Name: Integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 학습하세요 DNA 기반 통합 긴장 센서(ITS)를 이용해 피코뉴턴 감도로 인테그린 긴장을 측정하고 형광 현미경으로 세포 힘을 실시간 이미징하는 방법을. 이 기술은 세포 생물학 및 생물물리학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 아이오와 주립 대학 그리고에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 (R35GM128747) 제공 시작 기금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC, 8-16-8333-나) 아이오와 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 통합 긴장 센서의 합성
<ol><li>사용자 지정 하 고 ssDNAs ( 테이블의 자료를 참조)을 주문. 참고: ssDNA 시퀀스는 다음과 같습니다. 위 물가 /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. 낮은 물가 다음과 같습니다. 12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 / 23 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT//5Cy3/CCC 33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC 43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC 54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC 여기에서, /5ThioMC6-D / 5' 끝에 thiol 한정자 C6 S S (이황화)를 나타냅니다. /3BHQ_2/ 블랙 홀을 끄는 2 3' 끝을 나타냅니다. / 3Bio /, 5Biosg /, 및 /iBiodT/는 각각 biotinylation 끝에 3', 5' 끝, 그리고 내부 DNA의 thymine. /iCy3/ 삽입 ssDNA의 내부 백본 Cy3을 나타냅니다. 이러한 코드는 여기에 사용 된 특정 상업적인 공급자에 의해 사용 되 고 다른 DNA 회사에서 다를 수 있습니다.</li>
	<li>SH ssDNA 끄는에 RGD 펩타이드 켤레 참고: 사용 하는 시 약은 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), sulfosuccinimidyl-(N maleimidomethyl) cyclohexane-1-카복실산 (sulfo SMCC), RGD 펩타이드, 및 트리 스-4 (2-carboxyethyl) phosphine 염 산 염로 알려진 또한 TCEP HCl.<ol>
<li>TCEP 솔루션을 사용 하 여 위쪽 가닥 DNA에 thiol 한정자 deprotect 참고: 상용 소스 로부터 주문 Thiol 수정 DNAs RGD DNA 활용 전에 줄일 필요 이황화 결합에 의해 보호 유황 원자와 산화 형태로 제공 됩니다. TCEP은 thiol deprotection 사용 하는 무 취 감소 시 약 이다.<ol>
<li>물 300 µ L에서 14.3 mg TCEP HCl의 분해. PH 테스트 종이 사용 하 여 ~7.2–7.4 1m NaOH 솔루션 (약 150 µ L), TCEP 솔루션의 pH를 조정 합니다. 순수한 물 0.5 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다. 최종 TCEP 농도 100 m m 이다입니다. 참고:이 좋습니다 있도록 TCEP 솔루션 신선한 DNA thiol deprotection에 대 한 모든 시간. 오랜 동안 TCEP 솔루션을 구입 하지 마십시오.</li>
			<li>TCEP 솔루션에 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션의 100 µ L 및 물 400 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>PBS에서 1 m m thiol-DNA-BHQ2의 20 µ L를 TCEP + EDTA 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 동안 반응 솔루션을 보자. 참고: 5' thiol 한정자 C6 S S 활용이이 ssDNA에서의 이황화 결합은 TCEP, 다음 단계에서 thiol 그룹 maleimide와 반응에 대 한 준비를 떠나 여 죽 습 될 것입니다. TCEP는 다음 thiol maleimide 반응; 방해 하지 않는 따라서,이 단계 후 TCEP passivate 필요는 없습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>어원이 RGD-NH2 sulfo SMCC.<ol>
<li>RGD-NH2 11 m m RGD-NH2를 PBS의 100 µ L에 5 mg을 디졸브.</li>
			<li>2mg sulfo SMCC (업체가 premeasured)와 튜브를 순수한 물 200 µ L를 추가 합니다. 피 펫 팁 sulfo SMCC 고체를 분쇄 하 고 적극적으로 물에서 SMCC 해산 촉진을 동시에 플라스틱. Sulfo SMCC 농도 23 m m 일 것 이다. 참고: 지금까지 sulfo SMCC에 NHS 에스테 르가 수 분해는 몇 분의 일생은 때문에는이 용 해 단계 NHS 에스테 르 가수분해 때문의 과도 한 손실을 방지 하기 위해 1 분 이내 완료 되어야 한다. 순수한 물을 사용 하 여 PBS 또는 다른 버퍼에 있는 그것의 가용성은 가난 때문에 sulfo SMCC 해산.</li>
			<li>100 µ L RGD-NH2 솔루션 sulfo SMCC 솔루션의 40 µ L을 추가 하 고 20 분 동안 품 어. 참고: sulfo SMCC에 NHS 에스테 르는 반응 RGD-NH2, 아민 그룹 아 미드 유대 형성 RGD와 sulfo SMCC 연결 되.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SH-ssDNA-끄는와 RGD SMCC 켤레.<ol>
<li>1.2.1 및 1.2.2 단계에서 준비 하는 솔루션을 혼합 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 품 어. 4 ° C에서 냉장고 설정으로 솔루션을 이동 하 고 하룻밤 더 반응 하자. 위쪽 가닥 DNA에 활용 된 thiol sulfo SMCC, RGD 위쪽 가닥 DNA와 연결 하는 thioether 그룹을 형성에 maleimide와 반응 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>에탄올 강수량 unreacted sulfo SMCC, RGD, 및 TCEP RGD ssDNA 끄는 정화를 수행 합니다.<ol>
<li>적어도 30 분 동안-20 ° C 냉동 실에 15 mL 원뿔 튜브에 100% 에탄올 10 mL을 진정.</li>
			<li>3 M NaCl 솔루션, DNA 솔루션 및 볼륨 비율 1시 10분: 25의 냉된 에탄올 혼합. 혼합된 액체는-20 ° C 냉동 고 30 분 또는 때까지 DNA를 침전 하십시오.</li>
			<li>30 분에 대 한 10000 x g 에 액체 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
			<li>DNA 펠 릿에 PBS를 추가 합니다. DNA 농도 분석기를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(선택 사항) DNA 전기 이동 법 높은 RGD ssDNA 순도 얻기 위해 수행 합니다. 참고: 위의 프로토콜, 약 70%-90%는 ssDNA의 RGD로 활용 될 것입니다. 높은 순도 바란다면 DNA 전기 이동 법은 결합형된 DNA에서 활용 된 DNA를 분리 하도 수행할 수 있습니다.<ol>
<li>수직 전기 시스템을 조립.</li>
			<li>순수한 물, 40% 아크릴 아 미드 젤, 트리 스-borate-EDTA (TBE) 버퍼 x 10의 8 mL 및 10% 염화 persulfate (AP)의 800 µ L의 20 mL 50 mL를 혼합 하 여 10 %polyacrylamide 젤 솔루션을 준비 합니다.</li>
			<li>젤 솔루션 tetramethylethylenediamine (TEMED)의 80 µ L를 추가 합니다. 전기 시스템의 유리 챔버에 솔루션을 붓는 다. 젤 위에 잘 만들려고 단일 잘 빗을 삽입 합니다. 젤은 가교 화까지 10 분 기다립니다.</li>
			<li>DNA 솔루션 볼륨의 비율은 1: 1에서 100% 글리세롤과 혼합. 빗을 제거 하 고 잘 젤을 DNA 솔루션을 로드 합니다.</li>
			<li>200 V. 관찰 두 DNA 밴드는 한 지체는 활용 된 DNA의 전압에서 젤을 실행 합니다.</li>
			<li>활용 된 DNA와 젤 밴드를 잘라 하 고 작은 조각으로 그것을 주사위.</li>
			<li>필터와 2 개의 1.5 mL 원심 분리기 관에 있는 절단된 젤을 수집 합니다. 각 튜브를 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>1 일 PBS 배어 젤 실내 온도에 어두운 장소에 넣어. DNA는 PBS에 젤 조각에서 무마 합니다.</li>
			<li>DNA 솔루션 centrifuging 1000 x g 2 분에 관 하 여 수집 합니다.</li>
			<li>DNA 수집을 에탄올 강수량 (1.2.4 단계)의 또 다른 라운드를 수행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>RGD ssDNA 끄 및 염료 ssDNA biotin을 교배 시키기 의해 ITS를 음성 합성.<ol>
<li>위 물가 및 1.1:1의 어 금 니 비율에서 낮은 물가 DNAs의 솔루션을 믹스. ITS DNA 교 잡에 의해 생산 하룻밤 4 ° C에서 혼합물을 유지. 참고: DNA 교 잡에 대 한 1.1:1의 어 금 니 비율 1:1 대신 사용 됩니다. 과도 한 RGD ssDNA 끄는 모든 염료 ssDNA biotin RGD ssDNA 끄는와 교배 하는 것을 확인 하는 데 사용 됩니다. RGD-ssDNA-끄는 교 잡 없이 표면 코팅, 그것의 표면 코팅 품질에는 영향을 주지 것입니다 동안 씻어 될 것입니다.</li>
		<li>약 수 고가 긴 기간 저장을 위해-20 ° C에서 ITS 솔루션. 참고: 저장소 버퍼 PBS 이며 저장 농도 일반적으로 10 μ M 이상 이어야 합니다. 일반 사용에 대 한 자사의 솔루션 현저한 품질 저하 없이 몇 주 동안 4 ° C에서 저장 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 유리 바닥 접시에 ITS immobilizing 그것의 표면 준비
참고: 사용 하는 시 약은 biotinylated 소 혈 청 알 부 민 (BSA-비오 틴), avidin 단백질, 및 그것의. 모든 시 약 및 약 0 ℃ 얼음 물통 얼음에 PBS 버퍼를 진정.
<ol><li>0.1 mg/mL의 BSA biotin PBS에 유리 바닥 페 트리 접시 (직경 14 m 잘 29 m m)의 우물에 200 µ L을 로드 합니다. 냉장고에서 4 ° C에서 30 분 동안 그것을 품 어. BSA-비오 틴은 물리적으로 유리 표면에 흡착 됩니다.</li>
	<li>잘 씻어 표면에 다시 PBS의 200 µ L를 추가 및 잘 사용 하는 피 펫에서 솔루션에 밖으로 빨 아. 이 3 배 세척을 완료 반복 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 30 분 동안 잘에서 50 µ g/mL avidin 단백질의 200 µ L을 품 어 그것을 씻어 PBS 가진 3 배. 이 단계 후 avidin 단백질 BSA biotin에 한다 유리 표면에 움직일 수 된다.</li>
	<li>0.1 µ M에 4 ° c.에 30 분 동안 잘 ITS의 200 µ L을 품 어 PBS 가진 3 배와 접시 세척. 셀 도금까지 우물에 PBS를 둡니다. 이 단계 후 biotin 태그는 avidin 단백질에 한다 표면에 움직일 수 된다. 참고: 코팅 품질과 그것의 동원 정지 기간 동안 동질성에 대 한 중요 한 경고 페 트리 접시 표면 건조를 주지 않을 것입니다. 4 ° C 또는 세척 단계 동안 물 증발 속도 줄이기 위해 얼음 양동이 도움이 됩니다 얼음에 약 0 ° C에서 모든 시 약 및 PBS를 유지 때 PBS 그려집니다 밖으로 우물에서.</li>
</ol>3. 세포의 표면에 도금
<ol><li>문화 물고기 keratocytes입니다. 참고: 여기, 금붕어 (떡 auratus) 예를 들어, 사용 됩니다 하지만 다른 어 종 또한 작동 수 있습니다.<ol>
<li>플랫 팁 트위터와 물고기에서 물고기 규모의 작품을 뽑 다. 부드럽게 유리 문의 규모의 안쪽으로 유리 바닥 페 트리 접시의 우물에는 규모를 누릅니다. ~ 30까지 기다리는 잘 접시의 유리 표면에 물고기 규모에 대 한 s.</li>
		<li>Iscove의의 1 mL 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM) 완전 한 매체 물고기 규모를 완벽 하 게 커버를 추가 합니다. 실내 온도에 6-48 h에 대 한 어둡고 습 한 상자에 페 트리 접시를 유지. 참고: IMDM 완전 한 매체 79 %IMDM + 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) + 1% 페니실린을 포함 되어 있습니다. 산소 또는 CO2 의 추가 공급이 필요 합니다. 몇 휴지 롤 물으로 젖 었 상자에 높은 습도 유지 하기 위해 상자에 남아 있을 수 있습니다. 물고기 keratocytes 몇 시간 후 셀의 시트 물고기 규모에서 마이그레이션됩니다. 이 조직 배양 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 세포는 일반적으로 48 h에 가능한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분리 하 고 그것의 표면에 keratocytes 셀 접시.<ol>
<li>물고기 규모 배양은 배양 접시에서 매체를 제거 합니다. 잘 1 x 셀 솔루션, 분리 세척 하 고 물고기 규모를 커버 하 고 3 분 동안 품 어 파견 솔루션 추가. 참고: EDTA 솔루션을 분리 하는 셀에 대 한 제조 법은 다음과 같습니다: 10 x 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) + 1 M HEPES (pH 7.6)의 10 mL 100 mL + 7.5% 나트륨 중 탄산염의 + 500 mM EDTA + 1 L H2o.의 2.4 mL 10 mL PH는 7.4에 조정 됩니다.</li>
		<li>IMDM 완전 한 매체 추가 및 솔루션을 분리 하는 모든 셀에 밖으로 빨 아. 부드러운 pipetting으로 keratocytes를 분산. 원하는 수준 (1 x 104-1 x 105/mL) 셀 솔루션 밀도 조정 합니다. (섹션 2에 따라 준비) 그것의 표면에 세포 격판덮개 세포 이미징 하기 전에 30 분 동안 실 온에서 품 어. 참고: 셀 계산 할 수 있습니다 한 hemocytometer와 솔루션을 분리 된 세포를 분리 한 후. 밀도 도금 하는 세포는 상대적으로 낮은 keratocytes 마이그레이션할 표면적의 많음이 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>판 조 K1 세포와 NIH 3T3 세포의 표면에. 참고: 조-K1 셀에 대 한 매체는 89% 햄의 F12 10 %FBS + 1% 페니실린. NIH 3T3 세포에 대 한 매체 89 %Dulbecco 수정된이 글의 중간 (DMEM) + 10% 송아지 소 혈 청 (CBS) + 1% 페니실린 이다. 문화 상태는 37 ° C, 5% CO2.<ol>
<li>문화 조 K1 셀 또는 NIH 3T3 세포 배양 접시 (또는 문화 플라스 크)에 80%-100% 합류.</li>
		<li>솔루션 및 37 ° c 배양 분리 셀 따뜻한</li>
		<li>피 펫과 페 트리 접시에 모든 문화 매체를 제거 합니다. 1 세포를 씻어 솔루션을 분리 하는 세포와 x. 솔루션을 분리 된 세포를 커버 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>Pipetting으로 세포를 분산. 셀 솔루션을 수집 하 고 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심.</li>
		<li>완전 한 매체 또는 혈 청 무료 매체 추가 및는 상쾌한 밖으로 빨 아.</li>
		<li>원하는 수준 (1 x 105 -1 x 106/mL) 셀 솔루션 밀도 조정 합니다. (섹션 2에 따라 준비) 그것의 표면에 세포 격판덮개 비디오 녹화 하기 전에 이미지, 또는 30 분 전에 1-2 h 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 영상, 비디오 녹화 및 실시간 integrin 긴장 매핑
<ol><li>
라이브 셀에서 integrin 긴장의 quasi-real-time 이미징
	<ol>
<li>실 온에서 30 분 (섹션 2에 따라 준비) 그것의 표면에 keratocytes를 품 어 또는 조 K1 셀 또는 37 ° c.에 인큐베이터에 그것의 표면에 1 시간에 대 한 NIH 3T3 세포를 품 어</li>
		<li>형광 현미경 스테이지에 페 트리 접시를 탑재 합니다. 세포 힘 영상 1의 노출 시간을 수행 s. 배율을 100 x 40 x입니다.</li>
		<li>20 프레임 간격의 이미지의 비디오 가져가 라 keratocytes, 또는 1-2 분 조 K1 셀 또는 NIH 3T3 세포에 대 한 s.</li>
		<li>MATLAB 이나 다른 이미지 분석 도구를 사용 하 여 새로 최신 프레임 간격에서 생산 하는 ITS 신호를 계산 하는 현재 프레임에서 그 비디오의 이전 프레임을 빼려면. 새로 생산된 ITS 신호 quasi-real-time 방식에서 셀룰러 힘을 보고 그로 인하여 최신 프레임 간격에서 생성 integrin 긴장을 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Integrin 긴장 및 immunostained 세포에서 세포의 구조 coimaging
	<ol>
<li>3.2.2 단계 또는 단계 3.3.6 후 대상 구조 단백질을 표시 하는 immunostaining를 수행 합니다. 참고: integrin 긴장 이미징 및 셀 구조 이미징 사이 형광 크로스 토크를 방지 하려면 다른 염료를 사용 합니다. 이 원고에서 Cy5 fluorophore phalloidin를 위해 사용 되었다 고 알 렉 사 488 vinculin 얼룩이 지기를 위해 사용 되었다. 1 차 및 이차 항 체의 농도 2.5 µ g/mL 이다. Phalloidin에 대 한 농도 1.5 단위 / µ L.</li>
		<li>Multifluorescent 채널 이미징 integrin 긴장 지도 셀 구조 영상 취득을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

ITS는 휴대에 대 한 강력한 기술 강제로 합성 및 응용 프로그램 매핑 아직 매우 액세스할 수 있습니다. 모든 재료 준비, 1 일 이내 ITS는 합성 수 있습니다. 실험, 동안 표면 코팅의 3 단계 셀 도금 전에 필요 합니다. 최근, 우리는 더 ITS 소 혈 청 알 부 민, 유리 또는 폴리스 티 렌 표면33ITS의 직접적인 물리적 흡착 수에 직접 연결 하 여 한 단계로 코팅 절차를 단순화. ITS는 셀룰러 구조 이미징의 유사한 수준에 세포 힘 신호의 형광 강도 제공합니다. 편리한 합성 및 샘플 준비, 현미경 검사 법, 대 한 겸손 한 요구 사항 및 셀룰러 힘에 대 한 높은 감도 ITS 셀 역학의 연구에 대 한 강력 하 고 신뢰할 수 있는 기술을 확인합니다. 이 문서에서 우리는 그것의 합성 및 응용에 대 한 포괄적인 절차를 제시.
RGD 어근 ligand ssDNA와 그것의 합성에서 가장 중요 한 절차 이다. 프로토콜 섹션에서 설명 했 듯...

셀은 integrins 준수 및 셀룰러 힘 세포 외 기질을 발휘에 의존 합니다. Integrin 중재 하는 세포 접착 및 힘 전송 셀1,2, 마이그레이션3,4및 생존5,,67확산에 대 한 중요 한 있습니다. 긴 기간에 또한 셀 확산8,,910 와 차별화11,12영향 integrin biomechanical 신호. 연구원은 측정 하는 다양 한 방법을 개발 했다 하며 지도 integrin 전송 휴대 세포-매트릭스 인터페이스에서. 이러한 메서드는 탄성 층13, 배열 micropost14또는 원자 힘 현미경 (AFM)15,16. 탄성 층 및 micropost 방법 세포 스트레스를 보고와 공간적 해상도 측면에서 제한이 감도 강제 하는 기판의 변형에 의존 합니다. AFM은 높은 힘 감도, 하지만 그것은 동시에 여러 장소에서 힘을 감지할 수 없습니다, 그리고 integrins 전송한 셀룰러 힘을 지도 하 고 어려운.
최근 몇 년 동안, 여러 기술 분자 수준에서 세포 힘 연구 개발 되었다. 폴 리 에틸렌 글리콜17,18, 거미 실크 펩 티 드19및 DNA20,21,,2223 에 따라 분자 긴장 센서의 컬렉션을 개발 되었다 시각화 하 고 분자 단백질에 의해 전송 하는 긴장을 모니터링 합니다. 이러한 기법 중 DNA 합성 물자는 긴장에 밧줄 (TGT), 변조 라이브 셀22,24integrin 긴장의 상한 rupturable 링커 측정으로 처음 채택 되었다. 나중에, DNA와 형광 공명 전송 기술을 결합 했다 만드는 머리 핀 형광 긴장 DNA 기반 센서 먼저 첸의 그룹23 , Salaita의 그룹20여. 헤어핀 긴장 DNA 기반 센서 integrin 긴장 실시간으로 보고 하 고 세포 기능21의 일련의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 그 후, 왕 실험실 보고서 integrin 긴장 fluorophore 끄는 쌍 한 TGT 결합. 이 센서 는25,26이름은입니다. ITS 이중 가닥 DNA (dsDNA)에 기반 하 고 integrin 긴장 교정에 대 한 광범위 한 동적 범위 (10-60 pN) 있다. 헤어핀 DNA 기반 센서, 달리 ITS 실시간 세포 힘을 보고 하지 않습니다 하지만 셀룰러 힘;의 발자국으로 모든 역사적인 integrin 이벤트 기록 이 신호 축적 과정 영상, 그것을 만드는 가능한 이미지 셀룰러 힘도 저가형 형광 현미경으로 세포 힘에 대 한 감도 향상 시킵니다. ITS의 합성은 두 개의 단일 가닥 DNAs (ssDNA)을 교배 시키기 의해 만들어집니다 더 상대적으로 편리 합니다.
ITS는 18 베이스 결합 dsDNA integrin 펩타이드 리간드 (그림 1)으로 biotin, fluorophore는, 끄는 (블랙 홀을 끄는 2 [BHQ2])27와는 순환 arginylglycylaspartic 산 (RGD) 펩 티 드28 활용 이다. 낮은 물가 fluorophore와 활용 (Cy3 Cy5 또는 알 렉 사 시리즈 다른 염료 동안이 원고에 사용 됩니다, 또한 입증 된 우리의 실험실에서 가능한)는 ITS biotin avidin 본드로 기판에 움직일는 biotin 태그. 위쪽 가닥 RGD 펩타이드와 약 98% 냉각 효율26,27와 Cy3 냉각 블랙홀 끄는 활용 이다. 이 문서에 소개 된 프로토콜, 기판에 ITS의 코팅 밀도 1100 / µ m2주위에 이다. 이것은 우리가 이전 18 혈압 biotinylated dsDNA 같은 프로토콜29코팅에 따라 neutrAvidin 기능성된 기판에 코팅에 대 한 보정 밀도 이다. 셀 ITS 코팅 기판에 준수 때 integrin RGD 통해 ITS 한다 장력 ITS 전송. ITS는 기계적으로 분리 2 s22내 ITS의 dsDNA 긴장 임계값으로 정의 된 특정 긴장 공차 (T톨). Integrin 긴장으로 그것의 파열 리드는 끄는의 분리 이후 형광을 방출 하는 염료에서. 결과적으로, 보이지 않는 integrin 긴장 형광 신호에 변환 되 고 셀룰러 힘 형광 이미징으로 매핑할 수 있습니다.
ITS의 응용 프로그램 입증, 우리 물고기 keratocyte 여기, 셀 마이그레이션 연구30,,3132널리 셀 모델, 조-K1 셀, 일반적으로 사용 되는 nonmotile 셀 라인, 및 NIH 3T3 섬유를 사용 합니다. Integrin 긴장과 셀 구조의 coimaging는 또한 실시 하 고 있다.

<table><tbody><tr><td>BSA-biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>상부 가닥 DNA</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>고객 설계. DNA 염기서열은 PROTOCOL 섹션</td></tr><tr><td>하단 가닥 DNA</td><td>통합 DNA 기술</td><td>N/A</td><td>고객 설계에 나와 있습니다. DNA 염기서열은 PROTOCOL 섹션에 나와 있습니다.</td></tr><tr><td>sulfo-SMCC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A39268</td><td></td></tr><tr><td>사이클릭 펩타이드 RGD with an amine group</td><td>Peptides International</td><td>PCI-3696-PI</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>ATCC</td><td>&lrm; </td><td></td>62996227</tr><tr><td>FBS</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>200 uL 페트리 접시</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td>분광계</td></tr><tr><td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td><td>Hoefer</td><td>SE410-15-1.5</td><td>전기기공용 장치</td></tr>: <tr><td>CHO-K1 세포주</td>, <td>ATCC,</td><td>CCL-61</td><td></td></tr>, <tr><td>NIH/3T3 세포주</td>, <td>ATCC</td>, <td>CRL-1658</td><td></td></tr>, <tr><td>항빈쿨린 항체,</td><td>EMD, Millipore</td><td>90227</td>, <td>빈쿨린 면역염색용 1차 항체</td></tr>, <tr><td>염소 항-마우스 IgG(H+L), 초클론 2차 항체, Alexa Fluor 488</td>, <td>Invitrogen</td><td>A28175</td><td>빈쿨린 면역염색</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>현미경</td></tr>에 대한 2차 항체</tbody></table>

integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin 리간드 결합에 의해 전송 분자 긴장은 많은 세포 기능 및 동작에 중요 한 역할을 재생 integrin 통로에 근본적인 기계 신호입니다. 보정 고 integrin 긴장 높은 힘 감도와 해상도 이미지, 우리는 통합 긴장 센서 (ITS), 형광 긴장 DNA 기반 센서 개발. ITS 힘 분자 수준에서 형광 신호에 따라서 변환 형광 분자 긴장을 유지 하는 경우에 활성화 됩니다. ITS 활성화에 대 한 긴장 임계값은 10-60 pN 잘 셀에서 integrin 긴장의 동적 범위를 커버 하는 범위에서 조정할 수 있습니다. ITS와 융합 하는 기판에 부착 세포의 integrin 긴장 형광에 의해 시각 이며 서브 마이크론 해상도 몇 군데. ITS는 또한 라이브 셀에 고정된 셀 셀 구조 이미징에 호환 됩니다. ITS는 혈소판 수축 및 세포의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 이 문서는 합성 및 ITS integrin 전송 셀룰러 힘의 연구에의 응용에 대 한 절차를 자세히 설명합니다.

ITS와 물고기 keratocytes integrin 긴장 지도 체포 됐다. 그것은 표시는 keratocyte 마이그레이션합니다 integrin 긴장 두 힘 트랙 (그림 2A)에서 생성 됩니다. 힘 지도의 해상도 0.4 µ m (그림 2B) 되도록 보정 했다. 높은 integrin 긴장 뒤쪽 여백 (그림 3A)에 집중 한다. ITS는 또한 다른 세포의 다른 특정 패턴을 보여 줍니다. Nonmotile 셀, NIH-3T3 빠른 마이그레이션 keratocyte의 아주 다른 특정 integrin 긴장 패턴 (그림 3B)을 형성.
Immunostaining와 ...

Integrin 긴장 다양 한 세포 기능에 중요 한 역할을 담당합니다. 통합 긴장 센서 integrin 긴장은 picoNewton (pN) 감도 보정와 서브 마이크론 해상도 몇 군데.

Integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

이 DNA 기반 통합 장력 센서 또는 ITS는 힘 신호를 형광으로 로컬로 변환하여 형광 현미경 검사를 통해 세포력의 직접적인 이미징을 가능하게 합니다. ITS는 높은 공간 해상도와 높은 감도를 가지고 있습니다. 활성화 임계값은 튜닝할 수 있으므로 서로 다른 수준에서 통합 장력의 선택적 이미지를 허용합니다.맞춤형 단일 좌초 DNA 또는 ssDNA를 받은 후 RGD 펩타이드를 티오졸트 ssDNA 대기체에 접합한 후, 먼저 400 마이크로리터에 0.5-마이크로리터의 100마이크로리터를 새로 준비된 TCEP 용액의 약 450 마이크로리터에 추가한다. 그런 다음, 실온에서 30분 배양에 PBS에 1밀리머 티올 DNA 대기기의 20 마이크로리터에 TCEP-EDTA 용액의 10 마이크로리터를 추가합니다. RGD 아민을 sulfo-SMCC로 컨쥬게이트하려면, 신선하게 준비된 23밀리머 설포-SMCC 40마이크로리터를 100마이크로리터에 11밀리머 RGD 아민 용액을 실온에서 20분 간 배양합니다.RGD 아민 SMCC를 thiolated ssDNA 대기열에 결합하려면, 실온에서 1시간 배양에 대한 RGD 아민 SMCC 솔루션의 전체 부피와 티오레이트 ssDNA quencher 용액의 전체 부피를 혼합한다. 인큐베이션이 끝나면 솔루션을 하룻밤 동안 섭씨 4도까지 전송합니다. 다음 날 아침, 3마리의 어금니 나트륨을 티올 컨쥬게이드 DNA 용액과 영하 20도, 100%에탄올을 1대 10대 25비율로 혼합하고, 약 30분간 영하 20도의 반응을 나타낸다.DNA가 침전되면 원심분리에 의해 DNA를 수집하고 분광계에서 DNA 농도를 측정하기 위해 PBS의 펠릿을 다시 중단합니다. 통합 장력 센서 또는 ITS, 합성의 경우 상부 및 하부 가닥 DNA 용액을 1.1 대 1-1-대구 비율로 혼합하고, 장기간 보관을 위해 혼합물의 알리쿼트를 영하 20도에서 넣기 전에 4°C에서 밤새 반응을 배양한다. ITS 고정을 위해 직경 29mm의 유리 바닥 페트리 접시에 밀리리터 당 0.1밀리그램의 200 마이크로리터를 코팅하여 밀리리터 당 0.1밀리그램의 바이오틴 소 살부 또는 BSA-비오틴을 섭씨 4도에서 30분간 코팅합니다.BSA-비오틴이 유리 표면에 물리적으로 흡착되면 세척당 200 마이크로리터의 신선한 PBS로 3회 세척한 다음 아비딘 단백질의 밀리리터 당 50마이크로그램의 200 마이크로리터를 4도에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS로 접시를 세 번 씻고, 섭씨 4도에서 또 다른 30분 동안 0.1 마이크로몰라 ITS 200 마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS로 세 번 접시를 씻고 마지막 세척을 세포 도금까지 접시에 남깁니다.물고기 각질 각질 문화를 시작하려면 평평한 트위저를 사용하여 물고기에서 스케일조각을 뽑아내고, 스케일을 수정되지 않은 유리 바닥 페트리 접시의 우물에 부드럽게 누르고, 스케일의 안쪽면이 유리에 닿습니다. 물고기 스케일이 접시의 유리 표면에 부착될 때까지 약 30초 동안 기다렸다가 이스코브의 수정된 덜벡코 의 매체를 1밀리미터로 가리고 있었다. 그런 다음 실온에서 6~48시간 동안 어둡고 습한 상자에 스케일을 배양합니다.각질 세포를 ITS 표면에 플레이트하려면 각질 세포 배양 접시에서 매질을 실온에서 3분 동안 잠식할 수 있도록 1X 세포 분리 용액으로 교체하십시오. 인큐베이션이 끝나면 분리 용액을 신선한 완전한 매체로 교체하고 세포를 부드러운 파이펫팅으로 분리합니다. 그런 다음, 도금에 적합한 농도로 세포를 조정하고, 이미징 전에 실온에서 30 분 동안 ITS 코팅 접시에 씨앗을 드시면.살아있는 세포에서 준-실시간 통합 장력 화상 진찰을 위해, 형광 현미경의 단계로 세포를 전송하고, 40 또는 100 배 목표를 선택합니다. 이미징 소프트웨어에서 노출 시간을 1초로 설정하고 프레임 간격을 20초로 설정하여 ITS 이미지의 비디오를 가져옵니다. 그런 다음 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 현재 프레임에서 ITS 비디오의 이전 프레임을 빼서 최신 프레임 간격으로 새로 생성된 ITS 신호를 계산합니다.새로 생성된 ITS 신호는 최신 프레임 간격에서 생성된 인테그린 장력을 나타내므로 셀룰러 력을 준 실시간 방식으로 보고한다. 여기서, 통합장력 매핑은 각질 세포 이동 중 두 개의 힘 트랙에서 인테그린 장력의 유도를 보여줍니다. 그런 다음 힘 맵의 해상도를 0.4 마이크로미터로 보정할 수 있습니다.높은 통합장력은 운동성 생선 각질세포의 후면 여백에 집중됩니다. 비운동성 세포에서, 빠른 마이그레이션 각질세포에서 관찰된 것과 는 매우 다른 특정 통합장력 패턴이 형성된다. 초점 접착력과 물고기 각질 세포의 통합 장력은 관심 있는 세포에서 인테그린 장력과 세포 구조 사이의 관계를 평가하기 위해 공동 적으로 이미지될 수 있다.ITS를 사용하면 세포 접착력은 세포 구조 이미징에 필적하는 해상도와 감도로 볼 수 있게 됩니다. 이 기술은 세포에서 힘 구조 상호 작용의 연구를위한 길을 포장합니다.

imaging-integrin-tension-cellular-force-at-submicron-resolution-with

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 폴리에틸렌 글리콜 고정 금 나노 입자와 DNA 헤어핀 장력 프로브를 사용하여 면역 세포가 가하는 수용체를 평가하는 방법을 보여줍니다. CD8 양성 T 세포 상호 작용은 프로브 풀림을 트리거하여 형광을 방출하는 반면 잠금 가닥은 면역 세포가 가하는 힘을 정량화하기 위한 신호를 유지합니다.

DNA 기반 장력 프로브를 사용하여 면역 세포가 가하는 수용체 힘 평가

최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

여기에서, 우리는 간격 접합 connexin 43를 중단하고 견인및 세포간 응력의 관측을 통해 내피 생체 역학에 있는 후속 충격을 측정하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다.

코넥신 43 구조적 파괴를 통한 내피 생체역학 의 교란

이 프로토콜은 참조가 없는 견인력 현미경으로 사용하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) 기반 하이드로겔에 내장된 형광 선한 마커의 3차원 배열을 제작하기 위해 다광자 리소그래피를 구현하기 위한 지침을 제공합니다. 플랫폼. 이 지침을 사용하여 3D 재료 변형률 측정 및 셀룰러 견인 계산이 단순화되어 고처리량 견인력 측정을 촉진합니다.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

iTACS(셀룰러 신호)를 분석하는 통합 툴킷은 부착 셀에서 다양한 화학 및 기계적 신호를 동시에 측정하는 과정을 자동화합니다. iTACS는 지역 사회 기반의 개발을 용이하게하고 연구원이 교육 배경에 관계없이 모든 플랫폼 기능을 사용할 수 있도록 설계되었습니다.

세포 신호를 분석하는 통합 툴킷: 힘, 동작, 형태학 및 형광

TGT 표면은 성장 인자 - 인테그린 누화를 연구하는 혁신적인 플랫폼입니다. 유연한 프로브 설계, 부착 리간드의 특이성, 자극 조건의 정밀한 조절은 EGFR-인테그린 인터플레이의 강력한 정량적 평가를 가능하게 한다. 결과는 EGFR을 '메카노-조직자' 튜닝 인테그린 역학으로 강조하여 초점 접착 어셈블리 및 세포 확산에 영향을 미칩니다.

성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브

이 원고는 계면 형태를 시각화하면서 계면 장력과 표면 팽창 유변학을 동시에 측정하기 위해 마이크로 텐시오미터 / 공초점 현미경의 설계 및 작동을 설명합니다. 이것은 기술 및 생리학에서 중요한 인터페이스의 구조 - 속성 관계의 실시간 구축을 제공합니다.

동적 인터페이스의 공초점 현미경 시각화를 위한 마이크로텐시오미터

학습하세요 DNA 기반 통합 긴장 센서(ITS)를 이용해 피코뉴턴 감도로 인테그린 긴장을 측정하고 형광 현미경으로 세포 힘을 실시간 이미징하는 방법을. 이 기술은 세포 생물학 및 생물물리학 연구에 활용됩니다.

Integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징

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