리터인지 확인합니다. 파이펫을 사용하여 200 마이크로리터 농축 벡터를 제거하고 0.22 마이크로미터 필터를 통해 눌러 멸균합니다. 다음으로, aliquot 200 마이크로 리터는 연동 된 삽입 유리 유리 바이알에.재프로그래밍 요인을 주입하려면 스테레오탁스 프레임에 마취된 마우스를 배치합니다. 수술 초기에 적절한 진통을 투여한 다음 브레그마 바로 위에 주사 바늘의 유리 모세관 끝을 가져옵니다. 모세관 팁이 A-P 와 M-L 평면 모두에서 완벽하게 직선인지 확인하십시오.디지털 좌표 카운터에서 M-L 및 A-P 값을 모두 0.0으로 재설정합니다. 동물의 머리가 완벽하게 평평한 위치에 있는지 확인하려면 디지털 좌표 카운터를 사용하여 A-P 암이 2.0 및 마이너스 2.0에 있을 때와 M-L 암이 2.0 및 마이너스 2.0에 있을 때 D-V 좌표 값을 측정합니다. 치아 막대와 이어 바의 높이를 그에 따라 조정합니다.그 후 주사기를 약간 올리고 주사 좌표에서 치과 드릴을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 현장에서 드릴을 시작하여 원형과 부드러운 방식으로 작업합니다. 그런 다음, 열린 절개 위에 면 거즈 조각을 놓고 식염수 용액으로 주사기를 플러시하십시오.플러싱 후, 바이러스 벡터를 포함하는 용액의 기포와 다음 하나의 마이크로 리터를 그립니다. 바이러스 성 솔루션이 기포 아래에 쉽게 시각화 될 수 있는지 확인하십시오. 다음으로 주사기를 낮추고 원하는 깊이로 천천히 진행하며 궤적이 뼈 조각이 명확하지 않은지 확인합니다.그 후, 분당 0.4 마이크로리터의 속도로 바이러스 용액의 마이크로리터 1개를 주입한다. 주사가 완료되면 주사기 가출되기 전에 2 분 동안 확산을 허용하십시오. 확산 후, 모세관의 끝이 뇌에서 완전히 철회 될 때까지 주사기를 천천히 철회 한 다음 절개를 조심스럽게 봉합하고 스테레오 테틱 프레임에서 동물을 제거합니다.의식이 회복 될 때까지 수술 후 역에서 동물을 모니터링합니다. 동물은 최대 보관 12 성숙한 뉴런으로 재프로그래밍 하는 주민 glia 를 허용 하기 위해 바이러스 주입 후 주. 진동을 사용하여 전기 생리학에 대한 뇌 조각을 준비하기 위해, 가장 장밋빛 부분에서 고속으로 줄무늬 수준으로 뇌를 섹션.그런 다음 striatum을 초당 0.1 밀리미터에서 275 마이크로미터로 관상으로 단면합니다. 각 섹션 후, 신중하게 비 주입 된 striatal 측면을 제거하고 실온에서 수조에 바닥 그물과 산소 CREB 감각 슬라이드와 유리병으로 주입 측을 전송합니다. 모든 섹션이 절단 될 때까지 실온에서 유리병을 유지합니다.그 후, 천천히 수조의 온도를 섭씨 37도로 높이고 30 분 동안 방치 한 다음 히터를 끄고 실온으로 식힙니다. 전기 생리학을 위한 기록 챔버에 1개의 조직 단면을 전송한 후에, 기록 전극에 유리 파이펫을 장착하고 용액으로 낮춥니까. 전극의 저항을 다시 확인합니다.그런 다음, 파이펫으로 리프로그래밍된 셀에 천천히 접근하여 전극에 약간의 양압을 유지하여 팁을 연결하지 않도록 하고, 패치 전에 세포가 GFP 양성지있는지 확인합니다. 세포가 패치되면 현재 클램프의 셀을 마이너스 60에서 마이너스 70 밀리볼트로 유지하고, 마이너스 20에서 90 피코아페레스까지 500밀리초 전류를 주입하여 10개의 피코팜페레이 증분을 사용하여 작용 잠재력을 유도한다. 이것은 신경 성숙과 성공적인 재프로그래밍을 나타냅니다.그 후, 전압 클램프로 전환하고 10 밀리볼트의 탈극 단계에서 내측 나트륨 및 지연 된 정류 칼륨 전류를 측정합니다. 여기에 성숙한 신경 형태와 수지상 척추를 보여주는 재 프로그래밍 된 뉴런을 기록 한 게시물기록입니다. 여기서, 리프로그래밍된 뉴런의 전기생리학적 기록은 자발적인 활동 측정을 가진 포스트냅스 기능적 연결의 존재를 보여준다.추적은 피크로톡신으로 막힌 억제 활성을 보여 주며, GABAA 수용체 길항제 및 AMPA 수용체 길항제인 CNQX로 막힌 흥분 작용활동을 보여줍니다. 패치 된 뉴런은 이미 5 주 후 주사 후 포스트 냅 스 활동을 표시, 그리고 에서 계속 8 그리고 12 주 후 주입. 현재 유도 된 작용 잠재력을 가진 뉴런의 수는 또한 시간이 지남에 따라 증가합니다.더 상세한 분석은 세포의 대다수가 parvalbumin interneurons와 유사한 빠른 스파이크 활동을 보여주는 몇몇 명백한 발사 패턴을 제시했습니다. 12주 에서 면역화성 분석은 기자 GFP와 파르살알린의 공동 발현을 보여주었다. 이 절차에 따라 패치 추구 기술로 유전자 발현을 검사하거나 단신분석 추적 및 iDISCO를 통한 3차원 시냅스 연결을 평가할 수 있습니다.이제 상주 신경교를 인터뉴런을 표현하는 parvalbumin으로 재프로그래밍할 수 있게 되었으므로, 우리는 이들이 정통인지, 치료 도구로 사용될 수 있는지 조사하기 시작했습니다. 동물을 취급하고 AAV 바이러스를 사용할 때 확립된 프로토콜 및 지침을 따르는 것을 기억하십시오.

in-vivo-direct-reprogramming-resident-glial-cells-into-interneurons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서 우리는 시각 피질의 뉴런과 glia의 형광 라벨에 대한 AAV 벡터의 intracranial 주사를 제시한다.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

이 비디오는 형질주입된 마우스 선조체 절편에서 신경교세포의 뉴런으로의 성숙 및 재프로그래밍을 평가하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 실험은 뉴런 특이적 형광 마커와 전기 생리학 기술을 사용하여 휴지막 전위와 전류 주입에 대한 반응을 측정합니다. 이러한 측정 중 전압 스파이크는 성공적인 뉴런 성숙 및 재프로그래밍을 나타냅니다.

생쥐 뇌 슬라이스에서 재프로그래밍된 뉴런의 전기생리학적 기록

출처: Pereira, M. et. al., 바이러스 벡터의 뇌내 주사에 의한 상주 신경교세포를 인터뉴런으로 생체 내 직접 재프로그래밍. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 형질전환 마우스의 대뇌 피질에 아데노 관련 바이러스를 정위 주사하여 Cre 의존성 뉴런 재프로그래밍 및 형광 리포터 유전자를 신경교세포에 전달하는 방법을 보여줍니다.

마우스 모델에서 신경교세포 재프로그래밍을 위한 바이러스 벡터의 정위 주입

직접 혈통 프로그래밍에 대한 뇌 상주 세포를 표적으로하는 것은 뇌 수리에 대한 새로운 관점을 제공합니다. 여기서 우리는 성인의 대뇌 피질에서 뇌에 상주하는 혈관 주위 세포에 풍부한 문화를 준비하고 SOX2 및 Ascl1 요인 전사의 레트로 바이러스 매개 식에 의해 유도 된 신경 세포로 이러한 변환하는 방법의 프로토콜을 설명합니다.

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

여기에서 우리는 초기 출생 후 마우스의 피질로 이식된 피질 interneuron 선조의 활동을 조작하기 위하여 화학유전학 공구를 이용하기 위하여 디자인된 프로토콜을 제시합니다.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

우리는 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간의 피부 유래 섬유 아세포와 유도 된 천체 세포 (iA)로 후속 분화를 재프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 대량으로 iNPC 및 iA의 빠르고 재현 가능한 생성으로 이어집니다.

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

우리는 마우스 뇌에서 루시페라아제-녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 이중 리포터 벡터로 형질도입된 인간 신경 전구 세포의 사다리꼴 이식을 기술한다. 이식 후, 루시퍼라아제 신호는 형광 현미경을 사용하여 뇌 절편에서 확인된 생체 내 생체 발광 및 GFP 발현 이식된 세포를 사용하여 반복적으로 측정된다.

Intracerebral 이식 및 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 생체 내 생체 발광 추적

여기서 우리는 출생 후 마우스의 중추 신경계의 다른 영역에서 유래 된 성상 세포의 고도로 농축 된 배양물을 생성하고 전사 인자의 강제 발현에 의해 기능적 뉴런으로 직접 전환시키는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍

학습하세요 AAV 바이러스 벡터를 이용해 뇌 내 상주 신경교 세포를 파발부민 양성 인터뉴런으로 직접 재프로그래밍하는 방법을. 이 기술은 정신질환 연구와 세포 치료 개발에 활용됩니다.

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

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