Integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징

이 DNA 기반 통합 장력 센서 또는 ITS는 힘 신호를 형광으로 로컬로 변환하여 형광 현미경 검사를 통해 세포력의 직접적인 이미징을 가능하게 합니다. ITS는 높은 공간 해상도와 높은 감도를 가지고 있습니다. 활성화 임계값은 튜닝할 수 있으므로 서로 다른 수준에서 통합 장력의 선택적 이미지를 허용합니다.

맞춤형 단일 좌초 DNA 또는 ssDNA를 받은 후 RGD 펩타이드를 티오졸트 ssDNA 대기체에 접합한 후, 먼저 400 마이크로리터에 0.5-마이크로리터의 100마이크로리터를 새로 준비된 TCEP 용액의 약 450 마이크로리터에 추가한다. 그런 다음, 실온에서 30분 배양에 PBS에 1밀리머 티올 DNA 대기기의 20 마이크로리터에 TCEP-EDTA 용액의 10 마이크로리터를 추가합니다. RGD 아민을 sulfo-SMCC로 컨쥬게이트하려면, 신선하게 준비된 23밀리머 설포-SMCC 40마이크로리터를 100마이크로리터에 11밀리머 RGD 아민 용액을 실온에서 20분 간 배양합니다.

RGD 아민 SMCC를 thiolated ssDNA 대기열에 결합하려면, 실온에서 1시간 배양에 대한 RGD 아민 SMCC 솔루션의 전체 부피와 티오레이트 ssDNA quencher 용액의 전체 부피를 혼합한다. 인큐베이션이 끝나면 솔루션을 하룻밤 동안 섭씨 4도까지 전송합니다. 다음 날 아침, 3마리의 어금니 나트륨을 티올 컨쥬게이드 DNA 용액과 영하 20도, 100%에탄올을 1대 10대 25비율로 혼합하고, 약 30분간 영하 20도의 반응을 나타낸다.

DNA가 침전되면 원심분리에 의해 DNA를 수집하고 분광계에서 DNA 농도를 측정하기 위해 PBS의 펠릿을 다시 중단합니다. 통합 장력 센서 또는 ITS, 합성의 경우 상부 및 하부 가닥 DNA 용액을 1.1 대 1-1-대구 비율로 혼합하고, 장기간 보관을 위해 혼합물의 알리쿼트를 영하 20도에서 넣기 전에 4°C에서 밤새 반응을 배양한다. ITS 고정을 위해 직경 29mm의 유리 바닥 페트리 접시에 밀리리터 당 0.1밀리그램의 200 마이크로리터를 코팅하여 밀리리터 당 0.1밀리그램의 바이오틴 소 살부 또는 BSA-비오틴을 섭씨 4도에서 30분간 코팅합니다.

BSA-비오틴이 유리 표면에 물리적으로 흡착되면 세척당 200 마이크로리터의 신선한 PBS로 3회 세척한 다음 아비딘 단백질의 밀리리터 당 50마이크로그램의 200 마이크로리터를 4도에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS로 접시를 세 번 씻고, 섭씨 4도에서 또 다른 30분 동안 0.1 마이크로몰라 ITS 200 마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS로 세 번 접시를 씻고 마지막 세척을 세포 도금까지 접시에 남깁니다.

물고기 각질 각질 문화를 시작하려면 평평한 트위저를 사용하여 물고기에서 스케일조각을 뽑아내고, 스케일을 수정되지 않은 유리 바닥 페트리 접시의 우물에 부드럽게 누르고, 스케일의 안쪽면이 유리에 닿습니다. 물고기 스케일이 접시의 유리 표면에 부착될 때까지 약 30초 동안 기다렸다가 이스코브의 수정된 덜벡코 의 매체를 1밀리미터로 가리고 있었다. 그런 다음 실온에서 6~48시간 동안 어둡고 습한 상자에 스케일을 배양합니다.

각질 세포를 ITS 표면에 플레이트하려면 각질 세포 배양 접시에서 매질을 실온에서 3분 동안 잠식할 수 있도록 1X 세포 분리 용액으로 교체하십시오. 인큐베이션이 끝나면 분리 용액을 신선한 완전한 매체로 교체하고 세포를 부드러운 파이펫팅으로 분리합니다. 그런 다음, 도금에 적합한 농도로 세포를 조정하고, 이미징 전에 실온에서 30 분 동안 ITS 코팅 접시에 씨앗을 드시면.

살아있는 세포에서 준-실시간 통합 장력 화상 진찰을 위해, 형광 현미경의 단계로 세포를 전송하고, 40 또는 100 배 목표를 선택합니다. 이미징 소프트웨어에서 노출 시간을 1초로 설정하고 프레임 간격을 20초로 설정하여 ITS 이미지의 비디오를 가져옵니다. 그런 다음 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 현재 프레임에서 ITS 비디오의 이전 프레임을 빼서 최신 프레임 간격으로 새로 생성된 ITS 신호를 계산합니다.

새로 생성된 ITS 신호는 최신 프레임 간격에서 생성된 인테그린 장력을 나타내므로 셀룰러 력을 준 실시간 방식으로 보고한다. 여기서, 통합장력 매핑은 각질 세포 이동 중 두 개의 힘 트랙에서 인테그린 장력의 유도를 보여줍니다. 그런 다음 힘 맵의 해상도를 0.4 마이크로미터로 보정할 수 있습니다.

높은 통합장력은 운동성 생선 각질세포의 후면 여백에 집중됩니다. 비운동성 세포에서, 빠른 마이그레이션 각질세포에서 관찰된 것과 는 매우 다른 특정 통합장력 패턴이 형성된다. 초점 접착력과 물고기 각질 세포의 통합 장력은 관심 있는 세포에서 인테그린 장력과 세포 구조 사이의 관계를 평가하기 위해 공동 적으로 이미지될 수 있다.

ITS를 사용하면 세포 접착력은 세포 구조 이미징에 필적하는 해상도와 감도로 볼 수 있게 됩니다. 이 기술은 세포에서 힘 구조 상호 작용의 연구를위한 길을 포장합니다.