Name: 포말리도마이드 기반 호모-PROTACs에 의한 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론의 화학적 불활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 포말리도마이드 기반 호모-PROTAC을 이용한 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론(CRBN)의 화학적 불활성화 방법입니다. 이 기술은 비소성 단백질 표적화와 비만 및 감염성 질환 치료에 활용됩니다.

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이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(에미-노에테르 프로그램 Kr-3886/2-1 및 SFB-1074-J.K.)에 의해 지원되었다. FOR2372 - M.G.)

1. PROTAC 분자의 준비
주의: 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오. 이러한 합성에 사용 되는 화학 물질의 몇 가지 독성 및 발암성. 모든 적절한 안전 관행과 개인 보호 장비를 사용하십시오.
<ol><li>테르트-부틸 N-(2,6-디옥소-3-피프리딜)카르바메이트(화합물 1)
	<ol>
<li>THF(50 mL)에서 1,1-카르보닐디미다졸(1.95 g, 12 mmol)과 촉매량 4-(디메틸아미노) 피리딘(5 mg)을 THF(50 mL)에 100 mL 의 바닥 플라스크와 함께 바락을 넣은 바락에 보크-글란-OH(2.46 g, 10 mmol)의 혼합물에 첨가한다. 명확한 용액이 형성 될 때까지 교반하면서 10 시간 동안 역류에서 가열하십시오.</li>
		<li>회전 식 증발기로 감소 된 압력하에서 용매를 제거하고 EtOAc (200 mL)를 추가하고 분리 깔때기로 옮김으로 옮니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 유기 층을 씻고 Na2SO4위에 건조시십시오.</li>
		<li>짧은 실리카 겔 패드(직경 5cm 및 높이 5cm)를 통해 용액을 걸러내고 EtOAc의 추가 부피(200 mL)로 용출합니다.</li>
		<li>용매를 증발시키고 얻어진 무색 고체를 진공에서 건조시다.</li>
	</ol></li>
	<li>테르트-부틸 N-(1-메틸-2,6-디옥소-3-피프리딜)카르바메이트(화합물 2)
	<ol>
<li>화합물 1(2.28 g, 10 mmol)을 분쇄된 탄산칼륨(2.76 g, 20 mmol)과 DMF(25 mL)를 100 mL 라운드 바닥 플라스크에 결합합니다. 주사기를 사용하여 낙하 시 요오드메탄 (1.42 g, 0.62 mL, 10 mmol)을 추가하고 플라스크에 구멍이 뚫린 고무 중격을 장착하십시오. 반응 용기를 초음파 욕조에 2 시간 동안 놓습니다.</li>
		<li>반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하고 분리 깔때기로 옮김으로 옮니다. 유기층 1N NaOH(2x 25 mL),H2 O(25 mL), 염수(25 mL)로 세척하고 Na2SO4위에 건조시다.</li>
		<li>용매를 걸러내고 증발시.. 석유 에테르 /EtOAc (2 :1)를 사용하여 실리카 젤 (6cm 열 직경 및 20cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 제품을 정화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2-(2,6-디옥소피리딘-3-yl)-4-플루오로이소인돌린-1,3-디온(화합물 3)의 제제
	<ol>
<li>3-플루오로프탈리 안수소(1.25 g, 7.5 mmol), 글루타미드 1(1.14 g, 5 mmol) 및 아세테이트 나트륨 용액(0.50 g, 6.0 mmol)을 빙하 아세트산(20 mL)에 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 콘렌드와 함께 사용한다. 혼합물을 120 °C에서 6 시간 동안 가열합니다.</li>
		<li>냉각 후, 보라색 혼합물을H2O(100 mL)에 붓고 10분 간 저어주면서 여과에 의해 형성된 고체를 수집하고, H2 O(3×5 mL) 및 석유 에테르(3×5 mL)로 세척하고 진공에서 건조시다.</li>
	</ol></li>
	<li>4-플루오로-2-(1-메틸-2,6-디옥소피리딘-3-yl)이소인돌린-1,3-디온(화합물 4)
	<ol>
<li>3-플루오로프탈리 안수소(1.25 g, 7.5 mmol), 글루타미드 2(1.21 g, 5 mmol) 및 아세테이트 나트륨 용액(0.50 g, 6.0 mmol)을 빙하 아세트산(20 mL)에 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고 콘덴트와 함께 탄압을 결합합니다. 혼합물을 120 °C에서 6 시간 동안 가열합니다.</li>
		<li>냉각 후, 보라색 혼합물을H2O(100 mL)에 붓고 10분 간 저어주면서 여과에 의해 형성된 고체를 수집하고, H2 O(3×5 mL) 및 석유 에테르(3×5 mL)로 세척하고 진공에서 건조시다.</li>
	</ol></li>
	<li>테르트-부틸N-[2-[2-][2-[2-(2--2-2-2-6-다이옥소-3-피프리딜)-1,3-다이옥소-이소인돌린-4-yl]아미노]에톡시]에톡시]에톡시]에틸]카르바메이트(화합물 7) 
	<ol>
<li>50 mL 둥근 바닥 플라스크를 터트-부틸 N-[2-[2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에틸]카르바메이트(5, 0.41 g, 1.65 mmol), 화합물 3 (0.41 g, 1.50 mmol), 건조 DMF (10 mL) 및 DIPEA (0.39 g, 0.51 mL, 3.0 mmol). 볶음 바 및 환류 응축기가 장착됩니다. 아르곤 대기하에서 90°C에서 10시간 동안 가열합니다.</li>
		<li>실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 씻고 Na2SO4, 필터를 건조시키고 진공에 농축하십시오.</li>
		<li>석유 에테르/EtOAc(1:1 ~ 1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 60cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>호모디머의 준비 (화합물 8)
	<ol>
<li>α, ω-diamine 링커 6(0.22 g, 0.22 mL, 1.50 mmol), DIPEA(1.05 mL, 6.00 mmol) 및 3(0.83 mL, 3.00 mmol)의 용액을 건조 DMSO(20 mL)에 결합하여 50 mL 의 둥근 바닥 플라스크와 함께 바플록을 재장착한 바플래드를 장착한 바플래드를 장착한 바플래드를 결합합니다. 아르곤 대기하에서 90°C에서 18시간 동안 가열합니다.</li>
		<li>실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. H2O (50 mL)와 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 씻고 Na2SO4,필터 및 진공 에 농축하십시오.
</li>
		<li>석유 에테르/EtOAc(1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 50cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정결화하였다.</li>
	</ol></li>
	<li>이종화의 준비 (화합물 9)
	<ol>
<li>화합물 7 (0.83 g, 1.65 mmol)을 건조 CH2Cl2 (10 mL)에 용해시고. 삼투오와세트산(10 mL)을 첨가하고 폐쇄된 50 mL 둥근 바닥 플라스크에서 2시간 동안 40°C에서 황색 혼합물을 저어줍니다.</li>
		<li>휘발성을 제거하고 CH2Cl2 (4x 5 mL)로 coevaporate. 잔여물을 10시간 동안 바쿠오에서 건조시고 다.</li>
		<li>건조 한 DMF (20 mL)에서 재료를 다시 용해. 화합물 4 (0.44 g, 1.50 mmol)와 DIPEA (0.78 g, 1.05 mL, 6.00 mmol)를 추가하고 플라스크에 환류 응축기장착하십시오. 아르곤 대기하에서 90°C에서 10시간 동안 가열합니다.</li>
		<li>실온으로 냉각한 후, 진한 녹색혼합물을 H2 O(100 mL)에 붓고 분리 깔때기에 EtOAc(3x 50 mL)로 추출합니다. 포화 NaHCO3 (50 mL), H2O (50 mL), 10 % KHSO4 (50 mL), H2O (50 mL), 염수 (50 mL)로 결합 된 유기 층을 세척하고 Na2SO4,필터및 농축물을 통해 건조시다.</li>
		<li>석유 에테르/EtOAc(1:2)의 그라데이션을 사용하여 실리카 겔(3cm 기둥 직경 및 50cm 높이)을 통해 컬럼 크로마토그래피에 의해 원유 제품을 정결화하였다.</li>
		<li>핵 자기 공명(NMR)에 대한 DMSO-d6에서 1HNMR 및 13CNMR 스펙트럼에 의한 분자 구조(그림5A 화합물 8, 5B 화합물 9)를해명 및 검증 분 광 계. 220-500 nm에서 다이오드 어레이 검출(DAD)을 적용하여 두 화합물의 순도가 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)을 통해 97% 이상 높은지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. PROTAC 분자의 기능적 검증
<ol><li>PROTACs에 의한 CRBN 열화의 서부 얼룩 분석 참고 : 화합물의 효과8개및 화합물9개CRBN 단백질 수준에서 서부 블롯 분석에 의해 시험되었다. 또한 IKZF1 및 IKZF3 수준에 미치는 영향도 확인할 수 있습니다(그림 6).<ol><li>
샘플 준비
		<ol>
<li>화합물 8 및 9, 레날리도마이드(Len), 포말리도마이드(Pom), MG132 및 MLN-4924를 10 mM의 농도로 DMSO에서 용해시키고, 추가 사용까지 -80°C에서 저장한다.</li>
			<li>시드 1 x 106 MM1S 세포를 2.5 mL 의 매질로 6웰 플레이트에 제거하고 24시간 동안 100 nM 또는 1 μM 화합물 8 또는 9로 세포를 치료한다.</li>
			<li>처리 후 세포를 수확하고 700 x g, 5 분, 4 °C에서 원심 분리기를 수확합니다. 차가운 1x PBS로 셀 펠릿을 씻어 남은 매체를 제거하고 원심 분리기를 700 x g, 5 분, 4 °C에서 제거하고 상류제를 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.</li>
			<li>용해 완충액의 용해 세포 (25 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 1 x 프로테아제 & 포스파타제 억제제 칵테일) 얼음에 10 분 동안, 원심 분리기에서 10 00 x g에서 10 °C. 제조자의 프로토콜에 따라 비신초닌산 단백질 분석(BCA 분석)에 의한 단백질 농도를 상수로 수확하고 결정합니다.</li>
			<li>1x LDS 로딩 버퍼 (5 % 2-메르카포에탄올)를 가진 변성 단백질 (15-30 μg / 샘플)을 10 분, 75 ° C로 끓입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS-페이지
		<ol>
<li>젤 샌드위치를 10% 분리 젤로 고정 [4 mL 3x 젤 버퍼(3M Tris/HCl, 0.3% (w/v) 나트륨 도데실 황산염 (SDS), pH 8.45), 4 mL 아크릴 아블릴아미드 30%, 2.52 mL 글리세롤 50%, 1.395 mL H2O, 75% 11% 암모늄 퍼황페이트 (APS), 및 9.75 μL TEMED] 및 4% 스태킹 젤 [1.992 mL 3x 젤 버퍼, 0.792 mL 30% 아크릴아미드, 3.168 mL H2O, 36 μL 11% APS, 및 6 μL TEMED] 전극 조립 유닛. 빗을 제거하고 음극 버퍼 (100 mM Tris / HCl, 100 mM 트리신, 0.1 % (v) SDS)로 우물을 씻어 내고 샘플을 로드하십시오.</li>
			<li>양극 버퍼 (100mM Tris / HCl, pH 8.9)를 탱크에 채웁니다. 2.1.4 단계에서 단백질 샘플을 로드하고 70 V, 20 분에서 SDS-PAGE를 실행한 다음 일정한 전압에서 115 V, 150 분.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
CRBN, IKZF1 및 IKZF3의 면역 블롯팅 및 검출
		<ol>
<li>PVDF 멤브레인(0.45 μm)을 100% 메탄올에서 1분 동안 활성화하고 1x 전사 완충액에서 겔을 분리[10x 전사 완충제(10x 전달 완충제, 25mMM 트리스 베이스/HCl, 900 mL H2O), 20% 메탄올, 0.1% SDS, pH 8.3].</li>
			<li>제조업체의 프로토콜에 따라 블로팅 카세트를 조립합니다. 90 분 동안 180 mA에서 젤을 옮김.</li>
			<li>1x TBS-T (25 mM Tris /HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6, 0.1 % 트웬 20)에서 멤브레인 3 x를 실온에서 각각 5-10 분 동안 씻으하십시오. 실온에서 5 % 무지방 건조 우유 (NFDM), TBS-T에서 막 을 1 시간 동안 차단하십시오. 실온에서 멤브레인을 1X TBS-T로 3x 5-10분 동안 세척하십시오.</li>
			<li>CRBN (5 % BSA, TBS-T에서 1 :500)에 대한 기본 항체와 인큐베이션 멤브레인을 4 °C에서 부드럽게 흔들어 밤새.</li>
			<li>실온에서 멤브레인을 1X TBS-T로 3x 5-10분 동안 세척하십시오. 항 마우스 (5 % NFDM, TBS-T에서 1 : 10.000) 또는 항 토끼 (5 % NFDM, TBS-T에서 1 : 5.000) 고추 냉기 퍼옥시다아제 HRP에 결합 된 보조 항체 (실온에서 1 시간).</li>
			<li>실온에서 멤브레인 2x를 1X TBS-T로 5-10분 동안 세척하십시오. 이 단계를 1x TBS로 두 번 반복합니다.</li>
			<li>제조업체의 프로토콜에 따라 HRP 기질 용액으로 2 분 동안 인큐베이션하고 화학 발광 검출 장치에서 화학 발광을 감지합니다.</li>
			<li>실온에서 멤브레인 1x를 1X TBS로 5-10분 동안 세척하십시오. 항체의 방출을 위해, 시판시적으로 이용 가능한 스트리핑 버퍼의 스트립 멤브레인은 실온에서 각각 5-10분 동안 1X TBS에서 멤브레인 3x를 세척한다.</li>
			<li>실온에서 1시간 동안 5% 무지방 건조 우유, TBS-T로 멤브레인을 다시 차단합니다. 실온에서 각각 5-10분 동안 1x TBS-T에서 멤브레인 3x를 세척하고 2.1.3.4단계에 따라 IKZF1, IKZF3 또는 튜불린으로 재프로브합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>MG132, MLN4942 또는 포말리도마이드와의 경쟁 실험 참고: 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 CRBN이 분해되는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 프로테아좀 억제제 MG132 및 네딜화 활성화 효소(NAE) 억제제MLN4942(그림 7)와 경쟁 실험을 수행하였다.<ol>
<li>시드 1 x 106 MM1S 셀을 6 웰 플레이트에서 잘 당. 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, 또는 레날리도마이드(100x)를 가진 프리트트 세포는 37°C, 5% CO2에서 1h 배양한다.</li>
		<li>37 °C, 5 % CO2에서 3 시간 동안100 nM 화합물 8을 추가하십시오.</li>
		<li>2.1.1 단계에 따라 웨스턴 블롯에 대한 수확 세포.</li>
	</ol></li>
	<li>다발성 골수종 세포주에서 세포 생존력 시험 참고: 이 분석실험은 세포 생존력에 미치는 영향을 시험하고 추가적으로 화합물 8을 이용한 세포의 전처리를 통해 다발성 골수종 세포에 대한 IMiDs의 효과를 적대하는 데 사용된다(도8,도 9A,B).<ol>
<li>시드 5 x 104 MM1S 세포는 생존성 분석에 대한 생물학적 삼각수에서 96 웰 플레이트에서 웰 당. 서쪽 얼룩 분석을 위해, 종자 1 x 106 MM1S 세포는 생물학적 삼중체에서 6 웰 플레이트에서 잘 당.</li>
		<li>DMSO 또는 100 nM, 1 μM, 또는 10 μM 화합물 8,화합물 9 또는 포말리도마이드및 37°C에서 96시간 동안 배양하여 37°C, 5% CO2로 세포를 치료한다. 구조 실험을 위해, 세포를 100 nM 화합물 8에서 3 시간 동안 치료하고, 1 μM 포말리도마이드를 첨가하기 전 또는 후에 96 시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>발광 세포 생존성 분석으로 96 웰 플레이트 발광을 측정, 플레이트 리더또는 서부 블롯 분석을위한 6 웰 플레이트에서 세포를 수확 하는 제조 업체의 프로토콜에 따라.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li>
<li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li>
<li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li>
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<li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li>
</ol>

저자는 잠재적 인 재정적 이해 상충을 선언하지 않습니다.

CRBN에 대해 여기에 설명된 바와 같이 이러한 호모-PROTAC의 설계는 CRBN에 대한 포말리도마이드의 특정 친화성에 의존하며, 이는 수많은 heterobifunctional PROTAC에서 성공적으로 활용되었으며 PROTAC 8의 개발을 매우 높게 초래했습니다. 선택적 CRBN 저하기. 우리의 분자의 특이성은 이미 proteomic 분석24에의해 확인되었습니다. 유전적으로 중재된 녹아웃의 경우, 부작용의 배제와 검증은 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 또한, 화학적으로 유도된 녹다운은 가역적이고, 신속하며, 광범위한 세포및 조직 유형(28)에 직접 적용가능하다.
IMiDs 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드는 다발성 골수종, B 세포 림프종 및 골수이형성 증후군의 치료에 주류가 되었습니다. IMiDs는 신기판 IKZF1, IKZF3, 또는 CK1α<s...

면역 조절 약물 (IMiDs) 탈리도마이드와 그 유사체, 레날리도마이드와 포말리도마이드, 모두 다발성 골수종의 치료를 위해 승인, E3 유비퀴틴 리가세 세레블론에 결합(CRBN), 컬린4A-RING E3 유비퀴틴 리가에 대한 기질 어댑터 (CRL4CRBN)1,2,3. IMiDs의 결합은 림프성 전사 인자 이카로스 (IKZF1) 및 아이올로스 (IKZF3)에 CRL4CRBN의 친화성을 향상시켜, 그들의 유비퀴틴화 및 저하로 이어지는 (그림1)4,5 ,5, 6개 , 7명 , 8. IKZF1 및 IKZF3는 다발성 골수종 세포에 필수적이므로 불활성화는 성장 억제를 초래합니다. SALL4는 최근 탈리도마이드9,10에의한 1950년대의 기형및 소위 Contergan 재앙에 대한 책임이 있는 CRBN의 추가적인 IMiD 유도 신기판으로서 발견되었다. 대조적으로, 카제인 키나아제 1α(CK1α)는 염색체 5q 델레이션을 가진 골수이형성 증후군에서 치료 효과에 연루되는 CRBN의 레날리도마이드특이적 기질(11)이다.
분해를 위해 특정 단백질을 표적으로 하는 작은 분자의 능력은 현대 약물 발달을 위한 흥미진진한 의미입니다. 탈리도마이드와 그 유사체의 메커니즘은 인간에서 처음 사용한 후에 발견되었지만, 소위 Proteolysis Targeting C히메라스 (PROTACs)는 특히 관심단백질(POI)을 표적으로 하도록 설계되었습니다(그림) 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs는 CRBN 또는 폰-히펠-린다우(VHL)18,19,20,E3 유비퀴틴 리가제의 리간드에 링커를 통해 연결된 POI에 대한 특정 리간드로 구성된 헤테로비기능 분자이다. 21,22. PROTACs는 일시적인 삼차 복합체의 형성을 유도하여 POI를 E3 유비퀴틴 리가제에 지시하여 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 초래합니다. 기존의 억제제에 비해 PROTACs의 주요 장점은 POI에 결합하는 것이 그것의 억제 보다는 오히려 충분하다는 것입니다 및 그러므로 PROTACs는 잠재적으로 약용으로 여겨지는 단백질을 포함하여 단백질의 훨씬 더 넓은 스펙트럼을 표적으로 할 수 있습니다 전사 인자15. 또한 키메라 분자는 촉매작용을 하므로 효능이 높습니다. POI로 유비퀴틴이 전달된 후, 삼차 복합체는 해리되고 새로운 복합체의 형성에 사용할 수 있다. 따라서, 매우 낮은 PROTAC 농도는 표적단백질(23)의분해에 충분하다.
여기서 우리는 자체(24)의 분해를 위해 CRBN을 모집하는 포말리도마이드-포말리도마이드 공액호-PROTAC(화합물 8)의합성을 설명한다. E3 유비퀴틴 리가제 CRBN은 모집자 및 대상을 동시에 제공합니다(그림 3). 데이터의 유효성을 검사하기 위해 음의 결합 제어(화합물 9)도 합성했습니다. 우리의 데이터는 새로 합성된 호모-PROTAC가 CRBN 분해에 특이적이고 다른 단백질에 최소한의 효과만 가지고 있음을 확인합니다.

<table><tbody><tr><td>1,1'-카르보닐디미다졸</td><td>TCI 화학 물질</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-(에틸디옥시)-비스(에틸아민)</td><td>시그마-알드리치</td><td>385506</td><td>화합물 6</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-플루오로프탈산 무수물, 98 %</td><td>알파 아이사르</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-디메틸아미노피리딘, 99 %</td><td>아크로스</td><td>148270250</td><td>독성</td></tr><tr><td>아크릴아미드스탐믈&오울; sung/ 비사크릴레이드(30%/0,8%)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos(D1C1E) mAB</td><td>세포 신호</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>토끼에서 생산된 항-CRBN 항체</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>항토끼 IgG HRP 결합 항체</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI 화학 물질</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, 무수, 99.8 %</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra Dry over Molecular Sieve</td></tr><tr><td>DMSO, 무수, 99.7 %</td><td>Acros</td><td>348445000</td><td>분자체</td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마 Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 (HRP 활용)</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>중단 프로테아제 & 포스파타제 억제제 일회용 칵테일 (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td><td>세포 신호</td><td>전달 14859S</td><td></td></tr><tr><td>ImmobilonP 전달 멤브레인 (0,45&micro; m)</td> <td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Iodomethane, 99 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>고독성</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot 전기 영동 전달 셀</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기 영동 셀</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>biomol (cayman)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&alpha;-Tubulin 항체 마우스 (B512)에서 생성</td> <td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>Nonfat dried milk powder</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell White 폴리스티렌 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 시료 완충액 (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>포말리도마이드</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM 웨스턴 블롯 스트리핑 완충액</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이</td>트 <td>Carl Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>칼 로스</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>tert- 부틸 N- [2- [2- (2- 아미노 에톡시) 에톡시] 에틸] 카르바 메이트</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>89761</td><td>화합물 5</td></tr><tr><td>트리신</td><td>칼 로스</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 염기</td><td>시그마 알드리치</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL 스프레이</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

포말리도마이드 기반 호모-protacs에 의한 e3 유비퀴틴 리가세 세레블론의 화학적 불활성화

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

면역 조절 약물 (IMiDs) 탈리도마이드와 그 유사체, 레날리도마이드 및 포말리도마이드, 다발성 골수종의 치료를 위한 모든 FDA 승인 약물, 림프성 전사 인자 이카로스(IKZF1) 및 아이올로스의 유비퀴틴화 및 분해를 유도 (IKZF3) 세레블론 (CRBN) E3 유비퀴틴 리가아제를 경질 분해를 경유한다. IMiDs는 최근 CRBN E3 ligase에 의한 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 위한 다른 단백질을 표적으로 하는 이중 기능성 프로테오분해 표적화 키메라(PROTACs)의 생성을 위해 활용되고 있다. 우리는 포말리도마이드 기반의 호모비기능 PROTACs를 설계 및 합성하고 CRBN의 자기 주도적 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 능력을 분석했습니다. 여기서, CRBN은 E3 유비퀴틴 리가제와 동시에 표적을 모두 작용한다. 호모-PROTAC 화합물 8은 IKZF1 및 IKZF3에 최소한의 남은 효과만 으로 높은 효능으로 CRBN을 저하시고 있습니다. 화합물 8에 의한 CRBN 불활성화는 상이한 다발성 골수종 세포주들의 세포 생존 및 증식에 영향을 미치지 않았다. 이 호모-PROTAC는 다발성 골수종 세포에서 IMiDs의 효과를 제거합니다. 따라서, 우리의 동형 포말리도마이드 계 화합물은 CRBN의 내인성 기질 및 생리기능을 확인하고 IMiDs의 분자 메커니즘을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기서 우리는 CRBN의 분해를 위한 동형 포말리도마이드 계 PROTAC의 설계, 합성 및 생물학적 평가를 기술하였다. 우리의 PROTAC는 두 개의 CRBN 분자와 동시에 상호 작용하고 포말리도마이드 유도 네오 기질 IKZF1 또는 IKZF3에 최소한의 남은 효과로 CRBN의 자가 유비퀴틴화 및 프로테아소말 분해를 유도하는 삼차 복합체를 형성합니다.
이전에 발표된 일련의 포말리도마이드 계 PROTAC 분자(24)에서, 화합물 8은 CRBN의 화학적 유도 열화에서 특히 효율적이었다. 그 합성은 다음과 같이달성될 수 있다(도 4). 1,1-카본디미다졸-보크 보호 l-글루타민의 응축은 순환화된 이미드 1로이어집니...

이 작품은 탈리도마이드 유사체의 표적인 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론(CRBN)의 유비퀴틴화 및 분해를 유도하는 새로운 접근법으로서 포말리도마이드 계, 이중 기능적 호모-PROTAC의 합성 및 특성화를 설명한다.

포말리도마이드 기반 호모-PROTACs에 의한 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론의 화학적 불활성화

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

우리의 호모디머 PROTAC는 세레블론의 첫 번째 화학 억제제이며 탈리도마이드 유사체의 분자 메커니즘을 더욱 해명하고 Cereblon의 생리적 기능을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 새로운 PROTAC 플랫폼 기술은 추적할 수 없는 것으로 간주되는 관심 있는 단백질을 특별히 타겟팅하는 데 매우 유용할 수 있습니다. CRBN 억제만으로는 항종양 활성이 없습니다.그러나 CRBN 분해제는 비만, 전염병 및 기타 장애에 임상적 영향을 미칠 수 있습니다. 합성은 도전적이고 PROTAC 화합물을 설계 할 때 효과적인 단백질 저하기를 생성하기 위해 최적의 링커와 부착물을 찾기가 어렵습니다. 우선, 2.46 그램의 Boc 보호 L-글루타민과 50 밀리리터의 테트라 하이드로푸란을 100 밀리리터 둥근 바닥 플라스크에 넣고 1 분 동안 800 rpm에서 저어줍니다.그런 다음 1.95 그램의 1, 1'carbonyldiimidazole 및 4-pyridine의 촉매 양을 추가합니다. 글루타리미드 화합물의 명확한 무색 용액을 얻기 위해 역류에서 10 시간 동안 교반을 계속합니다. 용액을 실온으로 식히고 회전 증발기로 용매를 제거하십시오.에틸 아세테이트 200밀리리터에 잔류물을 재용하여 분리 깔때기에 붓습니다. 유기 층을 50 밀리리터로 세척하고 소금물 과 소금물 각각을 씻어, 나트륨 황산나트륨 위에 유기 층을 건조. 중력은 실리카 젤을 통해 용액을 걸러 건조제를 제거한 다음 실리카 젤을 에틸 아세테이트 200밀리리터로 헹구는다.진공 하에서 여과에서 용매를 제거하여 화합물 1을 무색 고체로 얻습니다. 제품을 사용하기 전에 밤새 진공 상태에서 제품을 건조시십시오. 다음으로, 동요 바가 장착된 100밀리리터 라운드 하단 플라스크에 빙하 아세산 20밀리리터에 아세테이트 나트륨 0.50그램을 녹입니다.1.25 그램의 3-플루오로프탈릭 무수드라이드와 글루타리미드 1.14 그램을 넣고 6시간 동안 역류에서 저어 화합물 3의 보라색 용액을 얻습니다. 혼합물을 실온으로 식힌 다음 100 밀리리터의 탈온화 물에 붓고 10분 동안 저어 화합물 3을 침전시합니다. 여과로 고체를 수집하고 물과 석유 에테르로 세척하고 진공 상태에서 2 일 동안 건조하십시오.다음으로, 화합물 3의 0.83 그램과 건조 디메틸 설프리산화물 20 밀리리터를 50 밀리리터 슐렌크 플라스크에 넣고 2 분 동안 저어줍니다. 알파 오메가 디아민 링커 화합물 6의 0.22 그램, 그리고 1.05 N의 밀리리터를 추가, N-diisopropylethylamine의 1.05 밀리리터와 어두운 녹색 혼합물에서 Homodimer 8을 얻기 위해 18 시간 동안 90 섭씨에서 아르곤 에서 혼합물을 저어. 혼합물을 실온으로 식히고 100 밀리리터의 탈온화 된 물에 붓습니다.에틸 아세테이트의 3개 50밀리리터 부분으로 제품을 추출하고, 유기 층을 결합하고, 물과 소금물 각각 50밀리리터로 세척합니다. 세척된 유기층을 황산나트륨 위에 건조시키고, 건조제를 걸기하고, 진공 상태에서 용매를 제거합니다. 잔류물을 최소한의 크로마토그래피 용매로 재해석하고 실리카 겔 컬럼에 적용하여 정제합니다.형광 제품 분획을 수집하고 결합한 다음 용매를 제거하여 호모이머 8을 노란색 고체로 가져옵니다. 시작하려면 100 밀리리터 라운드 하단 플라스크에 디메틸포르마미드 25 밀리리터에 2.28 그램의 글루타리미드 1을 녹입니다. 이 용액에서 2.76 그램의 분쇄 된 탄산 칼륨을 일시 중단하십시오.그런 다음, 20 게이지 바늘이 장착 된 주사기에 요오메탄의 0.62 밀리리터를 그립니다. 10초 동안 요오도메탄 드롭 와이즈를 추가합니다. 고무 중격으로 플라스크를 멈추고 통풍구 바늘을 추가합니다.글루타리미드 화합물 2를 얻기 위해 실온에서 2 시간 동안 혼합물을 초음파 처리합니다. 에틸 아세테이트 50 밀리리터로 혼합물을 희석하고 분리 깔때기에 붓습니다. 플라스크를 깔때기에 헹구고 또 다른 50밀리리터의 에틸 아세테이트를 넣습니다.제품을 작업하고 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피로 정화하여 글루타리미드 2를 무색 고체로 얻습니다. 글루타리마이드 화합물의 보존 시간을 비교1 과 2 N-메틸화가 성공했다는 것을 확인합니다. 유효성 검사를 시작하려면 다발성 골수종 세포를 관심 있는 화합물로 치료하십시오.관련 단백질을 분리하고 단백질 분해의 웨스턴 블롯 분석을 위한 샘플을 준비합니다. 그런 다음, SDS-PAGE용 젤 샌드위치를 준비하고 양극 버퍼 탱크를 pH 8.9 tris-HCl 용액으로 채웁니다. 단백질 샘플을 젤에 적재하고 70 볼트에서 20분 동안 실행한 다음 115볼트를 150분 동안 실행합니다.다음으로, 면역 형필로팅을 위해 1x 이송 버퍼를 준비하고 조심스럽게 젤을 카세트에서 전달 버퍼로 이동하여 평형화합니다. 매우 빠르게 파열되고 구겨질 수 있기 때문에 평형을 위해 카세트에서 젤을 제거 할 때 매우 조심해야합니다. 0.45 마이크로미터 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인을 순수 메탄올에 20초 이상 담그고 활성화한 다음 1x 이송 버퍼에 담급다.젤과 멤브레인이 10분 동안 평형화하게 하십시오. 그런 다음, 웨스턴 블로팅 카세트를 조립하고 90 분 동안 180 밀리암퍼를 적용하여 단백질을 막으로 옮킵니다. 그 후 면역 염색을 통해 단백질을 시각화합니다.세포 생존가능성에 미치는 영향을 평가하기 위해 먼저, 종자 50, 000다발성 골수종 세포는 생물학적 삼중판에서 96개의 웰 플레이트당 잘 한다. DMSO를 함유하는 100마이크로리터, 또는 화합물 8, 화합물 9 또는 포말리도마이드의 0.1, 1 또는 10 마이크로몰어를 각각 잘 첨가한다. 세포 생존성 구조 실험을 수행하기 위해 포말리도마이드의 1마이크로몰러 용액을 추가하기 전또는 후에 3시간 동안 화합물 8의 100 나노몰러 용액으로 세포를 치료하십시오.5%의 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도에서 24, 48 또는 96시간 동안 세포를 배양하고 발광 분석으로 세포 생존가능성을 측정합니다. 상동성 PROTAC 8의 구조는 양성자 및 탄소 NMR로 확인되었다. 이종구형 PROTAC 9는 글루타리미드 부분 내의 N-메틸화로 인해 세레블론 또는 CRBN, 결합 기능의 손실을 초래하기 때문에 부정적인 대조군으로서 합성되었다.호모 PROTAC 8은 림프전사 인자 IKZF1 및 IKZF3에 최소한의 효과로 완전한 프로테오소말 CRBN 분해에 가까운 유도. 대조적으로, hetero PROTAC 9는 포말리도마이드와 유사한 행동을 보였다. 화합물 8 유도 CRBN 분해는 프로테좀의 직접 억제제에 의해 차단될 수 있거나, 또는 네틸화 억제에 의해 간접적으로 차단될 수 있다.화합물 8로 미리 처리된 세포는 IKZF1 및 IKZF3에 포말리도마이드의 효과에 크게 저항하였다. 화합물 8 유도 CRBN 분해는 화합물 9 및 포말리도마이드로부터 IKZF1 및 IKZF3 분해보다 96시간 후 다발성 골수종 세포 생존가능성에 훨씬 적은 영향을 미쳤다. 화합물 8로 미리 처리된 다발성 골수종 세포는 처리되지 않은 세포 보다는 pomalidomide에 드러릴 때 현저하게 더 중대한 생존성을 가졌습니다, 화합물 8면역변색IMiD 약물 저항을 모방하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 건의하.우리는 화합물 8 세레블론의 완전한 proteasomal 저하를 유도 발견, IKZF1 및 IKZF3 세포 생존및 증식에 부작용이 없습니다. 프로젝트 기술을 다른 대상으로 확장하는 것은 암 및 기타 질병과 관련된 단백질을 비활성화하고 추적할 가능성이 있습니다. 다른 약물과 단백질에 대 한이 기술을 적응 하는 경우, 하나는 신중 하 게 최적의 링커와 첨부 파일을 선택 하는 약물 및 단백질 대상의 분자 구조를 조사 해야.IMIDs는 세레블론의 포인트 돌연변이 때문에 마우스에서 작동하지 않습니다, 그러나 추가 동물 연구 결과를 위해 사용될 수 있는 형질 전환 노크 마우스 모형이 존재합니다. 포말리도마이드는 매우 테라토제닉인 아날로그 탈리도마이드이기 때문에, 우리는 이 약으로 일하는 임산부를 추천하지 않습니다.

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

유사 분열을 겪고있는 암 세포에있는 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 이미징 실시간으로 기록되었다. PJ-34 근절 인간의 유방암 MDA-MB-231 세포의 유사 분열에 여분의 중심체를 숨겨 세포. 정상 이중 초점 유사 분열과는 달리, 여분 중심체는 PJ-34의 존재에있는 두 개의 스핀들 극에 클러스터되지 않았습니다.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

환경 약품 및 중간체 공유 DNA를 생성 하는 bioactivated adducts 효소 수 약물의 효능을 평가 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 메서드는 양식에 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 기술 뿐만 아니라 DNA adducts 복합 활성화에 대 한 설명 합니다.

형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

이 프로토콜은 표적 단백질에 융합된 항체가 없는 내인성 단백질 검출 태그를 발현하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 조작된 살아있는 세포에서 단백질 분해 역학의 정량적 발광 검출을 설명합니다. 정량적 분해 파라미터, 속도, Dmax, DC 50 및 Dmax50을 계산하고 얻기 위한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

HiBiT CRISPR 세포주를 사용한 표적 단백질 분해 화합물의 고처리량 세포 프로파일링

여기에서는 이전에 합성 된 스피로 사이클릭 옥심을 테스트하기 위해 3- (4', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하는 생물학적 분석에 대해 설명합니다.

기능화된 스피로사이클릭 헤테로사이클 합성 및 세포독성 분석

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

이 논문은 CRISPR/Cas9 시스템과 세 가지 표현형 기반 스크리닝 전략을 사용하여 중심체 관련 단백질-E(CENP-E) 녹아웃 세포의 구축을 보고합니다. 당사는 CENP-E 녹아웃 세포주를 활용하여 약물 개발 및 생물학 연구에 유용한 CENP-E 억제제의 특이성과 독성을 검증하기 위한 새로운 접근법을 확립했습니다.

CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout 세포주 생성

여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.  본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

우리는 2 차원 (2D) 전구체의 패턴과 재구성 입자의 합성 실험 내용을 설명합니다. 이 방법론은 polyhedra과 마이크로에서 센티미터 규모에 이르기까지 다양한 길이의 비늘에서 붙잡는 장치를 포함하여 모양의 다양한 입자를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

종이 접기 고취 패턴 및 재구성 입자의 자기 조립

배우세요 포말리도마이드 기반 호모-PROTAC을 이용한 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론(CRBN)의 화학적 불활성화 방법입니다. 이 기술은 비소성 단백질 표적화와 비만 및 감염성 질환 치료에 활용됩니다.

포말리도마이드 기반 호모-PROTACs에 의한 E3 유비퀴틴 리가세 세레블론의 화학적 불활성화

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