Name: 비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 배우세요 비환원 SDS-PAGE와 화학적 가교결합을 이용하여 포유류 세포에서 이황화물로 안정화된 다이성체 복합체를 검출하는 방법을. 이 기술은 단백질 구조 연구에 효과적입니다.

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이 원고를 편집 하는 데 도움이 되는 모든 노력을 dUTPase 다 클론 항 체와 Kerri Ciccaglione의 정화를 위해 제니퍼 피셔 박사에 게 전 하는 노력에 감사 드립니다. 이 연구는 뉴저지 보건 재단의 보조금으로 부분적으로 지원 되었습니다 (보조금 #PC 11-18).

1. Iodoacetamide를 사용 하 여 무료 시스테인 잔류물을 차단
<ol><li>Conﬂuency OS 세포를 6cm2 접시에서 50% ~ 60%로 성장 시킵니다. 5% co2에서 37 ° c에서 10% 태아 소 혈 청 및 1% 나트륨 피 루브 산은을 함유 하는 고 혈당의최소 필수 배지.</li>
	<li>사용 직전에 10mm iodoacetamide의 신선한 스톡을 만든 다음 미사용 시 약을 버리십시오.</li>
	<li>세포 배양 배지에 직접 0.1 mM 최종 농도 iodoacetamide 추가 합니다. 접시를 실 온에서 2 분간 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
</ol>2. 세포 수확
<ol><li>세포에서 미디어를 흡입 합니다.</li>
	<li>5 mL의 차가운 인산 완충 식 염 액 (PBS)을 3 번 사용 하 여 세포를 세척 합니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡입 한 다음 차가운 PBS 1 mL을 추가 합니다.</li>
	<li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시 바닥에서 세포를 긁어 냅니다. 1 mL 파이 펫을 사용 하 여 PBS 및 세포 현 탁 액을 만들고 모든 액체를 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 분배 합니다.</li>
	<li>4 ° c에서 3 분 동안 7500 x g 에서 세포를 회전 시킵니다. 세포 펠 릿 뒤에 두고 PBS를 흡입. 세포 펠 렛은 처리 될 때까지-80 ° c에서 저장 될 수 있습니다</li>
</ol>3. 단백질의 추출
<ol><li>DdH 2o에서 희석 된 1x 용 해 완충 액의100 µ l을 준비 하십시오 ( 재료 표참조). 사용 직전에 phenylmethylsulfonyl 불 화물 (PMSF)을 1mm 최종 농도로 추가 하십시오.</li>
	<li>1x 용 해 완충 액의 50 µ L을 세포 펠 렛에 직접 추가 하 고 일시 중단 합니다. 얼음 위에 5 분간 배양 합니다.</li>
	<li>40%에서 일정 한 펄스 모드를 사용 하 여 8 초 동안 초음파 처리 (초음파 분쇄기에 대 한 재료 표 참조) 얼음에 추출 물을 유지, 다른 sonicators에 대 한 필요에 따라 조정 합니다.</li>
	<li>16000 x g에서 5 분 동안 4°c에서 추출 물을 회전 시킵니다. 상 등 액은 가용성 단백질 분 획 물 이다. 브래드포드 분석은 원하는 경우 단백질 농도를 결정 하기 위해 수행 될 수 있다.</li>
</ol>4. 샘플 준비
<ol><li>가용성 단백질 추출 물의 10 µ L을 복용 하 여 1x Laemmli SDS-PAGE 버퍼에 10 µ L을 첨가 하 고 0.004%의 브로 모 페 놀 청색 및 0.125 M 트리 스-HCl, pH 6.8). 환 원 시 약을 첨가 하지 마십시오.</li>
	<li>그 날 SDS 페이지 분석이 수행 됩니다 경우 얼음에 샘플을 유지; 장기 보관의 경우-20°c가 적합 합니다. 젤을 실행 하기 직전에, 85 ° c에서 5 분 동안 샘플을가 열 하십시오.</li>
</ol>5. 생체 내 내 생 단백질의 포름알데히드 가교-2 OS 세포
<ol><li>Conﬂuency OS 세포를 175에서 70 ~ 80% 의 플라스 크로 성장 시키십시오 (섹션 1 참조).</li>
	<li>
포름알데히드 가교 반응을 수행
	<ol>
<li>연기 두건에서, 분 취 액는 상업적인 근원에서 구입 된 37% 포름알데히드 해결책입니다. 포 름 알 데히드를 배지에 직접 첨가 하 여 ﬁnal 농도 1%로 하 고 실 온에서 15 분간 부드럽게 교 반 하 여 배양 한다.</li>
		<li>반응을 해소 하기 위해, 1.25 M 글리신을 0.125 M의 최종 농도에 추가 하 고 5 분 동안 로커에 부드러운 동요와 함께 실 온에서 배양 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL의 차가운 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. 최종 PBS 세척 용액을 흡입 하 고 10 mL의 PBS를 추가 합니다. 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 플라스 크의 바닥에서 세포를 긁어 냅니다.</li>
	<li>10ml의 파이 펫을 사용 하 여 PBS 및 세포 현 탁 액을 그리고 모든 액체를 15ml 원추형 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 500 x g 에서 4 ° c에서 2 분 동안 세포를 회전 시킵니다. 세포 펠 릿 뒤에 두고 PBS를 흡입.</li>
</ol>6. 핵의 분별
<ol><li>균질 화 완충 액 10ml를 준비 하십시오: 0.25 M 자당, 1mm EDTA, 10mm 헵, 및 0.5% BSA의 pH 7.4. 사용 직전에 PMSF를 추가 하 여 1mm 최종 농도와 3mL의 핵 서 스 펜 션 완충 액 (0.1%의 트리톤 X-100을 PBS에 첨가).</li>
	<li>5 mL 균질 화 완충 액을 세포 펠 렛에 직접 추가 하 고 완전히 중단 하십시오. 500 x g 의 현 탁 액을 4°c에서 2 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버립니다.</li>
	<li>5 mL의 균질 화 완충 액에서 펠 릿을 정지 시킵니다. 꼭 맞는 유리 테 플 론 균질 기를 사용 하 여 10 스트로크/500 rpm으로 세포를 균질 화 하십시오.</li>
	<li>1500 x g 에서 현 탁 액을 4°c에서 10 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버립니다. 참고: 10 분 동안 1만 x g 에서 원심 분리를 통해 미토 콘 드리 아를 분리할 때 상층 액을 사용 하십시오.</li>
	<li>1 mL 핵 서 스 펜 션 완충 액에서 펠 렛을 일시 중단 하 고 10 분간 얼음을 배양 합니다.</li>
	<li>600 x g 에서 원심 분리기를 10 분간 상층 액을 버리십시오.</li>
	<li>1 mL 핵 서 스 펜 션 완충 액으로 펠 렛을 정지 시키고 다시 원심 분리기. 상층 액을 버리십시오. 최종 펠 릿은 고립 된 핵이 될 것입니다.</li>
</ol>7. 단백질의 추출
<ol><li>1 배 용 해 완충 액의 25 µ L을 세포 펠 렛에 직접 추가 하는 것을 제외 하 고 4 절을 반복 하 여 현 탁 한다.</li>
</ol>8. 샘플 준비
<ol><li>각 가용성 단백질 추출 물 10 µ L을 복용 하 여 SDS-PAGE 용 샘플 2 개를 준비 하 고 2x Laemmli SDS 샘플 버퍼 10 µ을 추가 하 고 2 진단을 (BME)의 µ L을 첨가 합니다.</li>
	<li>37 ° c에서 5 분 동안 1 개의 샘플을가 열 하 고, 98 ° c에서 15 분 동안 제 2 샘플을가 하 여 포름알데히드 크로스 링크를 역전 시켰다.</li>
</ol>9. SDS 페이지 분석
<ol><li>1L(1l의 1 리터) 트리 스 글리신 실행 버퍼 (25mm 트리 스, 192 mM 글리신, 0.1%)를 준비 합니다.</li>
	<li>
SDS 페이지 실행 장치를 설정 합니다. 참고: 이 프로토콜은 16% 프리 캐스트 TGX SDS 페이지를 사용 합니다. 모든 백분율 젤을 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>제조업체 프로토콜에 따라 젤이 저장 된 패키지를 열고 카세트를 제거 하십시오.</li>
		<li>카세트 밑면에서 우물과 테이프를 감싸는 빗을 제거 하십시오.</li>
		<li>실행 장치에 젤을 놓습니다.</li>
		<li>우물이 액체에 잠길 때까지 1x 실행 버퍼로 챔버를 채 웁 니다. 플라스틱 파이프를 사용 하 여 실행 중인 버퍼로 우물을 헹 굽 니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 µ L prestained 표준 마커와 함께 젤에 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>젤의 바닥에서 약 1cm의 염료 전면이 될 때까지 200 V에서 젤을 실행 합니다.</li>
</ol>10. 웨스턴 블랏
<ol><li>1L의 1x 트랜스퍼 버퍼 (25mm 트리 스, 192의 글리신, 20% 메탄올)를 준비 하 고 사용 하기 전까지 4°c에서 보관 하십시오.</li>
	<li>조심 스럽게 젤을 제거 하 고 카세트를 엽 니. 면도기를 사용 하 여 스태킹 젤을 조심 스럽게 자르고 버립니다. 한 모서리를 사용 하 여 젤을 들고 전송 버퍼가 있는 트레이에 올려 놓고 5 분간 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>젤이 흔들 리는 동안 얼음 블록 (-20°c에 저장 된)을 이송 탱크에 넣고 전송 버퍼를 ¾ 전체에 추가 합니다.</li>
	<li>30 초 동안 100% 메탄올에 담가 폴 리 불 화물 (PVDF) 멤브레인을 적셔.</li>
	<li>5 분이 지나면 전송 버퍼가 있는 트레이에 전송을 설정할 준비를 합니다. 전송 버퍼는 블 럿을 완전히 서브 머지 하기에 충분 해야 합니다. 다음과 같이 블 롯 전송을 설정 합니다. 하단에서 카세트 홀더의 바닥 (검은색); 그런 다음 두꺼운 스폰지, 여분의 두꺼운 종이, 폴 리 아크릴 아 미드 젤, PVDF 멤브레인, 여분의 두꺼운 종이 및 두꺼운 스폰지; 그런 다음 마지막 카세트 홀더 (흰색)의 상단에.</li>
	<li>카세트를 잠그고 양극과 겔을 향해 PVDF 멤브레인을 음극 쪽으로 향하게 하 여 장치를 이송 탱크에 놓습니다. 전송이 완전히 잠길 때까지 전송 버퍼를 사용 하 여 장치를 맨 위로 끕니다.</li>
	<li>장치를 교 반 플레이트 위에 놓습니다. 장치에 교 반 막대를 추가 하 고 125 rpm에서 교 반을 시작 하십시오.</li>
	<li>60 분 동안 100 V에서 실행 하십시오.</li>
	<li>전송이 실행 되는 동안, 트리 스 완충 식 염 액에 용 해 된 5% 분말 우유 용액을 트윈-20, pH 7.5 (TBST)로 준비 하십시오.</li>
	<li>장치를 해체 하 고 멤브레인을 제거 하 고 어느 쪽이 젤과 접촉 했습니까? 나머지 단계를 위해이 측면이 용지함에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>트리 스 완충 식 염 수가 2 분 동안 멤브레인을 담근 다음, 실 온에서 30 분 동안 5% 우유 TBST 용액 5Ml를 배양 하 여 멤브레인을 차단 하였다.</li>
	<li>우유를 신선한 4 mL의 5% 우유 TBST 용액으로 교체 하 고 일차 항 체를 적절 한 희석 액에 첨가 하십시오 (이 경우, 우리의 희석은 dUTPase 항 체의 경우 1:2000 이며, 4 ° c에서 부드러운 락으로 밤에도 배양 됩니다.</li>
	<li>다음날, 4 ° c 로커에서 실 온 로커로의 블랏을 제거 하 고 1 차 항 체 용액을 폐기 한다.</li>
	<li>충분 한 액체를 사용 하 여 3 번의 세척, 5 분 각, 천천히 흔들 다음, 충분히 액상을 이용 하 여 TBST로 빠르게 세척 하십시오.</li>
	<li>마지막 세척 후 5% 우유 TBST 용액 5Ml를 추가 하 고 15 분 동안 블 롯을 흔들어 버린 다음 버리십시오.</li>
	<li>원하는 농도로 5% 우유 TBST에 희석 된 2 차 항 체를 추가 합니다. (이 경우, 1:5000 mL의 염소 항 토끼 희석 5% 우유-TBST 솔루션)</li>
	<li>1 시간 동안 흔들어 실 온에서 배양 한 후 용액을 버리십시오.</li>
	<li>그 다음에는 TBST로 세 번의 빠른 세척을 하 고 3 개의 세척을 5 분간 각각 천천히 흔들어 마지막 세척을 버리고 5 mL의 TBS를 추가 하십시오.</li>
	<li>1:1 혼합 된 ECL 화학 발광 검출 용액 (각 시 약 1 mL을 최종 부피 2ml)로 제조 하 고이를 1 분 동안이를 블 럿에 직접 첨가 한다.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 멤브레인을 제거 하 고 실험실 와이프로 모서리를 살짝 적셔 여분의 용액을 제거 하십시오. 멤브레인을 수축 랩에 놓고 단백질 면을 x 선 카세트에 올려 놓으십시오.</li>
	<li>멤브레인을 엑스레이 필름에 노출 시킵니다. 노출 시간은 다를 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 원고의 내용과 이해 상충이 없음을 선언 합니다.

여기에 설명 된 방법은 이황화 물 결합을 통해 안정화 된 다이 성체 복합체의 분석을 위한 바로 앞 프로토콜을 제공 한다. 이 프로토콜은 다른 세포 배양 라인, 조직 및 유기 체에 쉽게 적용 될 수 있어 광범위 한 응용 분야에 적합 합니다.
이 절차의 중요 한 단계는 이황화 물 연결이 추출 절차의 결과를 보장 하는 것입니다. 임의의 자유 시스테인 잔기는 iodoacetamide13을 사용 하 여 차단할 수 있다. 이 알킬화제 에이전트는 그들의 티 올 그룹 이더라도 시스테인 잔기에 공유 결합, 새로운 이황화 결합의 형성을 차단. 그러나,이 제제는 치료 시에 이황화 결합이 존재 하는 경우이를 방해 하지 않을 것 이다. Iodoacetamide의 최적화는 농도와 시간의 변화를 이용 하 여 수행 될 수 있다. 그러나이 시 약에 노출 되 면 세포가 사 멸 될 수 있습니다.
도움이 될 수 있는이 프로...

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 최근 작업에서, 이러한 결합은 가역 적 번역 후 변형으로 분류 되었으며, 시스테인 기반 "산화 환 원 스위치"로 작용 하 여 단백질 기능, 위치 및 상호작용의 변조를 허용 하는1,2, 3,4. 따라서,이 수정을 연구 할 수 있는 것이 중요 합니다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해5. SDS-PAGE 분석은 많은 실험실에서 사용 되는 기술로, 결과를 신속 하 고 쉽게 분석 하 고 최소한의 비용으로 해석 할 수 있으며 질량 분석기와 같은 이황화 물 결합을 식별 하는 데 사용 되는 다른 기술 보다 유리 합니다6 ,7 및 원형 중 크롬 산8.
이 방법이 연구에 도움을 주는 적절 한 기술 인지 결정 하는 한 가지 중요 한 단계는 시스테인 잔기 (들)이 존재 하는 것을 보장 하기 위해 관심 있는 단백질의 일차 서 열을 철저히 조사 하는 것 이다. 또 다른 유용한 단계는 게시 된 임의의 이전 결정 구조를 연구 하거나 생물 정보학 응용 프로그램을 사용 하 여 관심 있는 단백질의 3 차원 구조를 탐구 하 여 시스테인 잔기 (들)가 위치할 수 있는 곳을 가시화 하는 것 이다. 잔류물 (들)이 외부 표면 상에 존재 하는 경우에는 상기 구조의 내부에 묻혀 있는 시스테인 잔기가 아닌 이황화 결합을 형성 하는 것이 더 좋은 후보가 될 수 있다. 그러나 단백질이 기질 상호 작용 또는 단백질-단백질 상호작용에 따라 구조적 변화를 겪을 수 있으므로 이러한 잔류 물이 환경에 노출 될 수도 있다는 점에 유의 해야 합니다.
확인 된 다이 성체 복합체는 포름알데히드를 사용 하 여 화학적 가교 결합으로 확인 될 수 있다. 포름알데히드는 높은 세포 투과성 및 짧은 가교 범위에 기인한이 검증 기술에 대 한 이상적인 교차 링커입니다 ~ 2-3 Å, 특정 단백질-단백질 상호작용의 검출을 보장 하는9,10. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS11로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다. 그러나,이 프로토콜은 그밖 세포 선, 조직 및 유기 체를 위해 적응 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>16% 프리캐스트 TGX 젤</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 플라스크</td><td>셀 스타</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2 접시</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL 감지 키트</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>블롯 전달 장치</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 단백질 시약</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>세포 신호</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>세포 용해 완충</td><td>세포 신호</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 장치</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>매우 두꺼운 웨스턴 블로팅 페이퍼</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>유리 - 테프론 균질화 기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td>덴빌</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>헥스</td><td>시그마 알드리치</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>요오드 아세트 아미드</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>세포 신호</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Posi-click tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Prestained marker</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>세포 신호</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>소형 세포 스크레이퍼</td><td>Tygon</td><td>S-50HL 클래스 VI</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td><td>나트륨 Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>블로팅용 스폰지 패드</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris 완충 식염수, 트윈 20 포함, pH 7.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine 러닝 버퍼</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>X선 필름</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

비 환 원 sds-page 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

많은 단백질의 구조는 공유 이황화 결합을 통해 안정화 됩니다. 최근 작업에서,이 결합은 또한 번역 후 변형으로 분류 되었다. 따라서, 살아있는 세포에서 이러한 변형을 연구할 수 있는 것이 중요 하다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 포름알데히드 가교의 2 단계 방법을 통해 서 이다. 이러한 2 단계 방법은 그 기술적 용이성 및 낮은 운용 비용으로 인해 이황화 물 결합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 발굴 하는 첫 번째 단계로 서 유리 하다. 여기서, 인간 뼈 골 육 종 세포 주는 U-2 OS는 dUTPase의 핵이 소 형태를 구체적으로 분석 함으로써이 방법을 설명 하기 위해 사용 된다.

핵 dUTPase는 각각의 단량체 성 단백질 (11)의 제 3 아미노산에 위치 하는 두 개의 시스테인 잔기의 상호작용을 통해 안정한이 량 체 구성을 형성 하는 분 자간 디 설파 이드 결합을 형성할 수 있다. 이는 도 1a, B에 설명 되어 있다. 이 이황화 결합이 감소 된 환경에서 이주 이상으로 인 한 비 특이 적 상호작용을 보장 하기 위해, t는 적절 한 제어의 포함이 필수적 이었다. 핵 dUTPase은 인 간에 게 존재 하는 4 개의 isoforms 중 하나입니다. 4 개의 isoforms 중 3 개는 공통의 촉매 코어 (11,12)를 공유 하면서 고유한 아미노 말단 도메인을 가진다. 웨스턴 블 롯에서 볼 수 있듯이, 수확 시에 인간 세포...

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 고리에 의해 안정화 된 다중 이성질체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해 서 이다. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS 로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다.

비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

그것은 잘 많은 단백질의 구조는 공유 이황화물 연결에서 안정화되어 있음을 잘 확립하고있다. 최근 작업에서이 채권은 번역 후 수정으로 분류되었습니다. 따라서 빠르고 간단한 방법을 사용하여 살아있는 세포에서 시스테인 안정화 멀티머 복합체를 식별할 수 있어야 합니다.이 기술의 주요 장점은 결과를 얻을 수 있고, 쉽고, 최소 비용으로 해석할 수 있다는 것입니다. 우선, 최소 필수 중간 고당감의 6평방센티미터 접시에 U-2 OS 세포를 성장시키고, 10%의 FBS와 1%나트륨 피루바테를 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도로 보충한다. 사용하기 직전에 10 밀리마일라 요오도아세타미드의 신선한 육수를 만드십시오.세포가 50~60%에 도달하면 세포 배양 매체에 직접 0.1 밀리머 최종 농도 요오도아세타미드를 추가합니다. 실온에서 2분간 부드럽게 접시를 흔들어 주세요. 다음으로, 세포로부터 미디어를 흡인시키고, 차가운 PBS의 5밀리리터로 세포를 세 번 씻는다.최종 PBS 세척 용액을 흡인하고 차가운 PBS 1 밀리리터를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 1밀리리터 파이펫을 사용하여 PBS 및 셀 서스펜션을 작성하고 모든 액체를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 분배합니다.세포가 섭씨 4도에서 7, 500g에서 3분간 회전합니다. 세포 펠릿을 뒤로 하고 PBS를 흡입합니다. 세포 펠릿은 처리 될 때까지 영하 80도에서 저장할 수 있습니다.단백질을 추출하려면 이중 증류수로 희석된 1X 리시스 버퍼의 100마이크로리터를 준비합니다. 1 밀리머 최종 농도에 사용하기 직전에 PMSF를 추가합니다. 그런 다음 1X 용해 버퍼의 50 마이크로리터를 셀 펠릿에 직접 추가하고 다시 중단합니다.5 분 동안 얼음에 추출물을 배양. 일정한 펄스 모드를 사용하여 8초 동안 초음파 처리하여 40%의 속도로 추출물을 얼음 위에 유지합니다. 추출물을 섭씨 4도, 16, 000배에서 5분간 회전합니다.원하는 경우 단백질 농도를 결정하기 위해 브래드포드 분석을 수행합니다. 시료를 준비하려면 수용성 단백질 추출물의 10 마이크로리터를 채취하고 1X Laemmli SDS 샘플 버퍼의 10 마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.젤을 실행하기 전에 샘플을 섭씨 85도에서 5분간 가열합니다. 포름알데히드 교차 연결을 시작하려면 175 평방 센티미터플라스크에서 U-2 OS 셀을 70 ~80%의 연결성으로 성장시

combining-non-reducing-sds-page-analysis-chemical-crosslinking-to

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호...

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

캡처 화합물 사진 crosslinking 및 정화하여 다음 기능을 가역 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 의한 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 trifunctional 작은 분자 수 있습니다. 여기있는 캡처 컴파 운드를...

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

이 비디오는 조직 균질체에서 천연 단백질 복합체를 분리하기 위한 multimeric PAGE에 대해 설명합니다. 이 기술은 blue native-PAGE 및 SDS-PAGE 기술의 하이브리드입니다. 분리된 복합체는 세포 기능에서의 역할을 특성화하고 연구할 수 있습니다.

네이티브 단백질 복합체 분리를 위한 Multimer-PAGE: 조직 용해물에서 원형(intact) 멀티머 단백질을 분리하기 위한 블루 네이티브-PAGE와 SDS-PAGE로 구성된 하이브리드 분리 기법

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막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.

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이 논문은 비변성 PAGE와 웨스턴 블롯 분석의 조합을 사용하여 인간 세포의 용해물에서 다이나민 유사 GTPase MxA 단백질의 올리고머 상태를 평가하는 간단하고 빠른 프로토콜에 대해 설명합니다.

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본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

배우세요 비환원 SDS-PAGE와 화학적 가교결합을 이용하여 포유류 세포에서 이황화물로 안정화된 다이성체 복합체를 검출하는 방법을. 이 기술은 단백질 구조 연구에 효과적입니다.

비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

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