Name: 총 탄 잔류물의 추정 검출을 위한 새로운 세균 바이오 센서의 제조 및 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 배우세요 합성생물학 기법을 이용한 세균 바이오센서 제작 및 총격 잔류물 검출 방법을 형사과학에 적용하는 비용 효율적인 대안 기술입니다.

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저자는 BIOL 324 (유전학)의 롱 우드 대학에서 학생 들과 화학 403 안티 몬 및 리드 바이오 센서의 초기 준비 및 테스트에 관여 한 (고급 화학 실험실 문제 해결) 학생 들을 인정 하고자 합니다. MicRoboCop에 대 한 아이디어는 GCAT SynBIO 워크샵 (여름 2014)에서 잉태 되었으며,이는 NSF와 하 워드 휴즈 메디컬 인스티튜트가 자금을 지원 하며 메릴랜드 대학교에서 주최 합니다. 저자는 또한 롱 우드 대학의 요리사-콜 예술과 과학의 대학과 GCAT SynBio 동창 보조금에서 받은 자금을 인정 합니다.

참고: RFP를 발현 하는 대장균 의 합성이 제시 된다.
1. 대장균 에서 플라스 미드 DNA의 제조
<ol><li>Rfp 유전자와 암 피 실린 저항성 유전자를 갖는 플라스 미드를 포함 하는 대장균을 해 동 하 고, µ를 함유 100 하는 luria 브로스 (LB) 한 천 판에 대장균을 37 ° c에서 24 시간 동안 성장 시켰다. 예를 들어, 합성 생물학에 사용 되는 표준 생물학적 부품의 레지스트리에서 J10060 플라스 미드를 사용 하십시오 ( 재료 표참조). 상기 J10060 플라스 미드는 pBad 프로모터 영역과 암 피 실린 저항성 유전자의 제어 하에 RFP (적색 형광 단백질)에 대 한 유전자를 포함 한다. 대안적으로, 대장균 형질 전환 (3.2 단계 참조) 플라스 미드를 LB 한 천 판에 성장 시키기 전에.</li>
	<li>표준 미니 준비 프로토콜 ( 재료 표참조)을 따라 J10060 플라스 미드를 포함 하는 대장균 배양 액 1 mL에서 DNA를 분리 합니다. 다음 프로토콜의 목적은 pBad 프로모터를 제거 하 고이를 장치에 대 한 원하는 프로모터로 대체 하는 것 이다.</li>
	<li>플라스 미드 미니 준비 후, 소화를 위한 준비가 될 때까지 냉동에 DNA를 저장 합니다.</li>
</ol>2. 제한 효소 분해
<ol><li>EcoRI 및 NheI 소화를 위한 마이크로 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 반응을 설정 합니다. J10060 플라스 미드 DNA (단계 1에서 분리 된 10 μ l), 물 8 μ l 및 1 μ l의 각 EcoRI 및 NheI 효소 1 μ l를 완충 액으로 미리 혼합 하였다 ( 물질 표참조).</li>
	<li>프로모터 DNA의 경우, EcoRI 및 NheI 소화를 위한 마이크로 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 반응을 설정 합니다: 어 닐 링 프로모터 DNA 서 열 10 μ l (물 8 μ l 및 1 μ l 각각의 EcoRI 및 NheI 효소 1 μ l를 완충 액으로 미리 혼합 하였다.<ol>
<li>Sb-, Pb 또는 TNT RFP의 경우 ( 재료 표참조), 올리고 뉴클레오티드를 완충 액 (30MM 헵 스, pH 7.5, 100 mM 칼륨)과 동등한 몰 농도로 배양 하 고, 2 분 동안 94 ° c로가 열 하 고 상 온에서 서서히 냉각 시킨다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파이 펫을 10 μ l로 부드럽게 위아래로 피 펫 팅 하 여 샘플을 섞어 줍니다.</li>
	<li>37 ° c에서 30 분 동안 배양 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 80 ° c에서 효소를 불 활성화 시킵니다.</li>
	<li>다음 단계를 준비할 때까지 소화 된 DNA를 냉동 고에 보관 하십시오.</li>
</ol>3. 결 찰과 변화
<ol><li>
결 찰
	<ol>
<li>2 단계에서 EcoRI 및 NheI로 이중 소화 된 플라스 미드 및 프로모터 DNA를 사용 하 여, 상기 표 1 에 나타난 반응 혼합물을 미세 원심 분리기 튜브에 얼음으로 설치 하 고; T4 DNA Ligase를 마지막에 추가 합니다. 참고: 표 1 은 표시 된 DNA 크기에 대 한 1:3 벡터의 몰 비를 사용 하 여 결 찰을 나타낸다.</li>
		<li>부드럽게 피 펫 팅 하 고 미세 원심 분리기로 반응을 가볍게 섞는다.</li>
		<li>실 온에서 10 분간 배양 합니다.</li>
		<li>10 분 동안 65 ° c에서 열을 비활성화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
변환
	<ol>
<li>마지막 얼음 결정이 사라질 때까지 얼음에 DH5-알파 유능한 대장균 세포의 20 µ l와 튜브를 재개.</li>
		<li>5 µ L의 플라스 미드 DNA를 세포 혼합물에 첨가 한다. 세포와 DNA를 혼합 하기 위해 튜브를 4-5 번 조심 스럽게 넘깁니다.</li>
		<li>혼합물을 얼음에 2 분간 두십시오.</li>
		<li>정확히 30 초 동안 정확히 42 ° c의 열 충격. 혼합 하지 마십시오.</li>
		<li>얼음 위에 2 분간 둡니다. 혼합 하지 마십시오.</li>
		<li>실 온의 피 펫 380 µ L을 혼합물에 SOC. 앰 피 실린 (100 µ)를 함유 하는 LB 한 천 판에 즉시 펴 바르고 37 ° c에서 밤새 배양 한다.</li>
		<li>성장을 위해 24 시간 내에 플레이트를 확인 하십시오.</li>
		<li>밀봉 필름으로 판을 밀봉 하 고 다음 단계를 위해 준비 될 때까지 냉장고에 보관 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 식민지 PCR
<ol><li>반응 혼합물을 PCR 튜브 (4 개의 반응 관 설정)에 추가 하 여 표 2에 나타내 었 다.</li>
	<li>위아래로 파이 펫 팅 하 여 반응을 부드럽게 섞는다.</li>
	<li>황색 피 펫 팁을 사용 하 여 형질 전환 된 대장균의 콜로 니 (또는 매우 작은 부위)를 긁어 냅니다. 이 대장균 의 스 와이프를 새로운 LB/암 피 실린/한 천 판으로 옮겨 놓은 다음, 피 펫 팁을 PCR 튜브에 삽입 합니다. 대장균을 PCR mix와 혼합 하기 위해 피 펫 팁을 흔들어 주십시오. 추가 식민지를 위해 세 번 더 반복 합니다. Pcr 튜브를 PCR 기계로 이송 하 고 표 3에 나타난 프로그램을 사용 하 여 온도 순환을 시작 한다.</li>
	<li>태에서 2% 아가 로스 겔을 이용 하 여 겔 전기 영동을 실행 하 여 플라스 미드에 가장 좋은 결 찰이 있는 콜로 니를 확인 하 고 그 식민지를 새로운 판 상에 서 성장 시켰다.</li>
	<li>테스트 준비가 될 때까지 접시를 냉장고에 보관 하십시오. 루 리아 브로스의 액상 배양 액을 100 µ의 암 피 실린을 첨가 하 여 화학 시험에 투입 하였다.</li>
</ol>5. DNA 염기 서 열 분석
<ol><li>각 샘플에 대해 5 µ L의 플라스 미드, 염기 서 열 분석 프라이 머 4 µ L 및 탈 이온 수 3 µ L을 첨가 한다.</li>
	<li>이 혼합물을 튜브에 넣고 DNA 시퀀싱 ( 재료 표참조)을 위해 보내십시오.</li>
	<li>Dna 서 열 데이터를 분석 하 여 유전자가 정확 하 게 삽입 되었다는 것과 돌연변이가 없는지 확인 하기 위해 dna 서 열의 분석 소프트웨어를 사용 하 여 예상 되 고 관찰 된 DNA 서 열을 비교 한다. 참고: 화학 센서로 대장균을 사용 하는 것은 아래에 제시 되어 있습니다.</li>
</ol>6. 대장균 배양 물의 제조
<ol><li>액체 배양을 위한 100 µ g/mL 암 피 실린으로 LB를 준비 합니다.</li>
	<li>양성 대조 군 * 세균과 음성 대조 군 * * 세균의 액체 배양 액을 준비 한다. 참고: * 양성 대조 군 박테리아: 대장균의 제어 하에 RFP 유전자와 함께 플라스 미드를 포함 하는 e. 콜라 이; 합성 생물학에 사용 되는 표준 생물학적 부품의 레지스트리에서 플라스 미드 E1010 ( 재료 표참조)이 작품에 사용 되었다. * * 음성 대조 군 세균: pBad 프로모터와 같은 상이한 프로모터의 제어 하에 RFP 유전자를 가진 플라스 미드를 포함 하는 대장균 (합성 생물학에 사용 되는 표준 생체 부품의 레지스트리에서 플라스 미드 J10060) ( 또는 rfp 유전자가 없는 플라스 미드를 제공 한다.</li>
	<li>배양 물을 37 ° c 및 220 rpm의 진 탕 인큐베이터에 넣고 최소 8 시간, 최대 18 시간 동안. 흐린 국물은 세균 성장을 나타냅니다.</li>
</ol>7. 장치의 기능을 확인 하는 대장균 적정
참고: 센서가 기능을 점검 하기 위해 적정 한 후에는이 단계를 반복할 필요가 없습니다. 납, 안티 몬 및 2, 4 개의 DNT 또는 1, 3 dinitrobenzene (1DNB)의 추가 형태의 포지티브 컨트롤은 전체 적정을 필요로 하지 않고 각 사용에 대 한 장치의 기능을 확인할 수 있습니다.
<ol><li>물에 10 ppm의 농도로 관심 대상 물질의 스톡 용액을 제조 한다. 용해성이 문제인 경우, 50/50 물/메탄올 혼합물을 사용 하십시오.</li>
	<li>표 4 를 가이드로 사용 하 여, 적절 한 수의 멸 균 배양 관에 라벨을 부착 하 고 배양 된 국물의 2 mL를 각 튜브에 넣고 (프로토콜 단계 6에서). 주: 일반적인 분석 범위를 결정 하기 위해서는 센서 박테리아, 네거티브 컨트롤의 한 레벨, 포지티브 제어를 사용 하는 한 레벨의 분석 물질을 적어도 3 가지 수준으로 수행 하십시오. 또한 추가 된 금속 (다른 유형의 음성 제어)이 없는 박테리아의 각각의 하나의 튜브가 있어야 합니다. 분석 범위 및 검출 한계를 보다 정확 하 게 판별 하려면 더 넓은 범위의 분석 물 농도를 사용 하십시오.</li>
	<li>분석 물 스톡 용액을 표 4에서 언급 한 바와 같이 2 mL의 국물을 포함 하는 튜브에 첨가 하 고 배양 튜브에 스냅 캡을 배치 하 여 그들이 느슨한 (튜브로의 공기 흐름을 허용 하기 위해)와 소용돌이 배양 튜브에 놓습니다.</li>
	<li>스냅 캡을 배양 튜브에 느슨하게 남겨 두고, 220 rpm에서 진 탕 인큐베이터에 넣고 적어도 24 시간 동안 37 ° c로 둡니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 튜브를 제거 하 고, 캡을 튜브에 단단히 끼워 놓고, 형광 분석을 위해 준비가 될 때까지 냉장고에 튜브를 보관 하십시오.</li>
</ol>8. GSR 용 화학 센서로 대장균 사용 
<ol><li>납을 제거 하도록 설계 된 에탄올 기반 와이프를 사용 하 여 ( 재료 표참조) 손가락 사이를 포함 하 여 손의 모든 표면을 닦습니다. 각 손 마다 별도의 와이프를 사용 합니다. 분석 될 때까지 적절 하 게 라벨이 부착 된 밀폐 알코올로에 물티슈를 보관 하십시오.</li>
	<li>테스트할 표면: 큰 표면에는 알코올 기반 와이프 또는 작은 표면을 위해 에탄올로 적신 면봉을 사용 하십시오. 참고: GSR에 대 한 센서의 응답을 보여주기 위해, 지출의 내부. 40 칼리버 카트리지 케이싱은 에탄올을 적신 면봉으로 입은.</li>
	<li>깨끗 한 장갑을 끼고 알코올로 청소 한가 위를 사용 하 여 와이프의 중앙에서 약 1cm2 섹션을 잘라냅니다.</li>
	<li>핸드 와이프 또는 면봉의 절단 조각을 센서 박테리아 2 mL이 들어 있는 배양 튜브에 직접 넣어 국물에 잠긴다.</li>
	<li>7.4 – 7.5 단계에서 위에서 설명한 대로 진행 합니다.</li>
</ol>9. 휴대용 분 광 계를 사용한 형광 분석 ( 재료 표참조)
<ol><li>소용돌이 믹서를 사용 하 여 튜브를 흔들어.</li>
	<li>500 nm의 여기 파장을 가진 RFP 변이체에 적합 한 파장에서 형광 방출을 수집 하기 위해 분 광 계를 준비 하십시오.</li>
	<li>Luria 국물을 사용 하 여 빈 스펙트럼을 기록 하십시오.</li>
	<li>각 상층 액을 낮은 부피의 큐 벳으로 조심 스럽게 전달 하 고 방출 강도를 수집 합니다.</li>
</ol>10.96-웰 플레이트 리더기를 사용한 형광 분석 ( 재료 표참조)
<ol><li>소용돌이 믹서를 사용 하 여 튜브를 흔들어.</li>
	<li>웰 플레이트에 국물의 200 mL를 잘 전달 합니다. 플레이트의 각 웰에 들어간 샘플을 기록 합니다.</li>
	<li>RFP 변이체에 대 한 적절 한 파장에서 발광 강도를 수집 하기 위해 fluorimeter를 설정 합니다.</li>
</ol>11. 데이터 분석
<ol><li>모든 네거티브 컨트롤 (RFP 네거티브 박테리아 또는 센서 박테리아가 추가 되지 않은)에서 얻은 신호를 사용 하 여 배경에 대 한 평균 형광 신호를 계산 합니다.</li>
	<li>센서 박테리아에 대해 얻어진 각 형광 신호에서 평균 배경 신호를 빼서 배경 보정 된 형광 강도를 얻는다.</li>
	<li>배경 보정 된 형광 강도를 평균 배경 신호로 나누어 신호 대 잡음 (S/N) 비를 추정 한다. S/N 비율이 3 보다 크면 테스트는 양수입니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개에 대 한 경쟁 금융 이익 또는 기타 이해 상충이 없습니다.

수정 및 문제 해결
표 4 에 기재 된 실험은 설계 된 센서에 적합 한 임의의 방식으로 변형 될 수 있다. 화학 센서의 가장 중요 한 측면은 민감도와 특이성을 평가 하는 것입니다. 센서의 유용한 분석 범위를 결정 하기 위해 분석 물의 광범위 한 농도가 분석 되도록 하는 것이 유리 합니다. 또한 세포에 대 한 분석 물의 최대 수준을 결정할 가치가 있습니다. 본 연구에서 사용 된 분석 물 들이 메탄올 용액 (TNT 유도체)에서의 독성 금속 (Pb 및 Sb) 또는 유기 화합물 이기 때문에, 분석 물질 또는 용액의 독성으로 인 한 세포 사 멸이 발생 하는 상위 레벨이 존재 한다 (일반적으로 500-1, 0 보다 높은 지금까지 실시 한 실험을 위한 00 ppb).
기술의 한계
이 작품에서 제시 된 결...

바이오 센서는 화학 물질 또는 분석 물의 검출에 사용 될 수 있는 반응을 생성 하는 생물학적 성분 (예컨대 단백질, 핵 산 또는 전체 유기 체)을 사용 하는 임의의 분석 장치 이다. 예를 들어 석탄 광산 산업은 20 세기의 대부분을 위해 석탄 광산1의 카나리아 인 독성 광산 가스의 존재를 감지 하는 바이오 센서를 사용 했습니다. 작업자를 보호 하기 위해 화학 물질 분석 물 (일산화 탄소)에 대 한 생물학적 유기 체의 반응 (카나리아의 사망 또는 고통)이 광부에 의해 관찰 되었습니다. 보다 현대적이 고 정교한 예에서, 박테리아는 형광 단백질의 발현과 같은 특이 적 반응을 나타내는 것에 의해 특정 화학적 분석 물질의 존재에 반응 하는 합성 생물학 기술을 사용 하 여 변경 될 수 있다.
합성 생물학은 자연적으로 존재 하지 않는 생물학적 장치 및 시스템의 건설을 지칭 하는 광범위 한 용어이 고, 또는 특정 목적을 위한 기존의 생물학적 시스템의 재설계2이다. 합성 생물학은 장치 및 시스템을 합성 하는 데 사용할 수 있는 표준 방법론 및 표준화 된 부품 (표준 합성 생물학 유전 요소)의 존재에 의해 유전 공학과 구별 된다. 일부 는 장치의게놈에 도입 되 고, 박테리아와 같은 생물체는 기능의 표시 역할을 할 특정 특성을 표현 합니다. 예를 들어, 많은 합성 장치에서, 형광 단백질의 발현은 리포터 단백질로 서 단일 세포 유기 체로 도입 된다. 여러 장치를 하나의 시스템으로 결합할 수 있습니다. 박테리아와 같은 미생물의 게놈은 이러한 방식으로 조작 하기 쉽습니다. 광범위 한 화학 분석 물에 특정 한 바이오 센서의 수많은 예가 지난 10년동안 문헌에서 보고 되었습니다.
이 작업에서, MicRoboCop 시스템은 법의학 및 환경 화학에 새로운 응용 프로그램과 합성 생물학 기술을 사용 하 여 설계 된 바이오 센서의 예로서 제시 된다. MicRoboCop은 결합 될 때, 대장균 이 사람의 손 또는 표면에서 수집 된 총 탄 잔류물 (gsr)의 존재 하에서 적색 형광 단백질 (rfp)을 발현 할 수 있게 하는 3 개의 분리 된 장치 시스템입니다. 3 개의 장치 각각은 GSR5의 구성 요소로 알려져 있는 특정 화학 물질 분석 물에 반응 합니다. 시스템이 응답 하는 3 개의 분석 물은 i. 2, 4, 6-트리니타로 톨루엔 (TNT) 및 관련 화합물 II. (납 이온의 형태로), III. 안티 몬 (이온의 형태로도).
GSR은 많은 다른 화학 물질로 구성 되어 있지만, 세 가지는 일반적으로 GSR은 바 륨, 납 및 안티 몬의5와 같은 잔류물을 식별 하는 데 사용 됩니다. GSR의 식별을 위한 표준 비 치열 시험은 에너지 분산형 X 선 형광을 가진 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용 하는 것입니다. 분석가는 SEM을 통해 GSR의 고유한 형태와 원소 성분을 확인할 수 있습니다. 현재, 사용할 수 있는 몇 가지 널리 사용 되는 바이너리 추정 테스트. 최근에 출판 된 추정 테스트는 많은 실험실에서 사용 하지 못할 수 있는 특수 장비 인 이온 이동성 분광학 (IMS)을 사용 합니다. 그들은 일반적으로 거리 결정 또는 총알 구멍과 상처에 GSR 식별을 위해 사용 되지만, 사용할 수 있는 몇 가지 색상 "스팟" 테스트도 있습니다5. 또한, 잠재적으로 현장 휴대용, 또는 양극 스트리핑 voltammetric의 장점을가지고 있는 voltammetric 분석을 사용 하는 GSR에 대 한 전기 화학 시험 문헌에 몇 가지 제한 된 주의가 있었다,이는 매우 금속 원소에 대 한 민감한 방법7. GSR을 검출 하기 위한 목적으로 특별히 설계 된 바이오 센서 문헌에는 거의 언급 되어 있지 않지만, 다른 포렌식 어플리케이션을 위한 바이오 센서는8 개출판 되었습니다.
마이크로 보 캅 시스템에서 각 장치에 대 한 생물학적 원소 및 플라스 미드 시공이 도 1에 도시 되어 있다. 도 1b 의 곡선 화살표는 분석 물의 존재 하에서 활성화 되는 프로모터 영역을 나타내며, 상기 타원형은 리포터 단백질의 번역을 허용 하는 리보솜 결합 부위 이며, 회색 상자는 rfp 라는 표지는 적색을 표현 하는 유전자 형광 단백질, 및 적색 팔각형은 전사 종결 부위 이다. 세 장치 모두 GSR을 감지 하는 시스템으로 함께 사용 됩니다. 특정 프로모터 (SbRFP, PbRFP 및 TNT RFP)를 가진 각 장치는 시험 되는 샘플과 함께 인큐베이션 되 고 RFP의 형광이 측정 될 것 이다. RFP는 적절 한 화학적 분석 물질이 존재 하 고 프로모터 영역을 활성화 하는 경우에만 발현 될 것 이다. GSR에 존재 하는 일부 화학 물질에 반응 하는 세 가지 장치가 설계 되어이 작품에 제시 된다.
3 개의 microbocop 장치에서 사용 되는 프로모터는 비소 및 안티 몬 계 민감한 프로모터, sbrfp9,10, 리드 민감성 프로모터, pbrfp11,12 및 TNT 민감성 프로모터, TNT-RFP 13. 문헌에서의 검색은 바 륨에 반응 하도록 설계 된 프로모터를 밝혀 내지 않았기 때문에,이 프로모터는 다 수의 구조적으로 관련 된 화합물 (특히, 2, 4-딘 트로 톨루엔 및 dinitrobenzene)는 GSR에 남겨진 유기 화합물의 일부가 되는 것으로 알려져 있다. 이 프로모터는 매 립 지 지뢰13에서 TNT와 2, 4 딘 트로 톨루엔 (2, 4 DNT)의 분 량을 구체적으로 감지 하는 데 성공적으로 사용 되었습니다. 세 가지 장치를 시스템으로 함께 사용 하 여 GSR에 대 한 긍정적 인 테스트는 세 장치 모두에서 형광을 생성 합니다. 1 개 또는 2 개의 장치 에서만 형광 신호는 GSR에 남아 있는 유기 화합물이 아닌 화합물에 의해 활성화 된 분석 물 (들) 또는 TNT 프로모터의 경우에 다른 환경적 공급원을 나타낼 것 이다. 세 대의 장치를 모두 사용 함으로써, 환경 오염 원으로 인 한 거짓 양성 결과의 가능성을 최소화할 수 있습니다. 인기를 얻고 있는 무연 탄약은 여전히 미국에서 탄약 판매의 약 5%만을 나타냅니다. 따라서 납의 부재로 인 한 거짓 부정 결과는 가능성이 있지만 GSR14의 마커로 납을 사용 하는 센서에는 여전히 유틸리티가 있습니다. 이 특정 법의학 응용 프로그램 외에도 각 장치는 환경 오염 물질을 감지 하기 위해 개별적으로 사용할 수 있습니다.
제시 된 프로토콜은 장치의 기능을 확인 하 고 얻어진 형광 신호를 분석 하기 위해 장치 (센서 박테리아) 및 분석 기법을 만드는 데 사용 되는 합성 생물학 기술을 포함 한다. 프로토콜은 또한 표면에서 GSR을 수집 하는 용의자 또는 swabbing의 손에서 GSR을 수집 하는 손 닦는 형태의 법의학 증거의 수집을 포함 한다. 리드 센서 장치의 결과는 사용 된 카트리지 케이스를 사용한 GSR에 대 한 포지티브 테스트의 데모와 함께 예제 결과로 제시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>1,3-디니트로벤젠, 97%</td><td>Aldrich</td><td>D194255-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,4-디니트로톨루엔, 97%</td><td>Aldrich</td><td>101397-5G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>안티몬, 참조 표준 용액(1000ppm &plusmn; 1%/인증)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA450-100</td><td>표준 묽은 HNO3</td></tr><tr><td>컷 스마트 버퍼</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>이중 버퍼</td><td>통합 DNA 기술</td><td>11-01-03-00</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF 제한 효소</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, HPLC 등급, 변성</td><td>Acros 유기물</td><td>AC611050040</td><td>용매는 HPLC 등급일 필요가 없으며 ACS 또는 시약 등급이 작동합니다.</td></tr><tr><td>Eurofins Genomics SimpleSeq DNA 염기서열분석 키트</td><td>Eurofins Genomics</td><td>SimpleSeq 키트</td> 콜로니 PCR 통합 DNA 기술용 표준 <td></td></tr><tr><td>포워드 프라이머</td><td>5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 염기서열분석을 위한 전방 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'</td></tr><tr><td>IBI Science 고속 플라스미드 미니 키트</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47101</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>리드, 참조 표준 용액 (1000ppm &plusmn; 1%/인증)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SL21-100</td><td>표준 희석 HNO3</td></tr><tr><td>LeadOff 일회용 세척 및 데콘 물티슈</td><td>Hygenall</td><td>45NRCN</td><td>용기 또는 개별 포장으로 판매되며 모든 알코올 기반 물티슈가 작동합니다.</td></tr><tr><td>메탄올, HPLC 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>용제는 HPLC 등급일 필요가 없으며 ACS 또는 시약 등급이 작동합니다.</td></tr><tr><td>NEB 5-알파 유능한 E. coli 세포</td><td>New England BioLabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF 제한 효소</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무료 물</td><td>New England BioLabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq 표준 완충액이 있는 2X 마스터 믹스</td><td>New England BioLabs</td><td>M0482S</td><td></td></tr><tr><td>합성 생물학에 사용되는 표준 생물학적 부품 등록부의 플라스미드</td><td>표준 생물학적 부품</td><td></td><td>http://parts.igem.org/Main_Page</td></tr><tr><td>프로모터 서열</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>Sb 프로모터: 5'-GCATGAATTCA 
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC 
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT 
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3' 
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA 
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC 
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG 
TTAGCGATCGCGTA-5'
 
Pb 프로모터 : 5'-GCATGAATTCG 
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG 
 TGTATAATCGGCAACGCG 
AGCTAGCGCAT-3' 
3'-CGTACTTAAGCAGAA 
CTGAGATATCATTGATCTCCCA 
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC 
GTA-5'
 
TNT 프로모터: 5' GCATTCTAGAT 
CAATTATTTGAACAAGGCGGTCA 
ATTCTCTTCGATTTTTTATCTCTCGT 
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT 
CGACGAAACAACGTCACTTATACA 
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT 
GAATTCGCAT3' 
3' CGTAAGATCTAGTTAA 
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA 
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT 
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC 
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA 
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA 
GCGTA5'</td></tr><tr>콜로니 PCR <td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'</td><td>에 대한 역 프라이머</td></tr><tr><td>DNA 염기서열분석을 위한 리버스 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제</td><td>뉴잉글랜드 BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr></tbody></table>

총 탄 잔류물의 추정 검출을 위한 새로운 세균 바이오 센서의 제조 및 적용

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop은 법의학 화학에서 독특한 응용을 위해 설계 된 바이오 센서입니다. MicRoboCop는 3 개의 주요 분석 물 (안티 몬, 납 및 유기 성분 GSR의)의 존재 하에서 형광 신호를 제조 함으로써 함께 사용 될 때, 총 탄 잔류물 (GSR)의 존재를 나타낼 수 있는 세 개의 장치로 구성 된 시스템 이다. 이 프로토콜은 대장균 (대장균)을 사용 하 는 바이오 센서의 합성 및 센서의 선택성 및 민감도를 평가 하는 데 사용 되는 분석 화학 방법을 설명 합니다. 시스템의 기능은 사용 된 카트리지 케이스의 내부에서 수집한 GSR을 통해 입증 됩니다. 일단 준비 되 면, 바이오 센서는 필요할 때까지 보관할 수 있으며 이러한 주요 분석 물에 대 한 테스트로 사용할 수 있습니다. 3 개의 분석 물 모두에서 긍정적 인 반응은 GSR에 대 한 추정 양성 검사를 제공 하는 반면, 각 개별 장치에는 다른 샘플의 분석 물을 검출 하는 응용 프로그램이 있습니다 (예: 식 수의 납 오염 검출기). 시스템의 주요 제한은 양성 신호에 필요한 시간입니다. 미래 작업은 응답 시간을 최적화 하기 위해 다른 유기 체를 연구 하는 것을 수반할 수 있습니다.

이 작품에 사용 된 RFP 변이체에 대 한 형광 스펙트럼은 도 2에 나타내 었 다. 이 데이터는 PbRFP 장치에서 리드 및 TNT-RFP 장치에 응답 하므로 두 개의 분석 물, 2, 4 DNT 및 1, 3 DNB에 응답 합니다. 이 수치는 음성 대조 군 (분석 물이 첨가 되지 않음)의 스펙트럼과 추가 된 두 가지 상이한 분석 물 레벨에서 스펙트럼을 보여줍니다. 사용 된 RFP 변이체에 대 한 최대 형광 신호는 575 nm에서 관찰 되었다 (여기 파장 500 nm). 도 3 의 데이터는 PbRFP 장치의 단일 적정 실험 (따라서 오차 막대가 포함 되지 않음)을 대표 하며, 프로토콜의 7 단계에서와 같이 적정 한다. 도 3a 는 휴대용 분 광 계 로부터 수집 된 데이터를 나타내고, 한편 도 3b 는 (동일한 세트의 용액 으로부터) fluorimeter ...

프로토콜은 총 총 잔류물의 분석을 위한 세균 바이오 센서의 세트를 합성 하 고, 형광 분 광 법을 사용 하 여 그들의 의도 된 사용을 위한 장치의 기능을 테스트 하기 위해 합성 생물학 기술을 사용 하 여 제시 된다.

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

이 프로토콜은 총성 잔류물의 화학 성분을 감지하도록 설계된 독특한 바이오 센서의 준비 및 분석을 설명합니다. 법의학 응용 분야에 바이오 센서를 사용하는 것은 독특합니다. 일반적으로 법의학 실험실에서 사용되는 고도로 전문화된 계측에 대한 대안을 사용하기 간편하고 사용하기 간편합니다.설명된 합성 생물학 방법은 표준 합성 생물학 부분을 사용하는 모든 시스템에 사용될 수 있습니다. 설명된 화학 분석은 적색 형광 단백질을 표현하는 모든 바이오 센서에 적용됩니다. 절차를 시연하는 것은 롱우드 대학의 학부 생인 안드레아 솔스와 엘 리차드슨이 될 것입니다.이 절차를 시작하려면 이전에 격리 된 J10060 플라스미드 DNA의 10 마이크로 리터를 미세 원심 분리기 튜브에 추가하십시오. 8개의 마이크로리터의 물과 에코리와 NHEL 효소 각각의 마이크로리터 1개를 완충제 1마이크로리터와 미리 혼합합니다. 프로모터 DNA의 경우, 신선한 미세 원심 분리기 튜브에 아닐 프로모터 DNA 서열10마이크로리터를 추가합니다.8개의 마이크로리터의 물과 에코리와 NHEL 효소 각각의 마이크로리터 1개를 완충제 1마이크로리터와 미리 혼합합니다. 10 마이크로리터로 설정된 파이펫을 사용하여 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫하여 혼합합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 효소를 섭씨 80도에서 5분간 가열하고 활성화합니다. 소화된 DNA를 냉동실에 보관하여 준비될 때까지 보관합니다. 먼저, 이전에 소화된 플라스미드 및 프로모터 DNA를 사용하여 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 바와 같이 얼음에 미세트리퍼지 튜브에 반응을 설정합니다.T4 DNA 리구아제 마지막을 추가해야 합니다. 파이펫을 위아래로 부드럽게 위아래로 작용하고 원심분리기를 짧게 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양하세요.그런 다음 10 분 동안 65도에서 가열하고 활성화하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 변환을 수행합니다. 먼저 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 PCR에 대한 반응 혼합물을 설정합니다.부드럽게 위아래로 파이펫하여 반응을 혼합합니다. 노란색 파이펫 팁을 사용하여 변형된 대장균의 식민지를 긁어냅니다. 이 대장균을 분리한 새로운 LB-암피실린 한고 판에 스 와이프한 다음 PCR 튜브에 파이펫 팁을 삽입합니다.파이펫 팁을 흔들어 E.Coli와 PCR 믹스를 혼합합니다. 추가 식민지에 대한이 과정을 세 번 더 반복합니다. 그런 다음 PCR 튜브를 PCR 기계에 로드하고 텍스트 프로토콜의 표 3에 설명된 대로 써모사이클링을 시작합니다.텍스트 프로토콜의 표 4에 설명된 대로 적절한 수의 멸균 배양 튜브에 레이블을 지정합니다. 각 튜브에 준비된 배양 국물의 2밀리리터를 추가합니다. 테이블 4에 설명된 대로 튜브에 애니라이트 스톡 솔루션을 추가합니다.그런 다음 배양 튜브에 스냅 캡을 배치하여 튜브로 공기가 유입될 수 있도록 느슨해지도록 합니다. 각 배양 튜브를 소용돌이. 그 후, 튜브를 섭씨 37도, RPM 220에서 24시간 이상 흔들리는 인큐베이터에 넣습니다.먼저, 손가락을 포함하여 손의 모든 표면을 닦아 리드를 제거하기 위해 설계된 에탄올 기반 의 닦기를 사용합니다. 분석할 때까지 적절하게 레이블이 부착된 밀봉 가능한 가방에 물티슈를 보관합니다. 시험할 큰 표면을 닦아 알코올 기반 닦아.에탄올로 적신 면 스왑을 사용하여 테스트할 작은 표면을 닦아냅니다. 깨끗한 장갑을 착용하고 알코올로 청소 한 가위를 사용하여 닦아 중심에서 약 1 평방 센티미터인 부분을 잘라냅니다. 그런 다음, 절단된 물살 또는 면봉을 센서 박테리아의 2밀리리터를 포함하는 배양 튜브에 직접 넣고 국물에 완전히 침수되도록 한다.분광계를 준비하여 RFP 변종에 적합한 파장에서 형광 성출물을 수집하며, 500나노미터의 난동을 갖는다. 그런 다음 소용돌이 믹서를 사용하여 튜브를 흔들어 줍니다. 각 상체를 소량의 큐벳으로 조심스럽게 옮기고 배출 강도를 수집합니다.소용돌이 믹서를 사용하여 튜브를 흔들어주세요. 국물의 200 마이크로리터를 우물판에 잘 옮기다. 이 플레이트의 각 우물에 어떤 샘플이 들어갔는지 기록합니다.RFP 변종에 적합한 파장에서 방출 강도를 수집하기 위해 밀가루계를 설정합니다. 대표적인 RFP 변종에 대한 형광 스펙트럼은 추가된 두 개의 다른 수준의 음수 제어와 스펙트럼을 모두 나타낸다. 이 작업에 사용되는 RFP 변이체에 대한 최대 형광 신호는 575 나노미터에서 관찰된다.대표적인 데이터는 휴대용 분광계와 불소계 모두에서 동일한 솔루션 집합에 대해 수집됩니다. 음광의 농도가 증가함에 따라 형광이 증가하는 일반적인 추세가 있다. 리드 센서의 경우 10억 개당 약 800개 이상의 고농도에서 이러한 고농도에서 납의 독성으로 인해 응답이 떨어진다는 점은 주목할 가치가 있다.지출 된 40 구경 카트리지 케이스의 내부에서 에탄올 면봉 샘플의 분석은 원리 결과의 증거를 제공합니다. 세 가지 센서 박테리아 각각의 긍정적 인 결과는 총성 잔류물에 대한 긍정적 인 테스트를 나타냅니다. 이 프로토콜에 준비된 바이오 센서는 식품, 물 또는 환경 샘플의 오염을 감지하기 위해 개별적으로 사용할 수도 있습니다.이 기술은 연구원이 다양한 화학 적 음염에 대한 표준 합성 생물학 기술을 사용하여 바이오 센서를 개발할 수있는 길을 열어줍니다. 개인 보호 장비를 착용해야 하며, 분석가들은 E.coli를 취급한 후 손을 씻고 표면을 소독해야 합니다. 폐기물은 자동화되어야 하며 중금속이 함유된 폐기물은 그에 따라 처리되어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

출처: Barber, AE, et al. 총상 잔류물의 추정 검출을 위한 새로운 박테리아 바이오센서의 준비 및 적용. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 박테리아 바이오센서를 사용하여 특정 분석물을 검출하는 방법을 보여줍니다. 분석물에 민감한 프로모터 아래에 적색 형광 단백질(RFP) 유전자가 있는 플라스미드를 운반하는 박테리아 배양물을 채취합니다. 테스트 표면을 철저히 닦은 후 물티슈의 작은 부분을 배양액에 담그고 배양합니다. 프로모터와의 분석물 상호 작용은 RFP 발현을 활성화하여 표적 분석물의 존재를 확인합니다.

박테리아 바이오센서를 사용한 표적 분석물 검출

배지에 박테리아 바이오센서 배양물을 부유시키는 것으로 시작하세요.이 조작된 박테리아는 특정 대변 대사물에 결합하면 형광 리포터 유전자와 관련된 프로모터를 활성화하는 전사 인자를 생성합니다.여기에 숙주-미생물군 상호작용에 관여하는 락테이트와 같은 대사산물을 포함한 여과된 인간 대변 샘플을 추가합니다.이 혼합물을 신선한 배지로 희석하여 최적의 반응량을 유지하세요.흔들리지 않고 인체 장내 환경을 모방하세요.대변 대사산물은 박테리아 세포로 확산되어 전사 인자에 결합합니다.이 복합체는 프로모터에 결합하여 리포터 유전자 발현과 단백질 생산을 촉진합니다.용액을 균일하게 섞어 버퍼에 희석한 후 유세포 분석법을 사용한다.박테리아 세포가 레이저를 통과할 때, 리포터 단백질에서 방출되는 형광은 특정 대변 대사산물의 존재를 확인합니다.

박테리아 바이오센서를 이용한 인간 대변 대사물 검출

출처: Zhang, M. 외, 단일 박테리아 내 중수소 통합 자극 라만 산란 영상을 통한 신속 항균 감수성 검사. J. Vis. Exp. (2022)이 영상은 자극 라만 산란 현미경을 활용해 중수소 표지된 대사 활동을 추적하여 항생제에 대한 감수성을 평가하는 방법을 시연합니다. 탄소-중수소 신호를 모니터링함으로써 내성 및 감수성 박테리아 집단을 신속히 검출할 수 있게 합니다.

자극 라만 산란 현미경을 이용한 박테리아 항생제 감수성 검출

용해성 파지 바이오 센서 및 항체 비즈 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별 할 수 있습니다. 파지는 석영 크리스탈 마이크로 센서의 표면에 랭 뮤어 - 블로 젯 방식으로 고정 넓은 범위 포도상 구균 프로브로 근무 하였다. 항체 비즈 MRSA를 인식하고 있습니다.

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

여기에서는 DIG 표지된 16S rRNA 표적 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 포매 조직 내에서 박테리아를 국소화하는 방법이 설명되었습니다. 이 프로토콜은 치주염, 암, 염증성 면역 질환과 같은 다양한 질병에서 박테리아의 역할을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

이 작품에서는, 우리는 하이브리드 β-lactamase 기술에 따라 conductimetric 바이오 센서를 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 새로운 방법을 보고 합니다. 이 메서드는 β-lactams의 가수분해 시 양성자의 출시에 의존합니다.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

여기, 선물이 커패시턴스 바이오 센서와 함께에서 각 인 분자를 사용 하 여 복잡 한 솔루션에서 검색 및 낮은 풍부한 분자의 정량화에 대 한 프로토콜.

분자 각 인을 사용 하 여 생체의 磁 검출 용량 성 바이오 센서 기반

Acinetobacter baumannii의 빠르고 정확한 검출을 촉진하기 위해 A. baumannii 감염을 식별하기 위해 LbaCas12a 엔도뉴클레아제와 함께 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a 기반 시스템을 사용한 Acinetobacter Baumannii 감염의 빠르고 특이적 검출

배우세요 합성생물학 기법을 이용한 세균 바이오센서 제작 및 총격 잔류물 검출 방법을 형사과학에 적용하는 비용 효율적인 대안 기술입니다.

총 탄 잔류물의 추정 검출을 위한 새로운 세균 바이오 센서의 제조 및 적용

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