Name: 엔지니어 드 바이오 필름의 3 차원 패터 닝-it-스스로 바이오 필름 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 저렴한 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환하여 패턴화된 바이오필름을 인쇄하는 방법을. 알지네이트 기반 바이오잉크와 Z축 보정을 통해 재현 가능한 모델 바이오필름을 만들어 항균 요법 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 AOARD 보조금에 의해 지원 되었다 (아니. FA2386-4059)은 나노 과학 프로그램의 선구자로 서 과학 연구 (NWO/OCW) 및 첨단 소재 NWO-NSFC 프로그램 (No. 729.001.016)의 일환으로 개발 되었습니다. 저자는 라몬 밴 데 어 발 크와 롤랜드 키에 프의 실험실 지원을 인정 합니다.

1. 상업용 3D 프린터를 3D 바이오 제약으로 변환
<ol><li>프린터 프레임에서 상업용 3D 프린터 (재질 테이블)의 압출 기와 히터를 분리 하 고 메인 회로 기판에서 이러한 요소를 제어 하는 배선을 분리 합니다 (그림 1a). 프린터의 작동 온도를 제어 하는 센서가 프린터 소프트웨어와 통신 하기 위해 작동 해야 하므로, 인쇄 소프트웨어에서 작동 온도에 도달할 때까지 인쇄를 지연 시키는 알고리즘을 제거 하십시오.</li>
	<li>실리콘 튜빙 (내경 1mm)을 통해 피 펫 팁 (200 µ L 팁)을 주사기 펌프에 넣은 5Ml 주사기에 연결 합니다. 원래 압출 기의 대체품으로 3D 프린터 압출 기 헤드에 피 펫 팁을 장착 합니다 (그림 1b).</li>
	<li>여러 종류의 바이오 잉크가 사용 되는 경우, 추가 튜빙 시스템 및 피 펫 팁을 프린터에 장착 하십시오.</li>
</ol>2.3D 프린팅을 위한 기판 준비
<ol><li>5Mcacl2 용액 5ml를 400 ml의 1%에 첨가 하 여 적당 한 항생제와 유도 제 (여기에 34 µ 클로 람 페니 콜 및 0.5% 람 코)로 보충 한다.</li>
	<li>각 150 mm x 15mm 페 트리 디쉬에 LB 한 천 용액 20ml를 분주 합니다. 뚜껑을 반쯤 연 후 상 온에서 30 분간 건조 시킵니다. 참고: 이러한 인쇄 기판을 최대 며칠 동안 4°c에서 저장 하 여 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 바이오 잉크 준비
<ol><li>알 긴 산 나트륨 용액 (3%)을 준비 하 고, 끓는 점에 3 회가 열 하 여 용액을 살 균 한다. 사용 될 때까지 4°c에서 보관 하십시오.</li>
	<li>대장균 MG1655 균 주의 프로 δ Csga ompR234 (대장균δ csga) 세균 운반 플라스 미드 pSB1C3 녹색 형광 단백질 (Gfp)2 또는 pSB1C3-gfp-csga (구성형 Gfp 발현, 람 코 유도성 csga) 성장 발현) 37에서 밤새 250 rpm으로 흔들어 34 µ를 함유 하는 LB 배지에 50 mL의 클로 람 페니 콜과 0.5% 람 코.</li>
	<li>3220 x g 에서 5 분 동안 세포 배양 액을 원심 분리 하 여 세균을 펠 릿 한다. 상층 액을 제거 합니다.</li>
	<li>박테리아 펠 릿을 LB 배지 10ml에 재 일시 중단 하 고 알 긴 산 나트륨 10ml (3%)를 첨가 한다.</li>
</ol>4.3D 프린팅 프로세스
<ol><li>컴퓨터에 3D 프린팅 소프트웨어 (자재 표)를 설치 하 고 엽니다. 3D 프린터를 컴퓨터에 연결 합니다. X, Y 및 Z 축의 홈 버튼을 클릭 하 여 프린트 헤드를 홈 위치로 이동 합니다.</li>
	<li>각 인쇄에 대해 준비 된 인쇄 기판을 인쇄 베드의 특정 위치에 놓습니다.</li>
	<li>Z 축에서 프린트 헤드의 높이를 보정 합니다.<ol>
<li>원하는 위치로 이동할 때 페 트리 디쉬의 가장자리와 충돌 하지 않도록 수동 제어에서 22mm의 높이로 프린트 헤드를 올립니다. 프린트 헤드를 판의 위에 놓고, 피 펫 팁이 인쇄 면에 접촉 할 때까지 아래로 움직입니다. 이 Z 축 위치를 Z1 (인쇄 표면의 높이)로 지정 합니다.</li>
		<li>프린트 헤드를 올리고 X, Y 및 Z 축에서 수동 제어를 통해 플레이트 영역의 외부로 이동 합니다. 프린트 헤드와 플레이트 표면 사이의 작동 거리가 Z2로 정의 된 경우 인쇄 하는 동안 인쇄 프로그램에 Z1 + Z2를 Z 값으로 입력 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 궤적에 따라 자체 개발한 포인트 바이 포인트 좌표 결정 방법으로 인쇄 형상을 프로그래밍 합니다.<ol>
<li>원하는 궤적이 직선이 면 시작점과 끝점만 정의 합니다. 곡선에 추가 점을 포함 하면 곡선이 부드러워집니다. 수동으로 프린트 헤드를 모든 지점으로 순차적으로 이동 하 고 이러한 점의 좌표를 순서 대로 기록 하십시오. G 코드 편집기에 각 인쇄 된 세그먼트에 대 한 프린트 헤드 이동 속도 뿐만 아니라 이러한 좌표를 모두 입력 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인쇄 전후 모두 프린트 헤드를 플레이트 가장자리 (20mm) 보다 높은 거리까지 들어올려 플레이트 영역에서 직접 이동 합니다. 이 프로그램을 G 코드 파일로 저장 하 고 새로운 인쇄 기판에 대 한 Z 축 높이를 다시 측정 하면서 후속 인쇄물에 사용 하기 위해 직접 로드 합니다. 참고: 정사각형 인쇄를 위한 G 코드 예제는 표 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>미리 프로그램 된 G 코드 파일을 로드 합니다. 소프트웨어에서 G 코드 편집기를 열고 원하는 모양을 인쇄 하는 명령에서 프로그램 합니다. 각 명령행에서 프린트 헤드의 위치는 X, Y 및/또는 Z 축에서 변경 될 수 있습니다. 모든 인쇄 단계에서 Z1 + Z2 (인쇄 면의 높이 + 작동 거리)로 Z 값을 입력 합니다. 참고: 이동 속도 또한 조정 가능 합니다. 9000 m/min은 일반적인 인쇄 속도에 적합 한 값입니다.</li>
	<li>액체 바이오 잉크를 주사기에 넣고 3D 바이오 바이 저의 주사기 펌프에 장착 합니다. "</li>
	<li>인쇄 버튼을 클릭 하 여 인쇄 기판에 바이오 잉크를 인쇄 합니다.</li>
	<li>인쇄 하는 동안, 소프트웨어에 의해 완전히 프린트 헤드의 움직임을 제어 합니다. 프린트 헤드가 인쇄 표면과 접촉 하기 전에 주사기 펌프를 수동으로 시작 합니다. 참고: 실린 지 펌프와 프린터의 조정은 돌출 속도, 프린트 헤드가 첫 번째 인쇄 지점으로 이동 하는 속도, 프린트 헤드의 초기 위치에 따라 경험적으로 결정 됩니다. 초기 프린트 헤드 위치가 20mm 인 경우, 9000의 프린트 헤드 속도와 0.1 mL/h의 압출 속도를 사용 하면 인쇄가 시작 된 직후 주사기 펌프를 시작 합니다. 압출 속도가 0.1 mL/h에서 0.3 mL/h로 변경 되 면 인쇄가 시작 된 후 2-3 초 동안 주사기 펌프를 시작 합니다.</li>
	<li>프린트 헤드가 마지막 인쇄 지점에 도착 하자마자 주사기 펌프를 중지 하십시오. 인쇄 과정의 끝에서 프린트 헤드가 상승 하기 전에 주사기 펌프를 정지, 그렇지 않으면 과도 한 바이오 잉크가 인쇄 기판에 드롭 인쇄 해상도를 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>3D 구조를 구성 하려면 G 코드 편집기에서 프린트 헤드의 모든 움직임을 제어 합니다. 첫 번째 레이어의 인쇄 높이를 입력 합니다. 두 번째 레이어에 대해 G 코드의 Z 값을 0.2 밀리미터 단위로 늘려 인쇄 높이를 늘립니다. 그런 후 상위 레이어로 이동할 때 Z 값을 0.1 밀리미터 만큼 늘립니다. 인쇄 과정에서 판을 움직이지 마십시오.</li>
	<li>인쇄 된 하이드로 겔의 폭과 높이를 측정 하려면 샘플 아래 또는 옆에 배치 된 강철 눈금자를 사용 하십시오.</li>
</ol>5. 대장균 에의 한 생물 막 생산의 효과를 성장 및 테스트
<ol><li>3-6 일 동안 실 온에서 인쇄 된 샘플을 배양 하 여 생물 막 성분 (curli 섬유)의 생산을 허용 합니다. 카메라 또는 형광 스캐너를 사용 하 여 플레이트를 이미지 합니다.</li>
	<li>알 긴 산 매트릭스를 용 해 하려면, 0.5 M의 구 연산 나트륨 용액 20ml(naoh로 조정 된 pH = 7)을 인쇄 기판에 넣고 실 온에서 30 rpm으로 흔들어 2 시간 동안 배양 한다. 액체를 버리고 플레이트를 다시 이미지 하 여 시트 레이트 처리 전에 판의 이미지와 비교 하십시오.</li>
</ol>

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<li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Polyhydroxyalkanoates%2C+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers%2C+in+Bacteria+and+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li>
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</ol>

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엔지니어링 된 바이오 필름의 3D 프린팅을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 단계를가지고 있습니다. 첫 번째는 특정 인쇄 해상도를 생산 하는 가장 중요 한 요인이 되는 한 천 인쇄 면의 준비입니다. 인쇄 표면이 평평 하 고 프린트 헤드의 피 펫 팁이 표면에서 올바른 높이로 배치 되었는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 표면이 평평 하지 않으면 인쇄 과정에서 작동 거리가 변경 됩니다. 작동 거리가 0.1 mm 미만인 경우, CaCl2 용액은 피 펫 팁 내부에 들어가서 하이드로 겔 형성을 일으켜 피 펫 팁이 막히는 원인이 될 수 있습니다. 작동 거리가 0.3 mm 이상인 경우 젤을 연속적으로 인쇄할 수 없습니다. 이 연구에서 최적의 작업 거리는 0.2 mm입니다. 평평한 한 천을 준비 하기 위한 좋은 접근법 인쇄 표면은 더 큰 직경의 페 트리 접시 (90-mm 직경 플레이트 보다는 150-지름 페 트리 디쉬)를 사용 하 여 평평한 테이블에 플레이트를 배치 하 고 천을 부 어 신속 하 고 균일 한 속...

현재 이러한 물질의 시장 수가 증가 함에 따라 공간적으로 패턴화 된 재료의 생산을 위한 친환경적이 고 지속 가능한 솔루션을 개발 해야 하는 필요성이 커지고 있다1. 이 문서는 이러한 재료의 생산을 위한 간단 하 고 경제적인 방법을 제시 하 고, 따라서 미래의 응용 프로그램의 큰 스펙트럼을 제공 합니다. 여기에 제시 된 방법은 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 사용 하 여 공간적으로 패턴 된 구조의 3 차원 (3d) 인쇄를 허용 한다. 박테리아는 자연 또는 공학적 된 신진 대사 활동을 수행 하는 박테리아를 가능 하 게 1 주일 이상 인쇄 된 구조 내에서 가능한 남아. 인쇄 된 박테리아는 예를 들어 기능적 가교 된 생물 막2를 생성 하 여 인쇄 된 구조 내에서 원하는 성분을 생성 하 고 침전 시킬 수 있다.
첨단 소재 생산을 위한 전통적인 방법에는 높은 에너지 지출 (예: 고온 및/또는 압력)이 포함 되며 대량의 화학 폐기물을 생산할 수 있으며, 종종 비용-광범위 한 활용도가 요구 되는 독성 물질을 생산 합니다.3 ,4. 대조적으로, 여러 세균 종은 다양 한 산업에서 쉽게 적용 할 수 있는 물질을 생산할 수 있다. 이들 물질은 폴 리 하이드 록 시 알 카 네이트 (PHA)5 또는 폴 리아 (락 티 드)6의 세균 셀 룰로 오 스7, 세균 콘크리트 물질8, 생물 모방 복합 재9와 같은 중합체를 포함 하며, 아 밀 로이드 계 접착제10또는 바이오 기반 전기 스위치 (11)는 그 중 에서도. 더욱이, 귀중 한 물질의 세균 생산은 일반적으로 독성 화합물을 요구 하거나 생산 하지 않고 주변 온도와 압력 및 수성 환경에서 일어난다. 박테리아로 재료를 생산 하는 것은 문헌에서 입증 되었지만 일부 산업 응용 분야는 이미12,13, 이러한 물질의 공간적 패터 닝을 위한 신뢰할 수 있는 방법은 여전히 과제로 남아 있다.
이 문서에서는 저비용 상업용 3D 프린터를 3D 세균 프린터로 변환 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 살아있는 세균을 함유 하 고 유지 하는 바이오 잉크를 제조 하는 방법 뿐만 아니라, 3D 프린팅이 수행 될 수 있는 기판을 준비 하는 방법을 보여준다. 이 방법은 재료를 생산할 수 있는 다양 한 천연 및 공학적 세균 균 주와 함께 사용 하는 것이 적절 하다. 이러한 박테리아는 공간적으로 3D 프린팅 된 구조 내에서 분산 될 수 있고, 여전히 그들의 대사 활성을 계속 하며,이는 박테리아에 의해 생성 된 원하는 물질의 공간적 분포를 초래할 것 이다.
이 인쇄 방법은 자체 생산 된 세포 외 기질로 둘러싸인 생물 막, 세균 응집 체의 적 층 제조를 가능 하 게 한다. 바이오 필름은 단백질, 폴리머, 박테리아 세포, 산소 및 영양분이 모두 공간적으로 구조화 된 이종 3D 네트워크입니다. 생물 막의 형태로, 박테리아는 증가 된 항생제 저항과 구조적 견고성을 나타내며, 의료용 카 테 터 및 임 플 란 트를 포함 한 표면에서 근절 하기 어렵게 합니다. 생물 막 특성에 대 한 핵심은 생물 막 연구에도 가장 큰 과제 이며, 바이오 필름15,16,17의 이질성 일 것으로 보인다. 공간적으로 제어 되는 모델의 바이오 필름의 생산은 생물 막 성분의 공간적 패턴을 재생 하거나 조정 하는 것을 허용 하 고, 사실상 모든 표면에서 생물 막의 안정적인 침착에 대 한 이해를 돕는 것과 같은 특별 한 관심을가지고 있습니다. 자연.
이 기사는 바이오 필름 형성의 검증 방법 뿐만 아니라 유도 체의 존재 하에 바이오 필름 단백질을 생산 하는 엔지니어링 된 대장균 박테리아를 포함 하는 3d 프린팅 하이드로 젤을 사용 하는 바이오 필름의 제조 방법을 제시 합니다.2 . 이들 바이오 필름의 주요 세포 외 기질 성분은 자가 조립 된 CsgA 단백질을 함유 하는 curli 아 밀 로이드 섬유 (18 ) 이다. 개발 된 대장균 박테리아가 csga 단백질을 발현 하도록 유도 되 면, 이들은 인쇄 표면에서 씻 겨 지는 세포를 보호 하는 생물 막의 안정한 모델을 형성 한다. 이러한 3D 프린팅 생물 막은 공간적으로 제어 될 수 있고 다중 스케일 생물 막 구조 기능 역학 또는 물질 들 (19)의 조사를 위한 유용한 연구 도구로 서 작용할 수 있다. 이러한 맞춤형 바이오 필름은 바이오 필름 형성과 기계적 특성의 원리에 대 한 이해를 돕고, 다른 응용 프로그램 들 사이에서 항 생 저항의 메커니즘에 대 한 추가 연구를 가능 하 게 합니다.

<table><tbody><tr><td>3D 프린터</td><td>CoLiDo</td><td>3D-P 키트</td><td></td></tr><tr><td>3D 프린팅 소프트웨어</td><td>CoLiDo</td><td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3886.1</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수 가루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Model 3500</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>150 x 15 mm</td></tr><tr><td>Rhamnose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>VWR&nbsp;</td><td>DENE 3100103/25</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>ProSense B.V.&nbsp;</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>알긴산 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>구연산 나트륨 일염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>71498</td><td></td></tr><tr><td>하이드로옥사이드 나트륨</td><td>VWR</td><td>28244.295</td><td></td></tr></tbody></table>

엔지니어 드 바이오 필름의 3 차원 패터 닝-it-스스로 바이오 필름

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

바이오 필름은 자체 생산 된 공간적으로 패턴화 된 세포 외 기질에 내장 된 박테리아의 집합체 이다. 생물 막 내의 박테리아는 잠재적인 건강 위험을 제기 하는 향상 된 항 생 저항을 개발 합니다, 그러나 또한 식 수의 정화와 같은 환경 신청을 위해 유익할 수 있습니다. 항균 치료제 및 생물 막에서 영감을 얻은 응용 분야의 추가 개발은 생물 막 생성을 위한 재현 가능 하 고 공학 가능한 방법의 개발을 요구할 것입니다. 최근에는 세균 잉크로 수정 된 3 차원 (3d) 프린터를 이용한 바이오 필름 제제의 신규 한 방법이 개발 되 고 있다. 이 문서에서는 세균 유도 재료 처리에 여러 응용 프로그램을 제공 하는이 효율적이 고 저렴 한 3D 바이오 제약 업체를 구축 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜은 적용 가능한 상업용 3D 프린터로 시작 하 여 압출 기를 주사기 펌프 시스템에 연결 된 바이오 잉크 디스펜서로 교체한 후 제어 되 고 연속적인 바이오 잉크 흐름을 가능 하 게 합니다. 생물 막 인쇄에 적합 한 바이오 잉크를 개발 하기 위해, 조작 된 대장균 박테리아를 알지 네이트 용액에 현 탁 시킨 후, 이들이 칼슘을 함유한 표면과 접촉 하 여 응고 되도록 하였다. 인쇄 기판 내에 유도 화학 물질의 포함은 인쇄 된 바이오 잉크 내에서 생물 막 단백질의 발현을 구동 한다. 이 방법을 사용 하면 인쇄 된 바이오 필름의 개별 레이어로 구성 된 다양 한 공간 패턴의 3D 인쇄가 가능 합니다. 이러한 공간적으로 제어 되는 생물 막은 모델 시스템의 역할을 할 수 있으며, 항생제 내성 예방 또는 음 용 수 정화 등 사회에 광범위 한 영향을 미치는 여러 분야의 응용 분야를 찾을 수 있습니다.

바이오 필름의 성공적인 3D 프린팅에 대 한 첫 번째 단계는 상업용 3D 프린터를 바이오 필름으로 변환 하는 것입니다. 이 변환은 폴리머 잉크로 인쇄 하도록 설계 된 프린터의 압출 기와 히터를 제거 하 고 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 인쇄 하는 데 적합 한 구성 요소로 대체 함으로써 달성 됩니다 (그림 1a). 압출 기는 주사기 펌프에 연결 된 튜빙 시스템에 부착 된 피 펫 팁 (또는 여러 개의 바이오 잉크가 인쇄 과정에서 사용 될 경우 팁)으로 대체 된다 (도 1b). 상용 프린터를 바이오 의약품으로 성공적으로 변환 하는 것은 주사기 펌프에서 튜브 시스템 및 피 펫 팁을 통해 원하는 바이오 잉크 (들)를 누설 또는가 열 하지 않고 인쇄 표면에 전달 하는 기능에 기초 하 여 평가할 수 있습니다 바이오 잉크. 인쇄 중에 바이오 잉크의 흐름으로 인해 튜...

본 문서에서는 저가형 상업용 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환 하 여 패턴화 된 바이오 필름의 인쇄를 촉진할 수 있는 방법을 설명 합니다. 바이오 필름 및 바이오 잉크를 제조 하는 데 필요한 모든 측면 뿐만 아니라 생물 막의 형성을 평가 하기 위한 검증 방법도 설명 합니다.

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

박테리아를 사용한 3D 바이오 프린팅은 새로 개발된 기술입니다. 이 프로토콜은 박테리아로 인쇄된 엔지니어링 된 생물막 3D를 쉽게 구성 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴한 가정용 3D 프린터를 사용하여 3D 인쇄 생물필름을 생산하는 기능입니다.3D 프린터의 가능한 한 가지 적용은 새로운 항균 요법을 개발하는 데 사용할 수 있는 재현 가능한 모델 생물막을 만드는 것입니다. 당사의 3D 프린팅 접근 방식은 alginate 기반 바이오잉크와 호환되는 모든 유형의 박테리아에 적용할 수 있습니다. 바이오잉크와 인쇄 기판의 제조는 상당히 표준적인 절차이며, 3D 프린팅 공정, 특히 Z축의 교정은 몇 가지 연습이 필요한 중요한 단계입니다.설정된 액세스 높이를 보정하면 3D 프린터의 해상도에 영향을 미치며 개인적인 경험에 크게 의존합니다. 이 절차에는 수동 조정이 필요하며 서면 형식으로 설명하기가 어렵습니다. 200 마이크로리터 파이펫 팁을 실리콘 튜브 길이에 연결하고 파이펫 팁을 원래 압출기를 대체할 수 있도록 3D 프린터의 압출기 헤드에 장착합니다.다음으로, 루리아-베르타니 국물에 용해된 1%의 1%의 1%의 400 밀리리터에 5마리의 어금니 칼슘 염화물 용액의 4밀리리터를 추가하고 적절한 항생제와 유도기로 보충합니다. 그런 다음 LB 한천 용액의 20 밀리리터를 각 150mm에서 15mm 페트리 접시에 분배합니다. 실온에서 30분간 건조하고 뚜껑이 반쯤 열려 있습니다.3% 알자네이트 나트륨 용액을 준비하고 끓는 점에 3번 가열하여 용액을 살균합니다. 그런 다음 멸균 용액을 사용할 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 바이오잉크의 세균 성분을 제조하기 위해, 항생제를 함유한 LB 배지의 50밀리리터에서 구성 GFP 발현을 위해 플라스미드를 운반하는 대장균 균을 성장시다.하룻밤 사이에 250 RPM과 섭씨 37도에서 문화를 흔들어 주세요. 문화의 하룻밤 성장 후, 3에서 5 분 동안 박테리아를 펠릿, 220 시간 중력 다음 상체를 제거. LB 배지의 10 밀리리터에서 박테리아 펠릿을 다시 중단하고, 3%의 알기네이트 나트륨의 10 밀리리터를 추가합니다.3D 프린터를 컴퓨터에 연결하고 3D 프린팅 소프트웨어를 엽니다. X, Y 및 Z 축의 홈 버튼을 클릭하여 인쇄 헤드를 홈 위치로 이동합니다. 각 인쇄에 대해 준비된 인쇄 기판을 인쇄 베드의 특정 위치에 놓습니다.인쇄 헤드를 수동 제어하에 22밀리미터 이상의 높이로 올리므로 이동 중에 페트리 접시가장자리와 충돌하지 않습니다. 인쇄 헤드를 플레이트 위에 놓고 파이펫 팁이 인쇄 표면에 닿을 때까지 아래로 이동합니다. 이 Z축 위치를 인쇄 표면의 높이인 Z1로 할당합니다.그런 다음 인쇄 헤드를 들어 올리고 수동으로 플레이트 영역 외부로 이동합니다. 인쇄 헤드와 플레이트 표면 사이의 작업 거리가 Z2로 정의되면 인쇄 표면의 높이와 인쇄 시 인쇄 시 Z 값으로 인쇄 프로그램에 작업 거리를 입력합니다. 원하는 모양을 인쇄하기 위한 명령이 포함된 미리 프로그래밍된 G 코드 파일을 로드합니다.각 명령줄에서 인쇄 헤드의 위치는 X, Y 및 Z 축에서 변경될 수 있습니다. 인쇄 표면의 높이와 작업 거리로 모든 인쇄 단계에서 Z 값을 입력해야 합니다. 액체 바이오잉크를 주사기에 적재하고 3D 바이오 프린터의 주사기 펌프에 장착합니다.그런 다음 압출 속도를 시간당 0.3 밀리리터로 설정합니다. 인쇄 버튼을 클릭하여 생체 잉크를 인쇄 기판에 인쇄합니다. 인쇄가 시작될 때까지 주사기 펌프를 시작하고 인쇄 헤드가 인쇄 표면과 접촉하기 전에 기다립니다.인쇄 하는 동안, 완전히 소프트웨어에 의해 인쇄 머리 움직임을 제어 합니다. 인쇄 헤드가 인쇄의 마지막 지점에 도착하자마자 주사기 펌프를 멈추고, 그렇지 않으면 과도한 바이오잉크가 인쇄 기판에 떨어지고 인쇄 해상도를 줄입니다. 3D 구조의 시공의 경우 인쇄 헤드의 모든 움직임이 G 코드 편집기에서 제어됩니다.두 번째 레이어의 인쇄 높이를 높이 높이를 높이려면 첫 번째 레이어의 인쇄 높이를 입력하고 코드의 Z 값을 0.2 밀리미터 증가시다. 그 후 더 높은 층으로 이동할 때 Z 값을 0.1 밀리미터 증가시면 됩니다. 컬리 섬유와 같은 생물막 성분의 생산을 허용하기 위해 3~6일 동안 실온에서 인쇄된 샘플을 배양한다.그런 다음 형광 스캐너에 접시를 놓고 플레이트를 이미지화합니다. 알자산 매트릭스를 용해하려면 pH 7에서 0.5 개의 어금니질 나트륨 구연산용액의 20 밀리리터를 인쇄 된 기판에 추가하십시오. 30 rpm에서 흔들면서 실온에서 플레이트를 2 시간 동안 배양하십시오.그런 다음 액체를 버리고 플레이트를 다시 이미지화하여 구연산 치료 전후의 플레이트 이미지와 비교합니다. 3D 바이오 프린터는 다양한 2차원 및 3차원 모양으로 하이드로겔을 캡슐화하는 박테리아를 생성할 수 있습니다. 이러한 인쇄된 형상은 생물막의 형성이 성공적이었는지 또는 알기네이트 매트릭스가 구연산염 용액을 사용하여 완전히 용해되었는지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다.유도할 수 없는 컬리 생산 플라스미드가 없는 바이오잉크의 경우, 인쇄된 패턴은 구연산 나트륨 처리 후 완전히 용해되어 생물막 컬리 네트워크가 형성되지 않았음을 나타냅니다. 유도성 컬리 생산 플라스미드를 함유한 박테리아는 구연산 나트륨 치료 후 용해되지 않았으며, 인쇄된 박테리아가 박테리아의 인쇄 패턴을 안정화할 수 있을 만큼 광범위하게 컬리 네트워크를 형성할 수 있었다는 것을 나타낸다. 다층 구조를 구성하기 위해 G 코드 편집기를 제어하여 추가 레이어를 인쇄할 수 있습니다.샘플에서 인쇄된 레이어의 수를 늘리면 인쇄된 구조의 너비와 높이가 점진적으로 증가했습니다. 대장균을 유도하여 컬리 단백질을 유도하도록 설계되었을 때 다층 구조로 인쇄된 구연산 나트륨 치료는 샘플을 용해시키지 않았고, 비컬리 생성 E.coli를 함유한 다층 구조는 용해되었다. 3D 프린팅 절차의 가장 중요한 부분은 Z축의 보정과 인쇄를 시작하고 주사기 펌프를 시작하는 조정입니다.이 공정을 위해 개발된 바이오잉크는 인성이 낮기 때문에 상당히 부드럽습니다. 기계적 안정성을 제공하고 개선하기 위해 바이오 잉크에 추가 수정이 이루어질 수 있습니다. 이 3D 프린팅 기법은 우수한 기계적 특성을 가진 생물막의 생산을 가능하게 하며, 이는 생물모방 물질을 제조할 수 있습니다.이 박테리아를 취급할 때, 장갑과 같은 적당한 보호를 착용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

bioprinter로 HP 데스크젯 500 프린터를 변환하는 데 사용 방법의 설명입니다. 프린터 멤브레인에 과도 모공의 원인이 생활 세포를 처리할 수있다. 이러한 모공은 인쇄 세포에 형광 G-actin을 포함한 작은 분자를, 통합하기 위해 활용할 수 있습니다.

일반 잉크젯 프린터를 사용하여 과도 세포막의 세공 만들기

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

이 프로토콜은 에칭된 지형 안내 신호와 하이드로겔 바이오잉크를 함유한 셀의 정밀 증착을 통합하는 자동화된 로봇 증착 시스템을 사용하는 바이오프린팅 방법론을 설명합니다. 프린트된 셀은 에칭된 피처에 직접 전달되어 이를 감지하고 방향을 지정할 수 있습니다.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

이 원고에서 우리는 말초 조직 공학에 사용하기 위해 그래핀을 함유하는 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 제조를 시연합니다. 이 3D 바이오 하이브리드 재료를 사용하여 줄기 세포의 신경 분화 프로토콜이 수행됩니다. 이것은 유사한 생체 재료를 클리닉에 가져 오는 중요한 단계가 될 수 있습니다.

말초 신경 공학을 위한 그래핀 기반 3D 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 준비 및 특성화

엔지니어링 플랩은 통합된 기능적 혈관 네트워크가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 계층 적 혈관 네트워크와 쥐 대퇴 동맥에 대한 직접적인 미세 외과 적 해부학을 포함하는 3D 인쇄 된 조직 플랩을 제작하는 방법을 제시합니다.

3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

이 프로토콜은 기존의 액체 배양 또는 페트리 접시보다 자연 서식지에 더 가까운 복잡한 3D 다공성 하이드로겔 매트릭스에서 박테리아 군집의 운동성과 성장을 연구하기 위한 박테리아 군집의 3차원(3D) 프린팅 절차를 설명합니다.

복잡한 3D 다공성 매체의 운동성과 성장을 연구하기 위한 3D 프린팅 박테리아

당사는 VOP(vessels-on-a-plate)라고 하는 3D 바이오프린팅 기술을 사용하여 표준 6웰 플레이트에서 유연한 크기와 원하는 패턴을 가진 혈관 채널의 고처리량 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 손상된 내피와 관련된 질환에 대한 치료법 개발을 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 High-throughput Bioprinting 방법

배우세요 저렴한 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환하여 패턴화된 바이오필름을 인쇄하는 방법을. 알지네이트 기반 바이오잉크와 Z축 보정을 통해 재현 가능한 모델 바이오필름을 만들어 항균 요법 개발에 활용할 수 있습니다.

엔지니어 드 바이오 필름의 3 차원 패터 닝-it-스스로 바이오 필름

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