Name: 일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 일축 인장 스트레인을 적용한 살아있는 세포의 고해상도 핵 역학 이미징 방법을. 100배 오일 이머전션 렌즈를 활용해 세포 반응을 정밀 분석하고 기계적 스트레스에 대한 세포 생물학 연구를 심화할 수 있습니다.

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모든 저자는 연구 및 기술 (스마트) 바이오 시스템 및 마이크로 역학 연구 그룹에 대 한 싱가포르-MIT 얼라이언스를 통해 싱가포르 국립 연구 재단의 자금 지원을 기꺼이 인정 합니다. 저자, 야기 엘 스 카 박사와 반 블 릿 박사는 또한 Saks-카바 나 프 재단의 기금과 지원을 감사 하 게 인정 합니다. 저자는이 작품에 설명 된 몇 가지 실험에 대 한 쥐 oligodendrocyte 전구 세포를 제공 하기 위해, 싱가포르 난 양 기술 대학교에서 윌리엄 Ong 박사 노래 Yian 씹는 감사 합니다, 저자는 박사 g. v. Shivashankar 감사 원자력 지역 변동에 대 한 논의에 대 한 싱가포르, 싱가포르의 국립 대학, 기계 생물학 연구소.

1. 고해상도 이미징을 위한 단일 웰 실록 금형 설계
참고: 실록 플레이트 제조용 몰드는 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 이미징을 가능 하 게 하 고 맞춤 제작 변형 장치 (그림 1a, B)에 정확 하 게 맞도록 다음과 같은 기능으로 설계 되었습니다.
<ol><li>스트레인 장치의 클램프에 맞도록 전체 플레이트 치수를 유지 합니다. 참고: 여기에는 60 mm x 73 mm입니다.</li>
	<li>적용 된 스트레인 동안 실록 plate의 고정 되지 않은 모서리에서 발생 하는 아크 (평면 외 굽 힘) 효과를 방지 하기 위해 전체 판의 측면 치수 보다 훨씬 작은 셀 컴파트먼트를 만드십시오. 참고: 여기에서 컴파트먼트는 23mm x 23mm 정사각형으로 설계 되었습니다.</li>
	<li>칸의 상단에 배치 된 커버 글래스를 통해 100 배 오일 침 지 렌즈에 초점을 맞추기 위해, 가능한 한 최소한 (80 µm)의 세포 구획의 깊이를 유지 하 되, 매체를 포함 하 고 접촉을 피하기 위해 충분히 충분 하 게 세포를 압박.</li>
	<li>쉽게 초점을 가능 하 게 하기 위해 거꾸로 현미경 설정에서 렌즈에 가까이 세포를가지고, 3mm의 높이로 사각형에 셀 컴파트먼트를 올립니다. 주: 위의 기능을 가진 금형은 예를 들어, 밀링 알루미늄을 포함 하 여 많은 기술에 의해 제조 될 수 있다. 양자 택일로, 마스터 몰드는 또한 레이저 절단기로 절단 아크릴 시트를 사용 하 여 조립 될 수 있다, 셀 구획에 대 한 커버 유리 #0, 슈퍼 접착제. 이 마스터 몰드는 주조 수 지를 사용 하 여 작업 금형을 만드는 데 사용 되는 실록 인쇄물을 만드는 데 사용 됩니다.</li>
</ol>2. 싱글 웰 실록 플레이트 및 스퀘어 컴파트먼트 제작
<ol><li>실록 베이스와 경화제를 일회용 컵에 20:1의 비율로 섞어 줍니다. 실록 플레이트 1 개를 만들기 위해 몰드 당 실록의 총 20g을 계량 하 고 150 mm 직경 플라스틱 접시 당 실록의 150 g (정사각형 수납칸 1 개를 만들기 위한).</li>
	<li>30 분 (또는 모든 기포가 제거 될 때까지)에 0.8 bar의 진공 탈 기에서 실록 믹스를 남겨 주세요.</li>
	<li>실록 믹스를 몰드 (플레이트 용) 또는 150 mm 플라스틱 접시에 붓 습니다 (정사각형 격실 용).</li>
	<li>이 단계에서 추가 기포를 제거 하거나 (입으로) 공기를 불어 실록-0.8 바 진공에서 30 분 동안 다시 충전 된 몰드/접시를 탈 기 합니다.</li>
	<li>2 시간 동안 레벨 링 테이블에 80 ° c 오븐에 금형/요리를 남겨 주세요.</li>
	<li>조심 스럽게 오븐에서 몰드/접시를 제거 하 고 그들을 실 온으로 냉각 하자. 조심 스럽게 칼 날 (그림 1c)으로 가장자리를 절단 한 후 경화 된 실록를 벗 겨 냅니다.</li>
	<li>150 mm 직경 실록에는 마커로 2cm x 2cm 그리드를 그립니다. 각 사각형 안에 1cm x 1cm의 정사각형을 그려 모든 면에 0.5의 여백을 남겨 둡니다. 블레이드를 사용 하 여 조심 스럽게 라인을 따라 절단 하 여 정사각형 구획을 얻습니다 (그림 2a).</li>
	<li>4 시간 동안 아세톤 100%, 4 시간 동안 100% 에탄올을 배양 하 여 실록 플레이트/사각 구획을 청소 하 고 4 시간 동안 물에 멸 균을가 하였다.</li>
	<li>150 mm 직경 플라스틱 접시 안에 파라핀 필름 백 페이퍼 (파라핀 필름을 제외한 종이)에 플레이트/스퀘어 컴파트먼트를 놓습니다 (그림 2c).</li>
	<li>실록 플레이트를 80 ° c 오븐에 두고 4 시간 동안 건조 시킵니다.</li>
	<li>실록 접시와 컨테이너 사각형을 포함 하는 150 mm 직경의 접시를 파라핀 필름과 밀봉 하 고, 추후 사용할 때까지 냉장 실에 보관 하십시오.</li>
</ol>3. 실록 플레이트의 기능화
<ol><li>파라핀 필름을 제거 하 고, 플라스틱 접시의 커버를 제거 하 고, 실록 플레이트와 사각 구획을 자외선 아래에 30 분간 두십시오.</li>
	<li>플라즈마 처리 (150에서 5 분 동안) 실록 플레이트 (셀 함이 위를 향하게 함)를 정사각형 구획이 없이 하 여 배양 표면을 친수성으로 만듭니다.</li>
	<li>즉시 플라즈마 처리 된 표면 (그림 2b)에 사각형 구획을 배치 하 고 일시적으로 둘을 함께 막대기를 눌러. 참고: 플라즈마-사각형 구획을 처리 하지 마십시오, 또는 그렇지 않으면 그들은 실록 접시에 강하게 충실 하 고 이미징 하는 동안 벗 겨 해야 할 때 쉽게 떨어져 오지 않을 것 이다.</li>
	<li>200 µ L의 100 Mm(3 아미노 프로필) triethoxysilane을 첨가 하 여 실록 표면에 2 그룹을 소개 합니다 . 100 mM 용액을 만들려면 µ triethoxysilane의 순수한 (3 아미노 프로필)의 물 10ml를 녹여 서 234. 2 시간 배양 후, 우물 3 배를 탈 이온 수로 씻으십시오.</li>
	<li>분자 가교 링커 bissulfosuccinimidyl의 2mg을 분 비 하 고 1M(4에틸) µ 술 폰 산 완충 액 (pH 8.0) 및 2.8 mL의 물 700에 용 해 시킨다. 참고: 200 (에틸) 4-1 piperazineethane 술 폰 산 완충 액에 1mm bissulfosuccinimidyl suberate 용액을 제공 합니다. 50 mM 농도 버퍼도 잘 작동 합니다.<ol>
<li>이 용액의 135 µ L을 추가 하 고 실 온에서 4 시간 동안 각각의 실록 플레이트에 fibronectin의 15µ L을 첨가 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인산 완충 식 염 액으로 3 배 씻으십시오. 잘에 인산 완충 식 염 수 용액 500 µ L을 추가 합니다. 실록가 포함 된 150 mm 직경의 접시를 파라핀 필름과 함께 사용 하 여 냉장 실에 보관 하십시오.</li>
</ol>4. 플라스틱 접시와 플라스 크의 기능화
<ol><li>폴 리 D-라이 신 (PDL, 멸 균 물)의 5 µ 용액으로 플라스틱 접시와 플라스 크를 1 시간 동안 배양 합니다. 35 mm 지름 접시 당 3ml(60 mm 지름 접시 당 3 mL, 75 cm 1 개당 10ml 당 1.5의이 용액 (리간드)을 첨가 합니다.</li>
	<li>접시와 플라스 크 2 배를 멸 균 수로 씻으십시오.</li>
	<li>그들을 1 시간 동안 (또는 건조 될 때까지) 생물학적 안전 캐비닛에서 건조 하 고 더 사용할 때까지 4 ° c에서 냉장 실에 보관 하십시오.</li>
</ol>5. 뮤 린 oligodendrocyte 전구 세포에 대 한 증식 및 분화 배지
<ol><li>증식 및 분화 매체의 50 mL의 100 배 용액을 준비 하 고 2.5 mL의 분 취를 만들고-80 ° c에서 보관 하십시오. 참고: 증식 배지의 조성은 0.1 소 혈 청 알 부 민, 62 ng/mL 프로 게 스 테 론, µ µ/ml의 인슐린, 50 µ g/ml 홀로 트랜스 페 린, 5ng/m l-streptomycin, 10ng/ml의 혈소판 유래 성장 인자, 그리고 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 Dulbecco의 수정 된 독수리의 중간 (DMEM) 높은 포도 당과 피 루브 산은. 소 혈 청 알 부 민, 프로 게 스 테 론, 푸 트 레 시 네 및 나트륨 셀 렌 라이트는 구성 되 고 100 배, 인슐린, 홀로 트랜스 페 린 및 streptomycin에서 저장 될 수 있지만, 1x 용액을 준비 하면서 신선 하 게 첨가 되어야 한다. 성장 인자는 10 µ g/mL로 구성 되어야 하며 매일 세포에 신선 하 게 첨가 해야 합니다 (1 µ의 배지). 상기 분화 배지의 조성은 0.1 소 혈 청 알 부 민, 62 ng/mL의 프로 게 스 테 론, µ 50 µ µ, 5nml/ml 홀로 페 린, 5ng/ml의 셀 렌 티 오 나이트, 1 개 페니실린 streptomycin, 400 ng/ml 트리 요오드 티로 네, 400 ng/ml L-티 록 신 및 0.5%의 태아 소 혈 청 DMEM 높은 글루코스 및 피 루브 산은. 트리 요오드 티로 닌과 L-티 록 신을 다른 시 약과 함께 구성 하 고 100 배까지 보관할 수 있습니다. 1x 솔루션을 준비 하는 동안 인슐린, 홀로 트랜스 페 린 및 페니실린 streptomycin을 새로 추가 해야 합니다.</li>
	<li>100 배 증식 배지 50 mL를 제조 하기 위해, dulbecco의 배지 17ml에 소 혈 청 알 부 민과 310 µ g의 프로 게 스 테 론 510 mg을 µ의 배지, 500 µ L의 Dulbecco의 µ에 있는 퓌 레 시 네의 80 mg, 10µ L의 Dulbecco의 배지 , 전체 DMEM 최대 50 mL</li>
	<li>분화 배지의 100 배 용액 50 mL를 준비 하는 경우, 수산화 나트륨의 40 µ의 트리 요오드 티로 닌 2 mg을 추가로 용 해 하 고, 수산화 나트륨의 40 µ l의 L-티 록 신 2 mg을 사용 하 여이 용액을 Dulbecco의 배지를 가진 50 mL에 채워 준다. 멸 균 일회용 필터 유닛을 통해 용액을 걸러 내 고, 분 취 액을-80 ° c에 저장 한다.</li>
	<li>1 배 증식/분화 배지의 250 ml를 준비 하는 경우, 홀로 트랜스 페 125 린의 12.5 mg을 가진 증식/분화 배지의 100 배 용액, µ의 10mg/ml 인슐린 및 100 배 페니실린 streptomycin의 2.5 ml를 2.5 섞어 줍니다. Dulbecco의 매체와 250 mL에 용액을 채우고 멸 균 일회용 필터 유닛을 통해 필터링 합니다. 참고: 성장 인자는 재구성 된 배지의 전체 배치가 아닌 신선 하 고 직접 세포 배양에 추가 되어야 합니다.</li>
</ol>6. 세포 배양
<ol><li>Oligodendrocyte 전구 세포가 증식 배지에 부유 하는 것으로 시작 한다. PDL이 코팅 된 플라스틱 표면 (접시 또는 플라스 크)에 35000 셀/cm2 의 밀도로이 셀을 시드하십시오 (섹션 4 참조). 플라스틱 층의 표면적의 10cm 당 3 mL에 증식 매체의 부피를 조절; 매체의 낮은 양은 표면 장력에서 생기는 세포 덩어리를 초래할 수 있고, 접시에 있는 매체의 높은 양은 액체 유출을 일으키는 원인이 될 수 있습니다.</li>
	<li>성장 인자 (혈소판 유래 성장 인자 및 fibronectin 성장 인자)를 추가 하 여 매일 10 ng/mL에서 농도를 유지 하 고 대체 일에 증식 배지의 반을 변경 합니다.</li>
	<li>셋째 날에는 부드러운 세포 분리 용액 (예: accutase)을 사용 하 여 플라스틱 표면에서 세포를 분리 합니다. 배지를 제거 하 고 인산 완충 식 염 액으로 1x를 씻고, 20cm2 영역 당 분리 용액 1 mL를 넣고 접시/플라스 크를 남겨 주세요. 10 분 동안 37 ° c에서 인큐베이터에서, 모든 세포가 분리 될 때까지 부드럽게 누릅니다 (현미경을 보면).</li>
	<li>피 펫은 200 µ L 팁을 사용 하 여 덩어리를 단일 세포로 분해 하 고,이를 50 mL 튜브에 전달 하 고,이를 10 분 동안 0.2 x g 로 희석 하 고, 상층 액을 버리고, 1 mL의 총 부피를 만들기 위해 증식 배지에서의 펠 렛을 소생 시킨다. 세포 측정기를 사용 하 여 셀 수를 셉니다.</li>
	<li>Fibronectin-기능화 실록 플레이트를 세척 하 고, 세척 당 15 분간, 증식 배지를 사용 합니다.</li>
	<li>실록 플레이트 당 종자 35000 세포를 700 µ L의 증식 배지.</li>
	<li>그린 형광 단백질을 이용한 히스톤 H2B 라벨링을 위한 H2B-GFP의 플라스 미드 구조를 추가 합니다. 참고: 여기에서, 1.4 µ L의 셀 라이트 H2B-GFP BacMam2 형질 주입 믹스는 각 플레이트 (5만 세포 당 2 µ L)에 첨가 되었다.</li>
	<li>24 시간 후에는 실록 샘플을 일축 변형 장치 ( 그림 2d와 같이)에 늘일 수 있는 셀로 마운트합니다. 모든 샘플의 배지를 분화 배지로 변경 합니다.</li>
	<li>샘플을 변형 하 여 스트레인이 없는 셀 구획 길이 (그림 3a)를 측정 하 고 스테이지 마이크로미터 나사를 돌려서 셀 구획 길이를 원하는 양 (예: 10%)으로 늘립니다 ( 그림 3b참조). 이미징 할 때까지 37 ° c에서 인큐베이터의 연신 및 미 뻗어 실록 샘플을 남겨 주세요.</li>
</ol>7. 이미징
<ol><li>현미경을 켜십시오. 현미경 인큐베이터 온도를 37 ° c로 설정 합니다.</li>
	<li>목표 포 탑이 나중에 접근 할 수 없기 때문에 사용 되는 목표 (100 배 기름 침수)를 중앙 위치에 가져온다. 목표를 풀고 목표 링 (그림 4a)과 함께 다시 나사로 고정 하 여 목표를 셀에 더 가깝게 만들 수 있습니다. 여기에서 오일 목표를 사용 하는 경우이 단계에서 오일 방울을 추가 하십시오.</li>
	<li>3D 프린팅 이나 기계 가공을 통해 미리 합성 하 여 두 가지 중요 한 기능을 가진 플라스틱 또는 금속 홀더-각 진 창과 단계 (그림 4b). 주:이 창은 변형 장치가 반전 상태인 동안 매체를 보관할 두께 #0 유리 커버 슬립을 지원 합니다. 창 모서리 (그림 4d)의 각 진 컷은 목표를 유리 커버 슬립에 더 가깝게 할 수 있습니다. 홀더의 단계는 우리가 목표에 가까운 더 아래로 뻗어 실록을 가져올 수 있습니다.</li>
	<li>창 주변부에 진공 그리스를 분배 하 여 홀더 상단 표면에 유리 커버 슬립 (두께 #0, 25mm x 25mm 또는 직경 35)을 놓고 현미경 단계에 플라스틱 창을 테이프로 부착 합니다. ( 도 4D 및 도 5a)를 참조 한다.</li>
	<li>Z-평행 이동 스테이지를 현미경 스테이지에 돌려서 맨 위 z위치로 옮깁니다 (그림 5a).</li>
	<li>이미지를 촬영 하 고 흰색 플라스틱 창에 유리 커버 슬립에이 매체를 추가 하는 뻗어 실록 플레이트에서 매체의 500 µ L을 제거 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 실록 플레이트에서 사각 구획을 멸 균 핀셋으로 분리 하십시오.</li>
	<li>스트레인 장치를 흰색 플라스틱 창 위쪽에 있는 수직 위치 (위로 향하게 하는 셀)에 잡고 유리 커버 슬립 (그림 5b)의 중간에 직접 여분의 매체가 떨어질 수 있도록 스트레인 장치를 조심 스럽게 뒤집습니다.</li>
	<li>스트레인 디바이스의 하단 부분을 양면 테이프로 z평행 이동 스테이지에 배치 합니다 (그림 5c, D).</li>
	<li>명시 야 아래에 접 안 렌즈를 통해 보면서, 천천히 (그림 5e) ( z-번역 단계를 낮춤 으로써) 스트레인 장치를가지고 셀에 초점을 목표를 이동 합니다.<ol>
<li>이 단계를 단계적으로 매우 느리게 수행 합니다. 스트레인 장치가 커버 슬립에 너무 많이 누르면 셀이 압축 되어 (죽을 수 있음) 목표는 커버 슬립에 너무 많이 누르면 커버 슬립이 파손 되어 (매체가 누출 되 고 목표에 유출 될 수 있음).</li>
	</ol>
</li>
	<li>실록 플레이트를 x및 y방향으로 스캔 하 여 형광 핵 (파장 여기에 488 nm의 형광 아래)과 적절 한 세포 형태학을 가진 세포를 찾으십시오 (명시 야에서).</li>
	<li>현미경 단계의 횡 방향 변위가 너무 많은 수직 초점에 영향을 미치지 않으면 소프트웨어의 다중 포인트 기능을 사용 하 여 여러 관심 영역을 선택 합니다. 때로는 초점이 스테이지의 횡 변위에 매우 민감합니다. 이러한 경우 한 번에 하나의 셀을 이미지 합니다. 관심 있는 각 셀의 x, y및 z위치를 표시 합니다.</li>
	<li>488 nm의 파장 여기를 가진 핵의 와이드 필드 (또는 오픈 핀 홀) 이미지를 기록 하 고 프레임 당 30 초 간격으로 명시 야가 있는 셀을 사용 하 여 전체 지속 시간을 30 분 이상으로 기록할 수도 있습니다.</li>
</ol>8. 데이터 분석
<ol><li>
핵 변동
	<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어에서 핵 이미지의 시퀀스를 열고 (그림 6a) 핵 시간 경과 이미지를 임계 값 (예를 들어, Imagej에서 임계 명령을 사용 하거나 소프트웨어 MATLAB에서 그레이 트로 쉬 명령).</li>
		<li>시간 함수로 서 핵 영역 (픽셀)을 가져와 서 데이터 플로팅 소프트웨어 (그림 6b)에 플로팅하 고 3 차 다항식을 데이터에 피팅 합니다 (예를 들어, 분석 사용 하기 | 피팅 | 원점에 있는 다항식 맞춤 명령 또는 소프트웨어 MATLAB의 polyfit 명령).</li>
		<li>각 시점에 대 한 실제 영역 (픽셀)에서 피팅 된 다항식의 값을 뺍니다. 이 수정 된 영역을 잔여 영역 이라고 합니다. 참고:이 프로세스는 악기 오류에서 오는 데이터의 증가 또는 감소 추세를 제거 하 고 디 추세 라고 합니다.<ol>
<li>각 시간 지점의 잔여 영역을 해당 시점에서 피팅 된 다항식의 값으로 나누어 잔여 면적의 백분율을 계산 합니다 (그림 6d).</li>
		</ol>
</li>
		<li>잔여 면적 시계열의 표준 편차를 계산 합니다. 이 표준 편차는 핵 변동의 진폭을 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
데이터 플로팅 및 통계 분석
	<ol>
<li>조건 당 최소 20 개의 핵의 평균으로 핵 변동의 진폭을 계산 합니다.</li>
		<li>Bonferroni 니 수정으로 단방향 분석 분산 통계 테스트를 수행 하 여 변동의 진폭에 중요 한 차이가 있는지 여부 (예: 스트레인이 적용 되는 경우와 포함 되지 않음)를 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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장치는 이전에 부착 세포에 세포 외 인장 긴장의 응용 프로그램을 위해 설계 되었습니다. 그 일에 있는 실록 하 층의 디자인은 생화학 분석을 위해 충분 했습니다, 기지개 한 세포의 저해상도 화상 진 찰 뿐 아니라. 이 작품에서, 하 층은 재설계 되었고, 고해상도의 세포 성 살아있는 세포 이미징을 용이 하 게 하는 새로운 이미징 구성이 도입 되었다. 이 시스템의 장점은 여러 가지가 있습니다: 간단한 구성 요소를 사용 하 여 실험실에 내장 할 수 있으며 상업용 변형 장치 (셀 변형 장치 당 500 USD)에 비해 저렴 하며 조직 배양 인큐베이터 내부에 들어갈 만큼 작습니다. 현미경. 더욱이, 상기 이미징 시스템은 도립 현미경 설정으로 여기에 설명 되었지만, 직 립 현미경 구성을 위해 용이 하 게 조절 될 수 있다.
샘플 준비 및 이미징에 관련 된 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째로, 실록 격판덮개와 사각 격실은 세포 생존을 지키기 위하...

바디에 있는 세포 그리고 조직은 장력 긴장을 포함 하 여 각종 기계적인 단서를 복종 됩니다. 그러나, 신경 세포의 생물학에 대 한 이러한 단서의 효과 아직 광범위 하 게 공부 하 고 완전히 이해 하지. 중추 신 경계에서 기계적 변형의 원인으로는발달 성장1,2,3,4, 척수 벤딩, 혈액 및 뇌 척 수액과 같은 생리 학적 과정이 포함 됩니다. 맥 동 및 외상, 축 삭 부 종, 신경 교 흉터 또는 종양 성장5,6,8과 같은 병리학 적 상태. 인장 변형이 oligodendrocytes의 분화와 축 삭의 후속 초 화에 영향을 미치는 방법을 조사 하는 것이 가치가 있다,이는 척추 동물 중추 신 경계에서 중요 한 과정 이다. 사용자 정의 설계 된 스트레인 디바이스와 엘라 스토 머 멀티 웰 플레이트를 사용 하 여, 이전 작품9,10 은 정적 일축 변형이 유전자 발현 의 글로벌 변화를 통해 oligodendrocyte 분화를 증가 시킬 수 있음을 보여주었다 10.이 세포에서 스트레인 기계 전달의 메커니즘에 대 한 이해를 돕기 위해, 이전 실험 장치는 여기에 기술 된 바와 같이 재설계 되어야 하며, 생활에서의 핵 역학의 고해상도 형광 이미징을 가능 하 게 합니다. 셀을 변형 합니다. 구체적으로는 단일 웰 실록 플레이트가 개발 되 고 이미징 구성이 재설계 되어 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 균 주 하에서 라이브 셀의 타임 랩 스 이미징이 가능 하도록 설계 되었습니다. 빛 통로에서 실록의 부정적인 광학적 효과를 없애기 위해, 세포는 실록 판을 거치지 않고, 거꾸로 위치 하 고, 커버 글래스를 통해 세포 구획을 덮는 것을 이미지화 한다. 이 새로운 이미징 디자인을 사용 하 여, 수백 개의 고해상도 타임 랩 스 영화가 기록 됩니다, 여기서 염색 질은 녹색 형광 단백질에 히스톤 H2B 태그에 의해 표시 되는, 온전한 부착 세포 내에서 개별 세포 핵. 이러한 영화는 인장 변형이 oligodendrocyte 분화의 진행과 일치 하는 크로마 틴 구조 및 역학의 변화를 유도 한다는 것을 증명 한다.
적용 된 스트레인 하에서의 살아있는 세포 화상 진 찰은 기술적으로 도전적이 고 현미경 시스템과 호환이 되는 장치 디자인이 필요 합니다. 여기에 설명 된 사용자 정의 디자인은 상업용 솔루션에 대 한 저렴 한 대안을 제시 합니다. 그것의 차원은 적용 한 긴장 도중 높은 공간 해결책에 있는 현미경 단계 및 살아있는 세포 화상 진 찰에 그것의 설치를 가능 하 게 합니다. 이미징 설정은 이미지 품질을 저하 시키는 실록 plate의 레이어를 거치지 않고 커버 글래스를 통해 가장 높은 선명도를 가진 100 배 오일 침 지 렌즈를 사용 하 여 라이브 셀 이미징이 가능 하도록 설계 되었으며 대부분의 경우 이미징 설정을 변형 합니다. 장치는 세포를 포함 하는 거치 된 격판덮개로, 또한 인큐베이터에서 쉽게 저장 될 수 있습니다. 이 장치는 부착 세포 배양을 용이 하 게 하 고 여러 날에 걸쳐 안정적이 고 균일 한 변형을 유지 하는 서브 지층에 일축 변형을 적용 하도록 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 설정은 균 주 하에서 다양 한 부착 세포 유형의 고해상도 이미징에 사용 될 수 있다, 그것은 세포 기계 생물학의 많은 분야에서 기계 전달 연구에 적용.

<table><tbody><tr><td>Primary cells</td><td></td><td></td><td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells from Neonatal Rats에서 분리된 는 Nanyang Technological University의 Dr. S. Y. Chew's 실험실에서 제공되었습니다</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM high&nbsp; glucose</td><td>Gibco</td><td>11996-065-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070-063-100ml</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Prospec</td><td>CYT-608-50ug</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Prospec</td><td>CYT-776-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Media 재고 components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418-10G</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783-1G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780-5G</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 셀레나이트</td><td>시그마</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>트리 요오드티로닌</td><td>시그마</td><td>T6397-100MG</td><td></td></tr><tr><td>티록신</td><td>시그마</td><td>T1775-100MG</td><td></td></tr><tr><td>홀로트랜스페린</td><td>시그마</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>금형 및 PDMS 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS - 다우 코닝 실가드 184</td><td>엘스 워스</td><td>184 SIL ELAST 키트 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>금형 - 액체 플라스틱</td><td>스무스 온</td><td>스무스 캐스트 310 - 트레일 크기</td><td></td></tr><tr><td>기판 코팅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리 -D- 라이신</td><td>시그마</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마</td><td>F1141-2MG</td><td></td></tr> < <tr><td>강>히스톤 염색 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td><td>분자 프로브</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>표면 기능화</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>A3648-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BS3</td><td>Covachem</td><td>13306-100mg</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼 pH 8.0</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63578-AK-250ml</td><td></td></tr><tr><td> 세포 박리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501-100ml</td><td></td></tr></tbody></table>

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

세포 외 기계적 변형은 세포 표현 형 반응을 유도 하는 것으로 알려져 있으며, 여러 조직 시스템에서 생리 적 관련성을 갖는다. 생 화 확 적인 분석을 통해 시험관 내 세포 집단에 적용 된 세포 외 인장 균 주의 효과를 포착 하기 위해, 장치는 이전에 간단 하 게 제작 될 수 있고 조직 배양 인큐베이터 내부에 들어갈 정도로 작아 설계 되었으며, 뿐만 아니라 상단에 현미경 단계. 그러나, 실록 하 층의 이전 디자인은 기름 침수 목표를 통해 고 분해능 세포 화상 진 찰을 허용 하지 않았습니다. 이 작업은 실록 하위 계층의 재설계 된 형상과 함께 적용 된 스트레인 하에서 라이브 셀의 고해상도 세포 이미징을 용이 하 게 할 수 있는 사용자 정의 이미징 설정을 설명 합니다. 이 하위 계층은 동일한 이전에 설계 된 장치와 함께 사용할 수 있으며, 따라서 고해상도 광학 이미징을 허용 하는 것 외에도 위에 나열 된 것과 동일한 이점이 있습니다. 실록 하 층의 설계는 스트레인의 적용 전후에 동일한 셀을 추적 하는 것을 용이 하 게 하는 그리드를 통합 함으로써 개선 될 수 있다. 대표적인 결과는 여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 포착 된 변형 된 세포 내에서 형광 표지 된 핵의 고해상도 타임 랩 스 이미징을 보여줍니다. 이러한 핵 역학 데이터는 적용 된 인장 변형이 oligodendrocyte 전구 세포의 분화를 촉진 하는 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다.

최근의 작업은 oligodendrocytes에서 인장 변형의 영향을 조사 하기 위한 것으로, 10% 일축 인장 변형이 유전자 발현의 전 세계적 변화에 의해 oligodendrocyte 전구 세포의 분화를 촉진 한다는 것을 보여주었다. 유전자 발현에서 이러한 변화 뒤에 메커니즘은 세포 골격 구조, 전사 인자 국 소화, 핵 역학 및 염색 질 조직과 같은 세포 성 파라미터의 이미징을 통해 프로브 할 수 있습니다. 그러나 실록 하위 계층의 이전 형상은 고해상도 단일 셀 이미징을 허용 하지 않았습니다. 이 작품에서 설명한 바와 같이, 실록 하 층의 재설계 된 형상과 이미징 셋업이 셀과 대물 렌즈 사이의 거리를 최소화 했습니다. 이를 통해 100 배 오일 침 지 목적을 사용 하 여 형광 표지 된 세포 핵의 타임 랩 스 이미지를 캡처할 수 있습니다 (그림 6a).
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이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

우리는 이전에 부착 셀에 기계적 변형을 적용하는 장치를 설계했습니다. 현재 작업에서, 우리는 하위 층의 형상을 재 설계하고 이러한 변형 세포의 고해상도 이미징을위한 설정을 사용자 정의했다. 이 세포 스트레칭 시스템의 주요 장점은 스트레인 세포의 100x에서 고해상도 세포 전도 영상을 제공한다는 것입니다.하위 지제작을 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조수 인 비키가 될 것입니다. 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 단일 웰 폴리디메틸실록산 몰드를 디자인합니다. 다음으로 폴리디메틸실록산 베이스의 20개 부분을 일회용 컵에 하나의 부품 경화제와 혼합합니다.혼합되면 폴리디메틸실록산 믹스를 진공 드 가스솔에 0.8 bar에 30분간 놓아 거품을 섞어 제거합니다. 그런 다음 폴리디메틸실록산 믹스를 금형과 접시에 붓습니다. 이 단계에서 0.8 bar 진공 상태에서 30분 동안 다시 가스를 제거하여 추가 거품을 제거합니다.탈가스가 완료되면 수평 테이블에 섭씨 80도에서 샘플을 2시간 동안 굽습니다. 다음으로, 조심스럽게 오븐에서 샘플을 제거하고 실온으로 냉각할 수 있습니다. 블레이드로 가장자리를 자르고 경화 된 폴리디메틸실록산을 부드럽게 벗깁니다.직경 150mm의 폴리디메틸실록산에서 마커로 2센티미터 그리드를 그립니다. 각 사각형 내에서 1센티미터를 1센티미터 로 끌어올아 모든 면에서 0.5cm의 마진을 남깁니다. 블레이드를 사용하여 라인을 따라 조심스럽게 자르고 사각형 구획을 얻습니다.다음으로, 4시간 동안 100% 아세톤, 100% 에탄올을 4시간 동안 배양한 다음 4시간 동안 오토클레이브 워터로 샘플을 청소합니다. 청소된 샘플을 150mm 직경의 플라스틱 접시 안에 파라핀 필름 백킹 페이퍼에 놓고 샘플을 섭씨 80도 오븐에서 4시간 동안 건조시로 만듭니다. 완료되면 파라핀 필름으로 요리를 밀봉하고 추가 사용이 있을 때까지 차가운 방에 보관하십시오.전구 세포를 준비하고 증식 배지에서 중단하십시오. 이 세포를 35, 평방 센티미터당 000 개의 세포로 PDL 코팅 플라스틱 표면에 시드하십시오. 증식 배지의 부피를 표면적 의 10센티미터 제곱당 3밀리리터로 조정합니다.매체의 양이 적을수록 표면 장력력으로 인해 세포 가동이 발생할 수 있으며, 접시에 있는 미디어의 양이 많을수록 미디어가 유출될 수 있습니다. 파종 후 셋째 날에는 세포를 수확하고 혈류계를 사용하여 계산합니다. 이어서, 종자 35, 000 세포당 폴리디메틸실록산 플레이트당 700 마이크로리터의 증식 배지.다음으로 제조업체의 지시에 따라 세포의 히스톤 H2B 복합체에 녹색 형광 단백질을 라벨링하는 플라스믹 구조를 추가합니다. 24시간 후, 단산소 균주 장치에 뻗어질 세포를 가진 폴리디메틸실록산 샘플을 장착한다. 그런 다음 모든 샘플에서 배지를 분화 매체로 변경합니다.훈련되지 않은 셀 컴파트먼트 길이를 측정하고 스테이지 마이크로미터 나사를 돌려 원하는 양의 균주에 의해 셀 컴파트먼트 길이를 늘립니다. 화상 진찰까지 37섭씨에서 인큐베이터에 뻗어 있고 뻗지 않은 폴리디메틸실록산 샘플을 둡니다. 인큐베이터 온도를 섭씨 37도로 설정하여 라이브 이미징을 위한 현미경 인큐베이터를 준비합니다.다음으로, 목표 턴릿에 접근할 수 없기 때문에 100배 오일 침지 목표를 중앙 위치에 가져옵니다. 일단 위치에 있으면 목표를 풀고 객관적인 링과 함께 다시 나사를 짜서 목표를 세포에 더 가까이 가져올 수 있습니다. 그런 다음 목표에 오일 한 방울을 추가합니다.맞춤형 인쇄 홀더를 사용하여 창 주변에 진공 그리스로 홀더를 코팅하고 홀더의 상단 표면에 숫자 0 두께 유리 커버슬립을 놓습니다. 플라스틱 창을 현미경 단계에 테이프로 테이프로 두습니다. 다음으로, Z 번역 스테이지를 현미경 스테이지에 나사로 배치하고 가장 많은 Z 위치로 이동합니다.이미지화할 확장된 폴리디메틸실록산 플레이트에서 배지 500마이크로리터를 제거하고 흰색 플라스틱 창의 유리 커버슬립에 이 매체를 추가합니다. 그런 다음 멸균 핀셋 한 쌍을 사용하여 폴리디메틸실록산 플레이트에서 사각형 구획을 조심스럽게 분리합니다. 스트레인 장치를 똑바로 세워 서 세포가 위쪽을 향하고 있고, 흰색 플라스틱 창 위에 조심스럽게 변형 장치를 반전시키도록 하여, 세포가 아래로 향하는 유리 커버슬립의 중간에 직접 떨어뜨리도록 한다.스트레인 장치의 하단 부분을 양면 테이프를 사용하여 Z 번역 단계에 배치하여 제자리에 고정합니다. 밝은 필드 아래 접피스를 통해 보는 동안, 매우 천천히 변형 장치를 아래로 가져와 세포에 초점을 목표를 이동합니다. Z 번역 단계의 하강과 목표 의 제기 사이에 번갈아 이 초점 단계를 천천히 수행합니다.Z 번역 단계가 너무 많이 낮아지면 세포가 압축되어 죽을 수 있습니다. 목표를 너무 높게 올리면 유리 커버슬립을 깨고 매체가 누출될 수 있습니다. 488 나노미터 흥분에서 에필플로클레스엔션을 사용하여 형광 핵을 가지고 있는 세포를 찾기 위해 X 및 Y 방향으로 폴리디메틸실록산 플레이트를 스캔한다.또한 밝은 필드 아래 샘플을 볼 때 세포에 적절한 형태가 있는지 확인하십시오. 488나노미터의 파장 여기를 가진 핵의 광시야 또는 개방핀홀 이미지를 기록하고, 프레임당 30초 간격으로 30초 간격으로 밝은 필드 흥분을 가진 세포의 총 지속 시간 30분. 폴리디메틸실록산 의 형상과 이 비디오에 표시된 이미징 설정은 세포와 목표 사이의 거리를 최소화합니다.이를 통해 100x 오일 침지 목표를 사용하여 형광으로 표지된 세포 핵의 시간 경과 이미징을 가능하게 합니다. 핵 변동을 측정하려면 먼저 핵 지역을 시간 대비 플롯합니다. 그런 다음, 제 3 차 다항형을 사용하여 데이터를 해독한다.그리고 마지막으로 잔류 변동을 플롯하고 잔류 변동의 표준 편차를 계산합니다. 올리고덴드로시테 전구세포의 핵 변동은 10%인장 균주 유무에 관계없이 분화의 화학적 유도에 따라 화학적 인장균만으로는 48시간 만에 핵 변동이 크게 감소한 것으로 나타났지만 24시간은 아닌 24시간 동안은 그렇지 않다. 한편, 화학유도는 10%인장 균주와 함께 24시간 에서 현저한 감소를 보였으며, 이는 48시간 에서 추가 감소 없이 일정하게 유지되었습니다.기억해야 할 가장 중요한 것은 선택한 목표의 작업 거리가 셀 컴파트먼트의 깊이와 커버슬립의 두께보다 같거나 클 수 있다는 것입니다. 데이터 세트의 전후 유형이 실험 오류로 인한 소음을 감소시키기 때문에 하위 계층은 변형을 적용하기 전과 후에 동일한 셀을 이미징할 수 있는 그리드를 통합하도록 재설계될 수 있습니다. 이 이미징 설정을 사용하여, 세포 성분의 단백질 국소화 또는 역학과 같은 부착 된 살아있는 세포 내의 많은 세포 전현상은 기계적 변형을 적용 한 몇 초 이내에 이미지화 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 글로벌 또는 지역화된 스트레인 응용 프로그램에 대한 응답으로 하나의 살아있는 자기편 세포에서 유도된 핵 및 cytoskeletal deformations을 측정하기 위해 두 개의 독립적인, 현미경 기반의 도구를 제시한다. 이러한 기술은 핵 강성 (즉, deformability)을 확인하고 핵과 cytoskeleton 세포 사이에 강제로 전송을 탐사하는 데 사용됩니다.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

골격 근육 분화 특히 핵 위치에 의존 하는 매우 역동적인 과정 이다. 여기, 우리가 myoblast 차별화 및 myotube 형성 동안 라이브 셀 이미징에 의해 핵 움직임을 추적 하 고 자동 추적에서 정보를 추출 하 여 핵 역학의 정량적 특성 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

악용 Myoblast 분화와 융합 하는 동안 트랙 핵에 라이브 영상

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

여기에 제출된 것은 손상되지 않은 조직에서 초해상도 라이브 세포 이미징을 위한 프로토콜입니다. 우리는 그것의 네이티브 조직 환경에 있는 높게 민감한 성인 줄기 세포 인구를 화상 진찰을 위한 조건을 표준화했습니다. 이 기술은 살아있는 조직에서 생물학적 현상의 직접적인 관찰을 허용하는 시간적 및 공간 해상도의 균형을 포함한다.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

여기에서는 공압식으로 작동되고 고해상도 현미경 검사와 호환되는 다목적 등축 스트레칭 장치를 제시합니다.

고배율 Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy를 위한 Equibiaxial Stretching Device

여기서는 등방성 및 단축 변형 파형을 세포에 적용하면서 조절 가능한 강성과 맞춤형 단백질 매트릭스를 가진 기질에서 배양을 지원하는 새로운 장치를 소개합니다. 이 간단하고 경제적인 플랫폼 덕분에 연구자들은 기초 연구와 질병 관련 맥락에서 기계적 단서가 세포 기능을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다.

시험 관 내 세포 신장 및 영상 촬영을 위한 새로운 플랫폼

이 과정은 공초점 현미경과 형광 표지된 핵 및 염색질 마커 라인을 결합하여 애 기장대 뿌리의 핵과 염색질 역학을 동시에 기록하고, 발달 및 환경 신호에 반응하여 이러한 역학 변화를 조사  합니다.

애기장대 뿌리의 핵 형태와 염색질 역학의 정량적 생세포 영상화 및 발달 및 환경 스트레스 중

학습하세요 일축 인장 스트레인을 적용한 살아있는 세포의 고해상도 핵 역학 이미징 방법을. 100배 오일 이머전션 렌즈를 활용해 세포 반응을 정밀 분석하고 기계적 스트레스에 대한 세포 생물학 연구를 심화할 수 있습니다.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

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