Name: 신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 3D 콜라겐 하이드로겔에서 축산 성장과 신경 이동을 분석하는 방법을 COS-1 세포와 태아 뇌 조직을 이용하여. 이 기법은 분자 신호가 축산 행동에 미치는 영향을 빠르고 간단하게 관찰할 수 있어 신경발달 연구에 필수적입니다.

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저자는 편집 조언과 기술 지원에 대한 M. 세구라 펠리우에 대한 톰 요한난 에게 감사드립니다. 이 작품은 CERCA 프로그램과 혁신의 학과의 대학 및 연구위원회에 의해 투자되었다, 대학, 일반 카탈루냐의 기업 (SGR2017-648). 이 작품은 연구의 스페인 정부에 의해 투자되었다, 혁신과 대학 (MEICO) BFU2015-67777-R 및 RTI2018-099773-B-100, 스페인 프리온 네트워크 (프리오네트 스페인 AGL2017-90665-REDT), 그리고 연구소 카를로스 III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

모든 동물 실험은 바르셀로나 대학의 동물 실험 윤리위원회 (CEEA)의 지침과 프로토콜에 따라 수행되었으며,이 연구에서 설치류의 사용을위한 프로토콜은 CEEA에 의해 검토되고 승인되었습니다. 바르셀로나 대학 (CEEA 승인 #276/16 과 141/15).
1. 쥐 꼬리 콜라겐의 정화
<ol><li>윤리적 지침에 따라 동물을 희생한 후 성인 스프라그-Dawley 쥐 꼬리(8-9주)를 수집하고 95% 에탄올로 헹구십시오. 2-4 개의 꼬리를 얼음 (4 °C)에 놓고 그 과정에서 얼음으로 덮어 두십시오.</li>
	<li>꼬리 힘줄을 얻으려면, 지혈을 사용하여 꼬리의 가장 꼬리 척추에 꼬리를 고정하고 첫 번째에서 5-7mm 주위에 배치 두 번째 지혈로 꼬리를 압축합니다. 두 개의 지혈로 날카롭게 비틀어 꼬리를 부러뜨리세요. 이렇게 하려면 척추가 부러지때까지 여러 번 접고 펼칩니다.</li>
	<li>척추가 나올 때 힘줄을 칼집에서 분리하기 위해 지혈으로 천천히 당깁니다. 이 순간, 작은 가위로 힘줄을 잘라. 이 힘줄 조각을 멸균 100mm 페트리 접시에 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>힘줄이 완전히 추출 될 때까지 꼬리의 나머지 부분에 대한 클램핑 및 슬라이딩을 반복합니다.</li>
	<li>획득한 모든 꼬리에 대해 1.2-1.4 단계를 반복합니다.</li>
	<li>현미경으로 힘줄을 관찰하십시오. 작은 가위로 자르고 직선 미세 집게로 잡고 힘줄의 순도를 개선하고 힘줄을 초순수로 3 회 헹구십시오.</li>
	<li>젖은 힘줄 3-4g을 수집합니다. 200-250 mL 유리 원추형 플라스크에서 4 °C에서 3 % 빙하 아세트산의 150 mL에서 힘줄을 24-36 시간 동안 부드럽게 저어줍니다.</li>
	<li>원심분리기 20,000 x g : 1 시간. 병렬로, 길이 약 10-15cm의 조각을 절단하여 투석 튜브 멤브레인을 준비하고 1mMM에 의해 1mM에 함유 된 초순수 (EDTA)에서 15 분 동안 끓입니다. 그 후, 초순수로 투석 막을 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>원심분리 후, 투석 튜브 막에서 상판액을 데인션으로 수집한다. 펠릿에는 산성 불용성 물질 (비 콜라겐 단백질)이 포함되어 있으며 상급 물질에는 수용성 콜라겐 단백질이 포함되어 있습니다.</li>
	<li>2-5 L 유리 비커에서 멸균 0.1x 최소 필수 미디엄 이글(MEM), pH 4.0의 2L에 대해 상황을 투석합니다. 3 일 동안 투석하십시오. 사용하기 전에 하루에 두 번 0.1x MEM 솔루션을 변경하여 모든 변경 시 pH를 확인하십시오. pH가 기본으로 바뀌면 pH가 4.0이 될 때까지 0.1 M 아세트산 몇 방울로 수정하십시오.</li>
	<li>투석 후, 투석 콜라겐 용액에 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신 (Pen-Strep)의 1.5 mL)를 추가하십시오. 콜라겐 스톡 용액의 5 mL aliquots를 만들고 4 °C에 보관하십시오. 참고: 이 시점부터 모든 취급 절차는 층류 후드의 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다.</li>
	<li>
다음 단계에 따라 제조된 콜라겐 스톡 용액의 겔화 테스트를 진행한다.
	<ol>
<li>스톡 콜라겐은 일반적으로 너무 농축되어 있기 때문에, 0.1x MEM, pH 4.0으로 주식을 희석시킴으로써 3가지 작업 희석(75%, 50%, 25% 콜라겐 용액)을 준비한다. 각 작업 희석에 권장되는 최종 부피는 5 mL입니다. 각 조건에서, 단백질 색색 분석법을 사용하여 단백질 농도를 확인한다.</li>
		<li>빈 1.5 mL 원추형 원심분리튜브(각 작동 희석에 대해 하나씩), MEM 튜브 10x, 중탄산나트륨 용액 7.5%, 얼음위에 콜라겐의 다양한 작용 희석액을 놓습니다. 냉각될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>감기(4°C) 원심분리튜브에 40-50 μL의 10x MEM을 넣습니다. 다음으로, 중탄산나트륨 용액 7-8 μL과 부드럽게 섞으세요.</li>
		<li>이 튜브에 다른 콜라겐 희석제 중 하나의 310-330 μL을 추가하고 거품 형성을 피피피펫과 부드럽게 섞습니다. 콜라겐-MEM-중탄산나트륨 혼합물을 얼음(4°C)에 적어도 5분 동안 보관하십시오.</li>
		<li>35 mm 페트리 접시에 혼합물의 피펫 10-25 μL.</li>
		<li>하이드로겔의 겔화가 관찰될 때까지 37°C로 설정된 CO2 인큐베이터에 페트리 접시를 놓는다(±15-20분).</li>
		<li>다른 페트리 접시에 남아있는 콜라겐 희석에 대해 1.12.3-1.12.6 단계를 반복합니다.</li>
		<li>최상의 결과를 렌더링하는 콜라겐 작업 희석을 선택합니다. 참고: 가장 좋은 겔화 하이드로 겔은 균일 한 반투명 질감, 회색 색상을 가져야하며 울퉁불퉁하거나 끈적하지 않아야합니다. 우리의 경험에서, 3:1 (콜라겐: 0.1x MEM)의 희석은 최상의 실험 결과를 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세포 (COS1)의 준비는 3-D 콜라겐 하이드로 겔에서 후보 분자를 분비하기 위해 유전자 변형 응집체
<ol><li>플레이트 2 x 106 COS1 세포를 35 mm 페트리 접시에 넣고 100 mL의 D-MEM으로 구성된 완전한 배양 배지로 배양하여 열불활성화 된 태아 소 혈청, 0.5 % (wt / vol) 글루타민 및 1 % (wt / vol) 펜 / 스트렙 세포 배양 하룻밤 사이에 70-80 %의 합의에 도달하기 위해 인큐베이터. 각 형질 전환 절차에 대해 페트리 접시 를 준비합니다.</li>
	<li>
다음날 COS1 세포를 제조사의 지시에 따라 리포솜 계 형질전환 방법을 사용하여 후보 분자(Netrin-1 또는 Sema3E)를 코딩하는 DNA를 가진 트랜스펙트.
	<ol>
<li>이렇게 하려면 250 μL의 무혈청 배지와 DNA(조건당 1-2 μg)를 1.5 mL 원심분리기 튜브(DNA 튜브)에 혼합하고 혼합합니다. 5분 동안 실온(RT)에서 배양. 240 μL의 혈청 프리 배지 및 10 μL의 리포좀 형혈 시약에 첨가하여 제2 튜브(리포좀 튜브)를 준비한다. RT에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양 후, DNA-튜브의 함량을 리포좀 튜브에 넣고 부드럽게 섞는다. 이제 RT에서 15 분 동안 배양. 배양 된 세포의 배지를 혈청이없는 배지의 1.5 mL로 교체하고 DNA -리포솜 혼합물을 페트리 접시에 천천히 떨어 뜨립니다. CO2 세포 배양 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3h의 형질전환 배양 후, 배지를 완전한 배양 배지로 대체하고 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한다.</li>
	<li>다음날, 0.1 M 덜베코의 인산 완충 식염수(D-PBS)로 세포를 헹구고, 트립신-EDTA(CO2 인큐베이터에서 5-15분 동안 각 접시당 800 μL)로 배양을 치료하고, 완전한 배양 배지 15 mL로 분리된 세포를 수집합니다.</li>
	<li>세포를 130 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심 분리 후, 매체를 제거하고 얼음에 COS1 세포를 포함하는 펠릿을 보존.</li>
	<li>1.12.3-1.12.6 단계를 반복하여 콜라겐 작동 혼합물을 준비한다.</li>
	<li>형질감염된 세포의 펠릿에 콜라겐 혼합물100-150 μL을 넣고 이 혼합물을 위아래로 파이프팅하여 부드럽게 혼합하고 페트리 접시(직경 35 mm)에 45-50 μL을 퍼뜨리고 길이 약 1-1.5 cm의 콜라겐 세포 밴드를 형성합니다. 겔화(±15-20분)가 관찰될 때까지접시를 37°C(5% CO2)에서 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	<li>제2 배양접시에 대조세포(모의형형질)를 함유하고 인큐베이터(±15-20분)에 플레이트를 넣고 겔화시 3-4 mL의 온난화(37°C) COS1 완전 배양배지를 겔화한 각 접시에 첨가하여 준비한다. 콜라겐-세포 스트립을 CO2 세포 배양 인큐베이터에 보관한다. 그 후, 콜라겐 세포 스트립을 잘라 미세한 메스 또는 조직 다기를 사용하여 작은 정사각형 조각(길이 400 내지 500 μm)을 생성한다.</li>
	<li>동일한 형질전환 상태에서 뉴런 배양 배지(NCM)의 3-3.5 mL를 함유하는 페트리 접시로 모든 절편을 옮기고 해부 현미경으로 조각의 품질을 확인한다. 다시, CO2 세포 배양 인큐베이터에 보관한다. 참고: 신경 배양 배지는 1-5%(vol/vol) 열 불활성화 말 혈청, 2 mM 글루타민, 0.5% (wt/vol) 포도당, 1% (wt/vol) 펜-스트렙 용액 및 0.044%(wt/vol) NaHCO3를포함하는 신경기저 배지로 구성된다. pH가 7.2-7.3 사이인지 확인합니다.</li>
</ol>3. 배아배전의 생성
<ol><li>일상적인 멸균 지침에 따라 오토클레이브를 사용하여 수술 도구(가위, 메스 블레이드 손잡이, 직선 및 곡선 집게)를 살균합니다. 행적으로 행적으로 행크의 균형 소금 용액 - 포도당 버퍼의 500 mL와 HBSS-G의 10mL를 포함하는 4-5 페트리 접시 (100mm 직경)를 준비합니다. 이 판을 얼음(4°C)에 놓습니다.</li>
	<li>승인된 윤리적 절차에 따라 멸균 부위 밖에서 임신한 암컷 쥐(배아일 16.5)를 희생한다. 복강에서 가위로 배아 뿔을 자르고 차가운 HBSS-G가 들어있는 큰 페트리 접시에 넣습니다.</li>
	<li>접시를 층류 후드에 놓고 직선 집게로 배아를 추출합니다. 차가운 HBSS-G가 들어있는 새로운 접시에 넣습니다. 다음으로, 작은 집게를 사용하여 배아의 피부를 제거하고 조심스럽게 곡선 및 직선 집게를 사용하여 뇌를 해부. 차가운 HBSS-G가 들어있는 접시에 넣습니다.</li>
	<li>해부 현미경으로, 메스 또는 미세 가위로 두 반구를 분리하고 미세 한 집게로 뇌 조각에서 뇌, 수막 및 혈관을 제거하기 위해 중간선을 따라 반으로 뇌를 잘라냅니다.</li>
	<li>3.3-3.4단계를 나머지 배아와 함께 반복한다. 조직의 품질을 보존하기 위해 2 시간 이상 해부를 지연시키지 마십시오.</li>
	<li>100 % 에탄올 (특히 폴리테트라 플루오로에틸렌 (PTFE) 절단 판과 면도날)으로 조직 헬기의 모든 부분을 청소하십시오. 티슈 헬기를 UV 조명 아래에 있는 라미나 플럭스 후드에 15분 동안 보관하십시오.</li>
	<li>각 조직 조각 (예를 들어, 해마피질)을 조직 헬기의 절단 판으로 옮긴다. 해마의 경우 면도날에 수직으로 놓고 두께가 450-500 μm의 조직 절편을 얻습니다.</li>
	<li>완전한 NCM 3-4 mL로 35mm 페트리 접시를 준비하고 티슈 헬기 접시에서 페트리 접시로 티슈 조각을 옮김을 옮김을 옮김을 준비합니다. 관심 지역이 해부되기 때문에 많은 요리가 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>미세 텅스텐 바늘을 사용하여 전체 NCM에서 조직 해부를 완료합니다. 해부 현미경에서 얻은 조각의 품질을 확인합니다. 층이 암흑 시야 광학에서 명확하게 식별 가능한지 확인하고 텅스텐 바늘로 관심 영역 (예 : 해마의 CA 영역)을 해부하십시오. 손상된 조각을 버리십시오. CO2 인큐베이터에서 완전한 NCM 배지에 해마 박자를 유지한다.</li>
</ol>4. 콜라겐 하이드로겔3D 공동배양준비
<ol><li>여러 개의 멸균 된 4 웰 배양 플레이트를 층류 후드에 놓고 1.12.2-1.12.6 단계에서 이전에 표시된 바와 같이 콜라겐 작업 혼합물을 준비합니다.</li>
	<li>하이드로겔 혼합물의 15-20 μL을 웰 의 바닥에 놓고 원형 콜라겐 베이스를 생성합니다. 나머지 웰에 대해 이 단계를 반복합니다. 하이드로겔 염기에서 과도한 액체 증발을 방지하기 위해 5 개 이상의 플레이트를 동시에 준비하지 마십시오.</li>
	<li>완전한 겔화 (± 15-20 분)가 관찰 될 때까지 인큐베이터에 접시를 보관하고 겔화가 완료 된 경우에만 인큐베이터에서 접시를 꺼냅니다. 겔화 된 콜라겐의 품질을 확인하십시오.</li>
	<li>작은 COS1 셀 골재조각을 파이펫으로 옮김으로 옮김을 옮겼습니다. 하이드로겔 베이스에 놓고 하나의 배전 크기로 세포 골재에 가까운 피펫으로 조직 조각을 동일한 베이스에 놓습니다.</li>
	<li>1.12.2-1.12.6 단계에서와 같이 얼음에 새로운 작동 콜라겐 혼합물을 준비하십시오.</li>
	<li>이 새로운 혼합물의 15-20 μL을 부드럽게 피펫하고 배전 및 세포 골재를 덮는다. 샌드위치 와 같은 하이드로 겔 배양이 관찰됩니다. 이 순간, 미세 텅스텐 바늘로 이식을 다시 배향 (COS1 세포 골재를 만지지 마십시오!), 그래서 ± 500-600 μm에서 세포 집계에 직면.</li>
	<li>겔화가 관찰될 때까지 플레이트를 인큐베이터로 되돌려(±10-15 분), 완전한 NCM의 0.5 mL을 2% B27 보충제로 보충하고 인큐베이터에서 36 내지48시간 동안 배양을 유지한다(37°C, 5% CO2).</li>
</ol>5. 이식 세포 골재 공동 배양 및 면역 세포 화학 절차의 고정
<ol><li>36-48시간 의 배양 후, 배지를 제거하고 0.1 M 인산완충식염수(PBS), pH 7.3으로 헹구었다. 그 후, 4°C에서 0.1 M 인산완충(PB), pH 7.3에서 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 배양체를 고정한다.</li>
	<li>고정제를 제거하고 0.1 M PB, pH 7.3에서 배양액을 3-4회(각 10-15분)로 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>하이드로겔 샌드위치를 주걱이나 집게로 우물 바닥에서 분리합니다. 0.1 M PBS를 함유한 6웰 배양 플레이트에 0.5% 비이온성 세제를 함유한 미세 페인트브러시로 콜라겐 블록을 옮김을 옮김.</li>
	<li>완만한 교반을 가진 RT에서 2-3시간 동안 차단 용액에 자유 부유 하이드로겔(10% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제, 0.2% 젤라틴 0.2% 0.2% +0.1 M PBS)을 배양하였다.</li>
	<li>0.1 M PBS로 3회(각각 10-15분)를 헹구고 0.5% 비이온계면활성제를 함유하였다.</li>
	<li>5% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제, 0.2% 젤라틴 및 0.02% 아지드 나트륨을 함유하는 PBS에서 희석된 원발성 항체와 배양한다. 쉐이커상에서 4°C에서 36-48시간 동안 1차 항체와 배양한다. 참고: 일반적으로 III β-tubulin 클래스(α-TUJ-1)(희석된 1:2,000)에 대하여 항체는 3-D 하이드로겔 배양물에서 축산 성장을 정의하기 위하여 이용된다.</li>
	<li>배양 후 5.5 단계에서와 같이 헹네하십시오.</li>
	<li>RT에서 4 시간 동안 이차 항체와 배양 (또는 6-7 h 에서 4 °C) 쉐이커에 5 % 혈청, 0.5 % 비 이온 계면 활성제 및 0.2 % 젤라틴을 희석시켰다. 이 실험에서 말 항마우스 생체항체(희석1:200)가 사용된다.</li>
	<li>5.5에서와 같이 헹위합니다.</li>
	<li>아비딘-비오틴 복합체(ABC) 용액1:100을 5% 혈청, 0.5% 비이온 계면활성제 및 0.2% 젤라틴을 함유하는 PBS에서 희석하여 4°C에서 2일 동안 배양하였다. 또는 고추냉이 과산화아제(HRP)-태그가 붙은 스트렙타비딘(희석 1:300-400)을 동일한 완충액으로 사용하십시오.</li>
	<li>5.5에 기재된 바와 같이 헹위합니다.</li>
	<li>0.1 M 트리스-HCl 버퍼, pH 7.6 을 1시간 동안 배양액을 여러 번 헹급한다.</li>
	<li>0.1 M 트리스-HCl, pH 7.6에서 3,3′-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 용액의 0.03%로 배양한다.</li>
	<li>1% H2O2의 5-8 μL을 추가하고 10-15 분 기다립니다. 4-10x 목표를 사용하여 현미경으로 DAB의 발달을 모니터링하십시오.</li>
	<li>0.1 M Tris-HCl 버퍼, pH 7.6으로 DAB 용액을 제거하여 반응을 멈춥시다.</li>
	<li>30분 동안 PBS에서 배양을 헹구고(여러 가지 변경).</li>
	<li>하이드로겔을 수성 기반 마운팅 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다.</li>
	<li>Sholl 분석 플러그인 또는 ImageJ 소프트웨어(30)에 대한 NeuriteJ 플러그인을 사용하여 하이드로겔내부의 축산의 길이 및 분포를 분석한다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

개발 축색의 성장은 주로 침략적이며 ECM 분해 및 리모델링을 포함합니다. 여기에 제시된 절차를 사용하여, 연구원은 축세포 (또는 세포)가 생체 내에서와 같이 유전자 변형 세포에 의해 분비되는 화학 구배에 반응할 수 있는 천연 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 균질한 3-D 매트릭스를 얻을 수 있다. 매력적이거나 억제 큐(단백질, 지질 등)의 구배에 대한 상이한 축삭 반응은 특정 대조군(모의 형질감염 세포)과 쉽게 비교될 수 있다. 장점으로, 우리는 힘줄을 분리하기 쉽고 실제로 그들은 동물 실험의 잔재가 될 수 있음을 언급해야합니다. 또한, 힘줄은 피부 나 폐(31)와같은 다른 조직에 비해 고농도의 콜라겐이다.
여기에 제시된 방법론은 수행하기가 간단하지만 프로세스 중에 특별한 주의가 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. 콜라겐 추출과 관련하여, 콜라겐 순도와 겔화의 질을 향상시키기 위해 꼬리 힘줄에서 원치 않는 혈관과 피부 이물질을 제거하는 것...

축축액으로 끝나는 뉴런 축은 배아의 세포외 매트릭스(ECM)를 통해 장거리를 이동하여 특정 경로를 통해 적절한 목표에 도달합니다. 상기 성장원뿔은 축속액의 원위부분이며 세포1,2의물리적 및 분자환경을 감지하는 데 특화되어 있다. 분자 관점에서, 성장 콘은 적어도 네 개의 다른 분자 메커니즘에 의해 유도된다: 접촉 매력, 화학 매력, 접촉 반발, 및 다른 축색 유도 큐에 의해 트리거 된 chemorepulsion3,4 , 5개 , 6.접촉 매개 공정은 마이크로 패턴 기판에서 2차원(2D) 배양으로 부분적으로 모니터링할 수 있습니다(예: 줄무늬 7,8 또는 분자를 포함하는 스폿 9). 그러나, 축세포는 환경 4,5,10에서가이드포스트 세포로부터 여러 매력적이고 반발성 분자를 감지함으로써 비확산 방식으로 그들의 표적을 탐색할 수 있다. 여기에서, 우리는 분비된 분자가 축산 개발에 chemorepulsive 또는 chemo매력적인 효력을 유도하는지 검사하는 3-D 문화의 쉬운 방법을 기술합니다.
초기 연구는 3차원(3-D) 행렬에서 배양 배양을 이용한 축삭 유도 큐의 효과를 확인하기 위한 것으로, 생체 조건에서 시뮬레이션하는 그라데이션을 생성하기 위해11,12. 이 접근법은 생체 내 실험과 함께, 네가지 주요 가족인 네 가지 주요 가족인 네트린, 슬릿, 세마포린스 및 에프린4,5,6의식별을 허용하였다. 이러한 분자 큐 및 기타 인자(13)는 성장하는 축색에 의해 통합되어, 접착 복합체의 역학을 유발하고 세포골격14,15,16을통해 기계적 힘을 변환한다. 축삭 항법용 3-D 배양물에서 분자 그라데이션을 생성하기 위해, 선구적인 연구자들은 플라즈마 혈전 기판17을사용했으며, 이는 또한 organotypic 슬라이스 제제18에사용되었다. 그러나, 1958년, 3-D 콜라겐 하이드로겔을 생성하는 새로운 프로토콜은 Maximow의 장치19,배양 플랫폼으로 연구를 위해 보고되었으며, 현미경 관찰에 적합한 여러 연구에서 20. 또 다른 개척자 연구는 상처 치유 과정에서 섬유아세포의 분화를 연구하기 위한 인간 섬유아세포를 삽입하는 도구로서 콜라겐 겔을 보고했다21. 병행하여, Lumsden과 데이비스는 소 진피로부터 콜라겐을 적용하여 감각 신경 섬유22의유도에 대한 신경 성장 인자(NGF)의 가증효과를 분석하였다. 다른 회사 및 실험실에 의한 새로운 배양 플랫폼(예: 다중 웰 플레이트)의 개발로, 콜라겐배양은 이러한 새로운 장치 6,23,24,25에 적용되었다. ,26. 병행하여, 엥겔브레스-홀름-스웜 종양 세포주에서 유래된 ECM 물질의 추출물이 이들 연구를 확장하기 위해 시판되었다27.
최근에는 3D 하이드로겔(예: 콜라겐, 피브린 등)을 사용하여 축세포 유도에 가제적 역할을 하는 분자 구배를 생성하기 위한 여러 프로토콜이 개발되었습니다. 28.대안적으로, 후보 분자는 다공성 매트릭스(예를 들어, NGF29)에서상이한 농도로 고정화될 수 있거나 또는 3-D 하이드로겔 세포 응집체의 작은 영역에서 배양하여 생성된 분자를 분비하여 방사형을 생성할 수 있다. 그라데이션 4,23,24,25,26. 마지막 가능성은 이 프로토콜에 설명됩니다.
여기에 제시된 절차는 배아 마우스 뇌의 3-D 하이드로겔 배양에서 축색 성장의 분석을 기반으로 쉽고 빠르며 매우 재현 가능한 방법입니다. 다른 방법과 비교하여, 프로토콜은 훈련되지 않은 연구자에게 적합하며 짧은 훈련 (1-2 주) 후에 완전히 개발 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 먼저 유전자 변형 세포 응집체가 배아 신경 조직 의 앞에 배양되는 3-D 행렬을 생성하기 위하여 성숙한 쥐 꼬리에서 교원을 격리합니다. 이 세포 응집체는 성장하는 축색에 대한 반응을 유도하는 후보 분자의 방사형 화학 구배를 형성합니다. 마지막으로, 성장하는 축색에 대한 분자의 효과에 대한 평가는 상 대비 현미경 또는 대안적으로 면역 세포화학적 방법을 사용하여 쉽게 수행될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Adult Sprague-Dawley rats (8-9 weeks)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>B27 무혈청 보충제 50x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) 단백질 분석 키트</td>, <td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 플라스미드 벡터,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS1 세포주</td>, <td>ATTC</td><td>CRL-1570</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>Sigma</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스(물 내 45% 용액) 완전한 Neurobasal 배지</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>COS1 배양 배지용 D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x )</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 10x (Ca2+ 및 Mg2++) (D-PBS) 배양을 위한</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>머크</td><td>108543</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 이수화물 디소듐 염 (EDTA)</td><td>시그마</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>형광 장착 매체 (예: Fluoromount-G 또는 유사)</td><td>전자 현미경 과학 (EMS)</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 분말&nbsp;</td><td>시그마</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>빙초산 (Panreac, cat. no. 211008)</td><td>Panreac</td><td>211008</td><td></td></tr><tr><td>Hank' S 균형 잡힌 소금 용액&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>24020083</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 말 세럼&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 (H2O2, 물 중 32 - 33%)</td><td>완전한</td><td></td> Neurobasal 및 COS1 배지용 Sigma 316989 <td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM 용액 (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>임산부 암컷 생쥐 (배아 일 12.5 - 16.5; E12.5-16.5)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수정된 최소 필수 매체 독수리 (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Class III &beta;-tubulin (clone TUJ-1)</td><td>Biolegend</td><td>801201</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제 100x에</td> 대한 단클론 항체;<td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Merck</td><td>1,040,051,000</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-22</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 10x (PBS) 면역세포화학을 위한</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>이차 항체: 바이오틴화된 말 항-마우스&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>무혈청 매체 (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨&nbsp;</td><td>Panreac</td><td>162712</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨 용액 7.5%&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>멸균 배양 등급 H2O&nbsp;</td><td>시그마</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>트리톤TM X-100&nbsp;</td><td>시그마</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 큰 곡선 가위와 1개의 작은 곡선 가위;</td><td>정밀한 도구 기구 또는 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 원뿔형 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Eppendorf 또는 이와 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Corning 또는 이와 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2개의 지혈제&nbsp; &nbsp;</td><td>세밀한 도구 기구 또는 유사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2개의 작은 직선 해부 가위</td><td>고급 도구 기구 또는 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mL 원심분리 튜브, 원심분리용</td><td>Nalgene 또는 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mL 멸균 유리 원뿔형 플라스크,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 L 유리 비커</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>4- 및 6-웰 배양 플레이트&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740 및 140675</td><td></td></tr><tr><td>자동 피펫 펌프 및 일회용 10 mL 및 25 mL 필터 함유 멸균 플라스틱 피펫.</td><td>Gilson, Brand, Eppendorf 또는 이와 유사&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 피펫, 멸균 필터 팁 및 최신 멸균 팁&nbsp;</td><td>Gilson, Eppendorf 또는 이와 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>각도 고정 로터가 있는 벤치 탑 마이크로 원심분리기&nbsp;</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter 또는 이와 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 로터가 있는 벤치탑 냉장 원심분리기(1.5, 15 및 50 mL 튜브 어댑터 포함)</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter 또는 이와 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터(37 &deg); C, 5% CO2 및 95% 공기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙 셀룰로오스 막</td><td>Sigma</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙 클로저&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z37101-7</td><td></td></tr><tr><td>일회용 유리 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>암시야 광학이 있는 해부 현미경&nbsp;</td><td>Olympus SZ51 또는 동급&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고속 냉장 Beckman Coulter 원심분리기 또는 이와 유사한 각도 고정 로터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>대형 100 mm, 60 mm 및 소형 35 mm &Oslash; 세포 배양 접시&nbsp;</td><td>수녀</td><td>&nbsp; 150679, 150288, 150318, 각각</td><td></td></tr><tr><td>자석 교반기 및 자석 스핀 바</td><td>IKA 또는 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain 조직 초퍼</td><td>Mickle Laboratory Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>한 쌍의 세밀한 직선 집게와 한 쌍의 곡선형 집게&nbsp;</td><td>정밀 도구, 기구 또는 이와 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>것, 조직 다지기</td><td></td><td></td><td></td>용 면도날,</tr><tr><td>메스(15번 및 11번),</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>콜라겐 및 조직 조각을 옮기기 위한 두 쌍의 미세한 주걱</td>, <td>고급 도구, 기구 또는 이와 유사한</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 것

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-d 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

이 프로토콜은 자연타입 I 콜라겐을 사용하여 축산 성장을 모니터링하고 분석하기 위한 3차원(3-D) 하이드로겔을 생성합니다. 프로토콜은 쥐 꼬리 힘줄 유래 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 3-D 하이드로겔 내부에 배아 또는 초기 산후 설치류 뇌의 작은 조각을 배양하는 데 중점을 두고 있다. 조직 조각은 하이드로겔 내부에서 배양되고 다공성 매트릭스 내부의 그라데이션을 생성하고 분자를 분비하기 위해 특정 뇌 단편 또는 유전자 변형 세포 응집체에 직면한다. 이 프로토콜의 단계는 간단하고 재현 가능하지만 개발 중에 신중하게 고려해야 할 중요한 단계를 포함합니다. 더욱이, 성장하는 축세포의 거동은 면역세포화학적 방법에 의한 고정 후 상 대비 현미경 또는 모노/다광자 형광 현미경을 사용하여 직접 모니터링하고 분석할 수 있다.

여기에서, 우리는 배아 마우스 신경계의 3-D 하이드로겔 콜라겐 배양에서 축색 성장을 연구하기 위하여 널리 접근가능한 방법론을 제시합니다. 이를 위해, 우리는 괴수의 쥐 꼬리로부터 콜라겐을 분리하여 배아 뉴런 조직(예를 들어, 해마의 CA 영역)과 대면한 Netrin-1 또는 Sema3E를 발현하는 유전자 변형 세포 응집체를 배양하는 3-D 매트릭스를 생성하였다. 이들 세포 응집체는 콜라겐 매트릭스 내부에 후보 분자의 방사형 분포구배를 형성하였다. 마지막으로, 상이한 분자에 대한 뉴런 반응을 평가하기 위해, 우리는 면역세포화학적 방법(예를 들어, α-TUJ-1)을 사용하여 배양을 표지하고 간단하고 쉬운 정량화 방법을 적용하여, 퍼팅의 효과를 결정하기에 충분한 데이터를 획득하였다. 축색 행동에 후보자.
우리의 실험에서, 해마 축색이 Netrin-1에 직면했을 때, 이 축색은 Netrin-1의 근원을 향해 우선적으로 성장했는데, 이는 네트린-1이 이 축산에 대한 화학적 매력적인 분자...

여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

이 방법은 신경 시스템 개발 중 축 상 안내 및 신경 이동에서 일부 분자의 역할을 분석 하기 위해 유용. 이 기술의 주요 장점은 결과의 분석이 빠르고 간단하며 연구원을위한 많은 교육을 암시하는 복잡한 소프트웨어가 필요하지 않다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실과 나 자신에서 기술자 인 Mirian Segura-Feliu가 될 것입니다.플레이트(200)를 시작하기 위해, 000 COS-1 세포는 35mm 페트리 접시로 배양하고 세포 배양 인큐베이터에서 완전한 배양 배지를 배양하여 하룻밤 사이에 70~80%의 인플루언스를 판독한다. 다음 날, 지방성 기반 형질 전환 방법을 사용하여 후보 분자를 코딩하는 DNA를 가진 COS-1 세포를 횡단한다. 먼저 혈청 프리 배지 250 마이크로리터와 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 1~2마이크로그램 DNA를 혼합하고 실온에서 5분간 배양합니다.리포소말 튜브를 준비하려면 혈청 프리 배지 240 마이크로리터와 10 마이크로리터의 리포소말 트랜스펙트 시약을 추가하고 실온에서 5분간 배양합니다. 잠복 후, 입술 관에 DNA 튜브의 함량을 추가합니다. 실온에서 15분간 부드럽게 혼합하고 배양합니다.배양된 세포의 배지를 혈청 프리 배지의 1.5 밀리리터로 교체한다. DNA 리포솜 혼합물을 천천히 추가하고 세포에 현명하게 떨어뜨립니다. 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한다.인큐베이션을 완료한 후 배지를 완전한 배양 매체로 교체하고 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 0.1 어금니 덜벡코의 PBS로 세포를 헹구는 다. 각 접시당 800개의 마이크로리터 트립신 EDTA를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터에 5~15분 동안 배양합니다.완전한 배양 배지의 2밀리리터를 가진 분리된 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 수집하고 동일한 배지의 10밀리리터를 추가합니다. 원심 분리는 5 분 동안 130 배 g에서 섭씨 4도에서 세포를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 얼음에 COS-1 세포를 포함하는 펠릿을 보존합니다.콜라겐 작동 혼합물을 준비한 후, 콜라겐 혼합물의 100~150마이크로리터를 트랜스감염된 세포의 펠릿에 넣고 위아래로 배관하여 부드럽게 섞는다. 콜라겐 세포 펠릿 혼합물의 45 내지 50 마이크로리터를 35mm 페트리 접시에 퍼뜨리면 약 1 내지 1.5센티미터 길이의 콜라겐 세포의 균일한 밴드를 형성한다. 젤레이션이 관찰될 때까지 인큐베이터에 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 놓습니다.제2 배양 접시에 제어 세포를 포함하는 두 번째 스트립을 준비하고 인큐베이터에 놓습니다. 겔화가 완료되면, 겔화 콜라겐 세포 스트립을 포함하는 각 접시에 3-4 밀리리터를 37섭씨 37도 의 완전한 COS-1 완전한 배양 배지를 추가하고 인큐베이터에 놓습니다. 미세 한 메스 또는 조직 헬기를 사용하여 콜라겐 세포 스트립을 잘라 작은 사각형 조각, 길이 400 ~ 500 마이크로 미터를 생성합니다.동일한 경질 상태에서 모든 섹션을 뉴런 배양 배지의 3~3.5밀리리터를 함유한 페트리 접시로 옮는다. 해부 현미경으로 조각의 품질을 확인하고 인큐베이터에 요리를 배치하십시오. 가위를 사용하여 배아 날에 배아 뿔을 절단 16.5 희생 임신 한 여성 쥐의 복강에서 그들을 차가운 HBSSg 버퍼를 포함하는 큰 페트리 접시에 배치.라미나르 플로우 후드에 접시를 놓고 직선 집게를 사용하여 배아를 추출하고 차가운 HBBSg가 함유 된 새로운 접시에 넣습니다. 작은 집게로 피부를 제거한 다음 곡선과 직선 집게로 조심스럽게 뇌를 해부하고 차가운 HBSSg가 함유 된 접시에 넣습니다. 해부 현미경에서, 메스 또는 미세 가위를 사용하여, 두 반구를 분리하는 중간 라인을 따라 반으로 뇌를 잘라.그런 다음, 디엔셀론과 미세 한 집게로 제거, 뇌 조각에서 수막과 혈관을 제거. 100% 에탄올을 사용하여 티슈 헬기의 모든 부분, 특히 PTFE 절단 플레이트와 면도날의 모든 부분을 청소하고 15 분 동안 UV 조명 아래 라미나르 플럭스 후드에 조직 헬기를 유지합니다. 각 티슈 조각을 티슈 헬기의 절단 판으로 옮기다.조직을 다진 후, 완전한 NCM의 3 ~ 4 밀리리터로 가득 35 밀리미터 페트리 접시에서 조각을 전송합니다. 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 완전한 NCM에서 조직 해부를 완료하십시오. 해부 현미경하에서 얻은 조각의 품질을 확인하여, 층이 어두운 필드 광학에서 명확하게 식별 할 수 있는지 확인하고 텅스텐 바늘로 관심 영역을 해부하십시오.이산화탄소 인큐베이터에서 완전한 NCM 배지에 좋은 품질의 조각을 보관하십시오. 시각적 데모는 단어를 용이하게 하는 공동 문화권 준비와 관련된 단계에서 중요합니다. 여러 멸균 4 개의 잘 배양 플레이트를 라미나르 흐름 후드에 넣고 이전과 같이 콜라겐 작동 혼합물을 준비합니다.하이드로겔 혼합물15~20마이크로리터를 각 웰의 바닥에 첨가하여 원형 콜라겐 베이스를 생성합니다. 완전한 젤레이션이 관찰 될 때까지 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 그리고 겔화 콜라겐의 품질을 확인합니다.파이펫을 사용하면 하이드로겔 베이스에 COS-1 셀 골재의 작은 조각을 옮은 다음 파이펫을 사용하여 동일한 베이스에 조직 조각을 배치하고, 하나의 절제 된 크기의 거리에서 집계되는 세포의 조각에 가깝습니다. 얼음에 새로운 작업 콜라겐 혼합물을 준비 한 후, 부드럽게 이 새로운 혼합물의 15 ~ 20 마이크로 리터를 피펫하여 엑사플랜트와 세포 골재를 덮어 하이드로겔 배양과 같은 샌드위치를 만듭니다. 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 500 ~ 600 마이크로 미터의 세포 골재에 직면하도록 식소를 재배치하십시오.젤레이션이 관찰될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 반환한 다음 2%B27 보충제로 보충된 완전한 NCM의 0.5 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에서 36~48시간 동안 배양을 유지합니다. 해마 축축이 Netrin-1에 직면했을 때 Netrin-1의 근원을 선호하게 성장시켰으며, 이는 Netrin-1이 이 축축을 위한 화학 요법 매력적인 분자역할을 한다는 것을 나타냅니다. 제어 조건 또는 모의 형질전환에서 모든 축축은 방향 적 선호없이 빛날 정도로 증가했습니다.해마 축축이 세마3E 분비 세포와 마주쳤을 때, 그들 대부분은 세포 골재의 반대로 성장하여 Sema3E가 이 축종을 위한 화학 요법 분자로 작용한다는 것을 나타냅니다. 축 축 반응 및 정량화 방법의 이러한 회로도 표현은 제어 조건에서 축축이 방사형 아웃성장과 함께 표시된 근위 및 단발 사분면 모두에서 균등하게 분포되었다는 것을 보여줍니다. 이것은 하나의 근위 실산 또는 PD 비율을 나타냈다.이출시 약탈에 비해 근해 사분면에서 축삭의 수가 증가하여 화학요법을 나타내는 경우, PD 비율이 하나 이상이었다. 축축물의 수가 근면에서보다 탈구 사분면에서 높았을 때, 화학요법을 나타내는 PD 비율은 1개보다 낮았다. 이 방법에 따라, 연구원은 우리가 기능을 더 탐구하는 출발점을 확립 할 수 있도록 신경 발달 중 일부 분자의 역할에 대한 필수 정보를 얻을 수 있습니다.이 기술은 이기와 같이 신경 발달에 유용하더라도, 그것은 또한 전략으로 약리학 검열, 혈관 신생 및 조직 공학에 적용될 수 있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

방법은 콜라겐 유형 I 및 기본 인간 섬유 아세포로 구성된 3 차원 매트릭스의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 이 조직 기질의 기본 기능을 모방하고 현미경의 여러 형태의 의무이기 때문 organotypic 젤은 침입 세포 마이그레이션을 평가하는 유용한 기판 역할을합니다.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

우리는 병아리 E4 statoacoustic 신경절 및 E6 척수의 explants을 해부하다 문화하는 방법을 보여줍니다. Explants는 24 시간 동안 3D 콜라겐 젤의 혈청 무료 조건에서 양식입니다. Neurite 대응은 성장 인자 - 보충 매체와 단백질 코팅 비즈와 함께 테스트됩니다.

Neurite 가지의 Assays에 대한 해부와 칙 Statoacoustic 신경절과 콜라겐 젤에서 척수의 Explants의 문화

midbrain의 도파민 시스템과 striatum에서 Explants가를위한 콜라겐 매트릭스 분석에...

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

이 동영상은 하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 3차원 성상세포 골격을 생성하는 방법을 보여줍니다. 미세기둥의 내부는 콜라겐으로 코팅되어 있습니다. 성상세포(astrocyte)가 도입되어 콜라겐에 부착하고 추가 배양을 통해 3차원 골격으로 자가 조립됩니다.

하이드로겔 마이크로 컬럼 내에서 성상세포 스캐폴드를 생성하는 In Vitro 방법

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

뇌의 복잡한 행동에 대한 통찰력을 얻으려면 고급 연구 도구가 필요합니다. 여기에서 우리는 뇌와 유사한 구조를 닮은 신경 조직의 새로운 실크-콜라겐 기반 3D 엔지니어링 모델을 보여줍니다. 이 모델은 뉴런 네트워크 조립, 축삭 유도, 세포-세포 상호 작용 및 전기 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

이 원고에서 우리는 말초 조직 공학에 사용하기 위해 그래핀을 함유하는 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 제조를 시연합니다. 이 3D 바이오 하이브리드 재료를 사용하여 줄기 세포의 신경 분화 프로토콜이 수행됩니다. 이것은 유사한 생체 재료를 클리닉에 가져 오는 중요한 단계가 될 수 있습니다.

말초 신경 공학을 위한 그래핀 기반 3D 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 준비 및 특성화

이 프로토콜은 3D 콜라겐 하이드로겔(두께 &lt;250μm)에서 섬유를 정렬하기 위해 확장 변형(스트레칭)을 생성하기 위해 유체 흐름 방향을 따라 기하학이 변화하는 미세유체 채널의 사용을 보여줍니다. 결과 정렬은 수 밀리미터에 걸쳐 확장되며 연신 변형률의 영향을 받습니다.

Microengineering 3D 콜라겐 하이드로겔(장거리 섬유 정렬 포함)

배우세요 3D 콜라겐 하이드로겔에서 축산 성장과 신경 이동을 분석하는 방법을 COS-1 세포와 태아 뇌 조직을 이용하여. 이 기법은 분자 신호가 축산 행동에 미치는 영향을 빠르고 간단하게 관찰할 수 있어 신경발달 연구에 필수적입니다.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

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