Name: 비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 배우세요 비환원 SDS-PAGE와 화학적 가교결합을 이용하여 포유류 세포에서 이황화물로 안정화된 다이성체 복합체를 검출하는 방법을. 이 기술은 단백질 구조 연구에 효과적입니다.

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이 원고를 편집 하는 데 도움이 되는 모든 노력을 dUTPase 다 클론 항 체와 Kerri Ciccaglione의 정화를 위해 제니퍼 피셔 박사에 게 전 하는 노력에 감사 드립니다. 이 연구는 뉴저지 보건 재단의 보조금으로 부분적으로 지원 되었습니다 (보조금 #PC 11-18).

1. Iodoacetamide를 사용 하 여 무료 시스테인 잔류물을 차단
<ol><li>Conﬂuency OS 세포를 6cm2 접시에서 50% ~ 60%로 성장 시킵니다. 5% co2에서 37 ° c에서 10% 태아 소 혈 청 및 1% 나트륨 피 루브 산은을 함유 하는 고 혈당의최소 필수 배지.</li>
	<li>사용 직전에 10mm iodoacetamide의 신선한 스톡을 만든 다음 미사용 시 약을 버리십시오.</li>
	<li>세포 배양 배지에 직접 0.1 mM 최종 농도 iodoacetamide 추가 합니다. 접시를 실 온에서 2 분간 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
</ol>2. 세포 수확
<ol><li>세포에서 미디어를 흡입 합니다.</li>
	<li>5 mL의 차가운 인산 완충 식 염 액 (PBS)을 3 번 사용 하 여 세포를 세척 합니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡입 한 다음 차가운 PBS 1 mL을 추가 합니다.</li>
	<li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시 바닥에서 세포를 긁어 냅니다. 1 mL 파이 펫을 사용 하 여 PBS 및 세포 현 탁 액을 만들고 모든 액체를 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 분배 합니다.</li>
	<li>4 ° c에서 3 분 동안 7500 x g 에서 세포를 회전 시킵니다. 세포 펠 릿 뒤에 두고 PBS를 흡입. 세포 펠 렛은 처리 될 때까지-80 ° c에서 저장 될 수 있습니다</li>
</ol>3. 단백질의 추출
<ol><li>DdH 2o에서 희석 된 1x 용 해 완충 액의100 µ l을 준비 하십시오 ( 재료 표참조). 사용 직전에 phenylmethylsulfonyl 불 화물 (PMSF)을 1mm 최종 농도로 추가 하십시오.</li>
	<li>1x 용 해 완충 액의 50 µ L을 세포 펠 렛에 직접 추가 하 고 일시 중단 합니다. 얼음 위에 5 분간 배양 합니다.</li>
	<li>40%에서 일정 한 펄스 모드를 사용 하 여 8 초 동안 초음파 처리 (초음파 분쇄기에 대 한 재료 표 참조) 얼음에 추출 물을 유지, 다른 sonicators에 대 한 필요에 따라 조정 합니다.</li>
	<li>16000 x g에서 5 분 동안 4°c에서 추출 물을 회전 시킵니다. 상 등 액은 가용성 단백질 분 획 물 이다. 브래드포드 분석은 원하는 경우 단백질 농도를 결정 하기 위해 수행 될 수 있다.</li>
</ol>4. 샘플 준비
<ol><li>가용성 단백질 추출 물의 10 µ L을 복용 하 여 1x Laemmli SDS-PAGE 버퍼에 10 µ L을 첨가 하 고 0.004%의 브로 모 페 놀 청색 및 0.125 M 트리 스-HCl, pH 6.8). 환 원 시 약을 첨가 하지 마십시오.</li>
	<li>그 날 SDS 페이지 분석이 수행 됩니다 경우 얼음에 샘플을 유지; 장기 보관의 경우-20°c가 적합 합니다. 젤을 실행 하기 직전에, 85 ° c에서 5 분 동안 샘플을가 열 하십시오.</li>
</ol>5. 생체 내 내 생 단백질의 포름알데히드 가교-2 OS 세포
<ol><li>Conﬂuency OS 세포를 175에서 70 ~ 80% 의 플라스 크로 성장 시키십시오 (섹션 1 참조).</li>
	<li>
포름알데히드 가교 반응을 수행
	<ol>
<li>연기 두건에서, 분 취 액는 상업적인 근원에서 구입 된 37% 포름알데히드 해결책입니다. 포 름 알 데히드를 배지에 직접 첨가 하 여 ﬁnal 농도 1%로 하 고 실 온에서 15 분간 부드럽게 교 반 하 여 배양 한다.</li>
		<li>반응을 해소 하기 위해, 1.25 M 글리신을 0.125 M의 최종 농도에 추가 하 고 5 분 동안 로커에 부드러운 동요와 함께 실 온에서 배양 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL의 차가운 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. 최종 PBS 세척 용액을 흡입 하 고 10 mL의 PBS를 추가 합니다. 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 플라스 크의 바닥에서 세포를 긁어 냅니다.</li>
	<li>10ml의 파이 펫을 사용 하 여 PBS 및 세포 현 탁 액을 그리고 모든 액체를 15ml 원추형 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 500 x g 에서 4 ° c에서 2 분 동안 세포를 회전 시킵니다. 세포 펠 릿 뒤에 두고 PBS를 흡입.</li>
</ol>6. 핵의 분별
<ol><li>균질 화 완충 액 10ml를 준비 하십시오: 0.25 M 자당, 1mm EDTA, 10mm 헵, 및 0.5% BSA의 pH 7.4. 사용 직전에 PMSF를 추가 하 여 1mm 최종 농도와 3mL의 핵 서 스 펜 션 완충 액 (0.1%의 트리톤 X-100을 PBS에 첨가).</li>
	<li>5 mL 균질 화 완충 액을 세포 펠 렛에 직접 추가 하 고 완전히 중단 하십시오. 500 x g 의 현 탁 액을 4°c에서 2 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버립니다.</li>
	<li>5 mL의 균질 화 완충 액에서 펠 릿을 정지 시킵니다. 꼭 맞는 유리 테 플 론 균질 기를 사용 하 여 10 스트로크/500 rpm으로 세포를 균질 화 하십시오.</li>
	<li>1500 x g 에서 현 탁 액을 4°c에서 10 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버립니다. 참고: 10 분 동안 1만 x g 에서 원심 분리를 통해 미토 콘 드리 아를 분리할 때 상층 액을 사용 하십시오.</li>
	<li>1 mL 핵 서 스 펜 션 완충 액에서 펠 렛을 일시 중단 하 고 10 분간 얼음을 배양 합니다.</li>
	<li>600 x g 에서 원심 분리기를 10 분간 상층 액을 버리십시오.</li>
	<li>1 mL 핵 서 스 펜 션 완충 액으로 펠 렛을 정지 시키고 다시 원심 분리기. 상층 액을 버리십시오. 최종 펠 릿은 고립 된 핵이 될 것입니다.</li>
</ol>7. 단백질의 추출
<ol><li>1 배 용 해 완충 액의 25 µ L을 세포 펠 렛에 직접 추가 하는 것을 제외 하 고 4 절을 반복 하 여 현 탁 한다.</li>
</ol>8. 샘플 준비
<ol><li>각 가용성 단백질 추출 물 10 µ L을 복용 하 여 SDS-PAGE 용 샘플 2 개를 준비 하 고 2x Laemmli SDS 샘플 버퍼 10 µ을 추가 하 고 2 진단을 (BME)의 µ L을 첨가 합니다.</li>
	<li>37 ° c에서 5 분 동안 1 개의 샘플을가 열 하 고, 98 ° c에서 15 분 동안 제 2 샘플을가 하 여 포름알데히드 크로스 링크를 역전 시켰다.</li>
</ol>9. SDS 페이지 분석
<ol><li>1L(1l의 1 리터) 트리 스 글리신 실행 버퍼 (25mm 트리 스, 192 mM 글리신, 0.1%)를 준비 합니다.</li>
	<li>
SDS 페이지 실행 장치를 설정 합니다. 참고: 이 프로토콜은 16% 프리 캐스트 TGX SDS 페이지를 사용 합니다. 모든 백분율 젤을 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>제조업체 프로토콜에 따라 젤이 저장 된 패키지를 열고 카세트를 제거 하십시오.</li>
		<li>카세트 밑면에서 우물과 테이프를 감싸는 빗을 제거 하십시오.</li>
		<li>실행 장치에 젤을 놓습니다.</li>
		<li>우물이 액체에 잠길 때까지 1x 실행 버퍼로 챔버를 채 웁 니다. 플라스틱 파이프를 사용 하 여 실행 중인 버퍼로 우물을 헹 굽 니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 µ L prestained 표준 마커와 함께 젤에 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>젤의 바닥에서 약 1cm의 염료 전면이 될 때까지 200 V에서 젤을 실행 합니다.</li>
</ol>10. 웨스턴 블랏
<ol><li>1L의 1x 트랜스퍼 버퍼 (25mm 트리 스, 192의 글리신, 20% 메탄올)를 준비 하 고 사용 하기 전까지 4°c에서 보관 하십시오.</li>
	<li>조심 스럽게 젤을 제거 하 고 카세트를 엽 니. 면도기를 사용 하 여 스태킹 젤을 조심 스럽게 자르고 버립니다. 한 모서리를 사용 하 여 젤을 들고 전송 버퍼가 있는 트레이에 올려 놓고 5 분간 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>젤이 흔들 리는 동안 얼음 블록 (-20°c에 저장 된)을 이송 탱크에 넣고 전송 버퍼를 ¾ 전체에 추가 합니다.</li>
	<li>30 초 동안 100% 메탄올에 담가 폴 리 불 화물 (PVDF) 멤브레인을 적셔.</li>
	<li>5 분이 지나면 전송 버퍼가 있는 트레이에 전송을 설정할 준비를 합니다. 전송 버퍼는 블 럿을 완전히 서브 머지 하기에 충분 해야 합니다. 다음과 같이 블 롯 전송을 설정 합니다. 하단에서 카세트 홀더의 바닥 (검은색); 그런 다음 두꺼운 스폰지, 여분의 두꺼운 종이, 폴 리 아크릴 아 미드 젤, PVDF 멤브레인, 여분의 두꺼운 종이 및 두꺼운 스폰지; 그런 다음 마지막 카세트 홀더 (흰색)의 상단에.</li>
	<li>카세트를 잠그고 양극과 겔을 향해 PVDF 멤브레인을 음극 쪽으로 향하게 하 여 장치를 이송 탱크에 놓습니다. 전송이 완전히 잠길 때까지 전송 버퍼를 사용 하 여 장치를 맨 위로 끕니다.</li>
	<li>장치를 교 반 플레이트 위에 놓습니다. 장치에 교 반 막대를 추가 하 고 125 rpm에서 교 반을 시작 하십시오.</li>
	<li>60 분 동안 100 V에서 실행 하십시오.</li>
	<li>전송이 실행 되는 동안, 트리 스 완충 식 염 액에 용 해 된 5% 분말 우유 용액을 트윈-20, pH 7.5 (TBST)로 준비 하십시오.</li>
	<li>장치를 해체 하 고 멤브레인을 제거 하 고 어느 쪽이 젤과 접촉 했습니까? 나머지 단계를 위해이 측면이 용지함에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>트리 스 완충 식 염 수가 2 분 동안 멤브레인을 담근 다음, 실 온에서 30 분 동안 5% 우유 TBST 용액 5Ml를 배양 하 여 멤브레인을 차단 하였다.</li>
	<li>우유를 신선한 4 mL의 5% 우유 TBST 용액으로 교체 하 고 일차 항 체를 적절 한 희석 액에 첨가 하십시오 (이 경우, 우리의 희석은 dUTPase 항 체의 경우 1:2000 이며, 4 ° c에서 부드러운 락으로 밤에도 배양 됩니다.</li>
	<li>다음날, 4 ° c 로커에서 실 온 로커로의 블랏을 제거 하 고 1 차 항 체 용액을 폐기 한다.</li>
	<li>충분 한 액체를 사용 하 여 3 번의 세척, 5 분 각, 천천히 흔들 다음, 충분히 액상을 이용 하 여 TBST로 빠르게 세척 하십시오.</li>
	<li>마지막 세척 후 5% 우유 TBST 용액 5Ml를 추가 하 고 15 분 동안 블 롯을 흔들어 버린 다음 버리십시오.</li>
	<li>원하는 농도로 5% 우유 TBST에 희석 된 2 차 항 체를 추가 합니다. (이 경우, 1:5000 mL의 염소 항 토끼 희석 5% 우유-TBST 솔루션)</li>
	<li>1 시간 동안 흔들어 실 온에서 배양 한 후 용액을 버리십시오.</li>
	<li>그 다음에는 TBST로 세 번의 빠른 세척을 하 고 3 개의 세척을 5 분간 각각 천천히 흔들어 마지막 세척을 버리고 5 mL의 TBS를 추가 하십시오.</li>
	<li>1:1 혼합 된 ECL 화학 발광 검출 용액 (각 시 약 1 mL을 최종 부피 2ml)로 제조 하 고이를 1 분 동안이를 블 럿에 직접 첨가 한다.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 멤브레인을 제거 하 고 실험실 와이프로 모서리를 살짝 적셔 여분의 용액을 제거 하십시오. 멤브레인을 수축 랩에 놓고 단백질 면을 x 선 카세트에 올려 놓으십시오.</li>
	<li>멤브레인을 엑스레이 필름에 노출 시킵니다. 노출 시간은 다를 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 원고의 내용과 이해 상충이 없음을 선언 합니다.

여기에 설명 된 방법은 이황화 물 결합을 통해 안정화 된 다이 성체 복합체의 분석을 위한 바로 앞 프로토콜을 제공 한다. 이 프로토콜은 다른 세포 배양 라인, 조직 및 유기 체에 쉽게 적용 될 수 있어 광범위 한 응용 분야에 적합 합니다.
이 절차의 중요 한 단계는 이황화 물 연결이 추출 절차의 결과를 보장 하는 것입니다. 임의의 자유 시스테인 잔기는 iodoacetamide13을 사용 하 여 차단할 수 있다. 이 알킬화제 에이전트는 그들의 티 올 그룹 이더라도 시스테인 잔기에 공유 결합, 새로운 이황화 결합의 형성을 차단. 그러나,이 제제는 치료 시에 이황화 결합이 존재 하는 경우이를 방해 하지 않을 것 이다. Iodoacetamide의 최적화는 농도와 시간의 변화를 이용 하 여 수행 될 수 있다. 그러나이 시 약에 노출 되 면 세포가 사 멸 될 수 있습니다.
도움이 될 수 있는이 프로...

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 최근 작업에서, 이러한 결합은 가역 적 번역 후 변형으로 분류 되었으며, 시스테인 기반 "산화 환 원 스위치"로 작용 하 여 단백질 기능, 위치 및 상호작용의 변조를 허용 하는1,2, 3,4. 따라서,이 수정을 연구 할 수 있는 것이 중요 합니다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해5. SDS-PAGE 분석은 많은 실험실에서 사용 되는 기술로, 결과를 신속 하 고 쉽게 분석 하 고 최소한의 비용으로 해석 할 수 있으며 질량 분석기와 같은 이황화 물 결합을 식별 하는 데 사용 되는 다른 기술 보다 유리 합니다6 ,7 및 원형 중 크롬 산8.
이 방법이 연구에 도움을 주는 적절 한 기술 인지 결정 하는 한 가지 중요 한 단계는 시스테인 잔기 (들)이 존재 하는 것을 보장 하기 위해 관심 있는 단백질의 일차 서 열을 철저히 조사 하는 것 이다. 또 다른 유용한 단계는 게시 된 임의의 이전 결정 구조를 연구 하거나 생물 정보학 응용 프로그램을 사용 하 여 관심 있는 단백질의 3 차원 구조를 탐구 하 여 시스테인 잔기 (들)가 위치할 수 있는 곳을 가시화 하는 것 이다. 잔류물 (들)이 외부 표면 상에 존재 하는 경우에는 상기 구조의 내부에 묻혀 있는 시스테인 잔기가 아닌 이황화 결합을 형성 하는 것이 더 좋은 후보가 될 수 있다. 그러나 단백질이 기질 상호 작용 또는 단백질-단백질 상호작용에 따라 구조적 변화를 겪을 수 있으므로 이러한 잔류 물이 환경에 노출 될 수도 있다는 점에 유의 해야 합니다.
확인 된 다이 성체 복합체는 포름알데히드를 사용 하 여 화학적 가교 결합으로 확인 될 수 있다. 포름알데히드는 높은 세포 투과성 및 짧은 가교 범위에 기인한이 검증 기술에 대 한 이상적인 교차 링커입니다 ~ 2-3 Å, 특정 단백질-단백질 상호작용의 검출을 보장 하는9,10. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS11로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다. 그러나,이 프로토콜은 그밖 세포 선, 조직 및 유기 체를 위해 적응 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>16% 프리캐스트 TGX 젤</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 플라스크</td><td>셀 스타</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2 접시</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL 감지 키트</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>블롯 전달 장치</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 단백질 시약</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>세포 신호</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>세포 용해 완충</td><td>세포 신호</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 장치</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>매우 두꺼운 웨스턴 블로팅 페이퍼</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>유리 - 테프론 균질화 기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td>덴빌</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>헥스</td><td>시그마 알드리치</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>요오드 아세트 아미드</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>세포 신호</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Posi-click tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Prestained marker</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>세포 신호</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>소형 세포 스크레이퍼</td><td>Tygon</td><td>S-50HL 클래스 VI</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td><td>나트륨 Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>블로팅용 스폰지 패드</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris 완충 식염수, 트윈 20 포함, pH 7.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine 러닝 버퍼</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>X선 필름</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

비 환 원 sds-page 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

많은 단백질의 구조는 공유 이황화 결합을 통해 안정화 됩니다. 최근 작업에서,이 결합은 또한 번역 후 변형으로 분류 되었다. 따라서, 살아있는 세포에서 이러한 변형을 연구할 수 있는 것이 중요 하다. 이러한 시스테인 안정화 다중 성체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 포름알데히드 가교의 2 단계 방법을 통해 서 이다. 이러한 2 단계 방법은 그 기술적 용이성 및 낮은 운용 비용으로 인해 이황화 물 결합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 발굴 하는 첫 번째 단계로 서 유리 하다. 여기서, 인간 뼈 골 육 종 세포 주는 U-2 OS는 dUTPase의 핵이 소 형태를 구체적으로 분석 함으로써이 방법을 설명 하기 위해 사용 된다.

핵 dUTPase는 각각의 단량체 성 단백질 (11)의 제 3 아미노산에 위치 하는 두 개의 시스테인 잔기의 상호작용을 통해 안정한이 량 체 구성을 형성 하는 분 자간 디 설파 이드 결합을 형성할 수 있다. 이는 도 1a, B에 설명 되어 있다. 이 이황화 결합이 감소 된 환경에서 이주 이상으로 인 한 비 특이 적 상호작용을 보장 하기 위해, t는 적절 한 제어의 포함이 필수적 이었다. 핵 dUTPase은 인 간에 게 존재 하는 4 개의 isoforms 중 하나입니다. 4 개의 isoforms 중 3 개는 공통의 촉매 코어 (11,12)를 공유 하면서 고유한 아미노 말단 도메인을 가진다. 웨스턴 블 롯에서 볼 수 있듯이, 수확 시에 인간 세포...

이황화 물 결합은 오랫동안 많은 단백질의 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 왔다. 이러한 고리에 의해 안정화 된 다중 이성질체 복합체를 분석 하는 간단한 방법은 비 환 원 SDS-PAGE 분석을 통해 서 이다. 여기서,이 방법은 인간 뼈 골 육 종 세포의 dUTPase OS 로부터 핵이 소 형태를 분석 하 여 예시 된다.

비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

그것은 잘 많은 단백질의 구조는 공유 이황화물 연결에서 안정화되어 있음을 잘 확립하고있다. 최근 작업에서이 채권은 번역 후 수정으로 분류되었습니다. 따라서 빠르고 간단한 방법을 사용하여 살아있는 세포에서 시스테인 안정화 멀티머 복합체를 식별할 수 있어야 합니다.이 기술의 주요 장점은 결과를 얻을 수 있고, 쉽고, 최소 비용으로 해석할 수 있다는 것입니다. 우선, 최소 필수 중간 고당감의 6평방센티미터 접시에 U-2 OS 세포를 성장시키고, 10%의 FBS와 1%나트륨 피루바테를 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도로 보충한다. 사용하기 직전에 10 밀리마일라 요오도아세타미드의 신선한 육수를 만드십시오.세포가 50~60%에 도달하면 세포 배양 매체에 직접 0.1 밀리머 최종 농도 요오도아세타미드를 추가합니다. 실온에서 2분간 부드럽게 접시를 흔들어 주세요. 다음으로, 세포로부터 미디어를 흡인시키고, 차가운 PBS의 5밀리리터로 세포를 세 번 씻는다.최종 PBS 세척 용액을 흡인하고 차가운 PBS 1 밀리리터를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 1밀리리터 파이펫을 사용하여 PBS 및 셀 서스펜션을 작성하고 모든 액체를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 분배합니다.세포가 섭씨 4도에서 7, 500g에서 3분간 회전합니다. 세포 펠릿을 뒤로 하고 PBS를 흡입합니다. 세포 펠릿은 처리 될 때까지 영하 80도에서 저장할 수 있습니다.단백질을 추출하려면 이중 증류수로 희석된 1X 리시스 버퍼의 100마이크로리터를 준비합니다. 1 밀리머 최종 농도에 사용하기 직전에 PMSF를 추가합니다. 그런 다음 1X 용해 버퍼의 50 마이크로리터를 셀 펠릿에 직접 추가하고 다시 중단합니다.5 분 동안 얼음에 추출물을 배양. 일정한 펄스 모드를 사용하여 8초 동안 초음파 처리하여 40%의 속도로 추출물을 얼음 위에 유지합니다. 추출물을 섭씨 4도, 16, 000배에서 5분간 회전합니다.원하는 경우 단백질 농도를 결정하기 위해 브래드포드 분석을 수행합니다. 시료를 준비하려면 수용성 단백질 추출물의 10 마이크로리터를 채취하고 1X Laemmli SDS 샘플 버퍼의 10 마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.젤을 실행하기 전에 샘플을 섭씨 85도에서 5분간 가열합니다. 포름알데히드 교차 연결을 시작하려면 175 평방 센티미터플라스크에서 U-2 OS 셀을 70 ~80%의 연결성으로 성장시다. 연기 후드에서 포름알데히드 고정을 중간에 직접 첨가하여 최종 농도가 1%로, 15분 동안 부드러운 교반으로 실온에서 배양합니다.반응을 담금질하려면 1.25 개의 어금니 글리신을 최종 농도0.125 어금니에 추가하고 5 분 동안 로커에 부드러운 동요로 실온에서 배양하십시오. 차가운 PBS의 5 밀리리터로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 최종 PBS 세척 용액을 흡인하고 PBS 10 밀리리터를 추가합니다.셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 긁어냅니다. 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 PBS 및 세포 현탁액을 끌어내고 모든 액체를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 분배합니다. 셀을 500배, 섭씨 4도에서 2분간 회전합니다.세포 펠릿을 뒤로 하고 PBS를 흡입합니다. pH 7.4에서 0.25 개의 어어 자당, 1 밀리머 EDTA, 10 밀리모어 HEPES 및 0.5 %BSA를 추가하여 균질화 버퍼의 10 밀리리터를 준비하십시오. 사용 직전에 PMSF를 1 밀리머 최종 농도와 3밀리리터의 핵 서스펜션 버퍼에 추가하십시오.균질화 버퍼의 5 밀리리터를 세포 펠릿에 직접 넣고 완전히 다시 중단합니다. 서스펜션은 500배, 섭씨 4도에서 2분간 분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 버리고 균질화 완충제의 5 밀리리터로 펠릿을 다시 놓습니다.그런 다음 타이트 한 피팅 유리 Teflon 균질화로 500 RPM 당 10 스트로크로 세포를 균질화하고 10 분 동안 1, 500 배 및 섭씨 4도에서 서스펜션을 원심 분리합니다. 원심 분리 후 상체를 폐기합니다. 핵 서스펜션 버퍼의 1밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 10분 동안 얼음에 배양합니다.인큐베이션 후 원심분리기는 10분 동안 600배 g로 원심분리기를 합니다. 원심분리 후, 상체를 버리고 핵 현탁액 버퍼및 원심분리기의 1밀리리터로 펠릿을 다시 보간한다. 최종 펠릿은 분리된 핵이 될 것이다.1X 리시스 버퍼의 25 마이크로리터를 세포 펠릿에 직접 첨가하기 전에 설명된 바와 같이 단백질을 추출한다. 그런 다음 수용성 단백질 추출물 10마이크로리터를 복용하여 SDS PAGE에 대한 두 가지 샘플을 준비하고 2X Laemmli SDS 샘플 버퍼 10개와 BME 의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 1샘플을 섭씨 37도에서 5분간 가열하고 두 번째 샘플을 섭씨 98도에서 15분간 가열하여 포름알데히드 크로스 링크를 반전시합니다.25 밀리머 트리, 192 밀리머 글리신및 부피 SD 당 0.1 %의 무게를 혼합하여 1X 트리스 글리신 실행 버퍼의 1 리터를 준비합니다. 그런 다음 SDS PAGE 실행 장치를 설정합니다. 제조업체의 프로토콜당 16%의 프리캐스트 TGX SDS-PAGE 패키지를 열고 카세트를 제거합니다. 카세트 의 바닥에서 우물과 테이프를 안감하는 빗을 제거하고 젤을 실행 장치에 넣습니다.우물이 액체에 담길 때까지 챔버를 1X 실행 버퍼로 채웁니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 러닝 버퍼로 우물을 헹지 게 됩니다. 미리 스테인드 된 표준 마커의 10 마이크로 리터와 함께 샘플을 젤에 로드합니다.마지막으로, 염료 전면이 젤 의 바닥에서 약 1 센티미터 가 될 때까지 200 볼트에서 젤을 실행합니다. BME 환원제의 부재에 있는 총 세포 추출물의 서쪽 얼룩 분석은 상이한 인간 세포 집단에 있는 다혈복합체 형성을 보여주었습니다. 복합체는 검사된 4개의 세포주 모두에 BME를 추가하여 사라졌으며, 이는 이황화물 연계의 존재를 나타냅니다.수확 시 인간 세포에서 dUTPase의 단황 확인은 dUTPase의 동소 형태의 적어도 세 가지의 조합입니다: 미토콘드리아 동소형태, 핵 동위형태, M24에 지적된 잘린 버전. 대조군으로 사용되는 미토콘드리아 동소형은 이황화물 연계를 형성하지 않았고 단황 단백질에 대한 예측된 분자량으로 이동시켰다. 핵 dUTPase의 포름알데히드 교차 연결은 다원 복합 형성을 입증했다.15분 동안 95도에서 샘플을 배양하여 교차 링크가 반전되었을 때, 복합체는 불안정하고 단색 상태로 시각화될 수 있었습니다. 요오도아세타미드를 추가하는 것은 이 절차에서 무료 시스테인 잔류물을 차단하고 이황화물 연계가 추출 절차의 결과가 아님을 확인하는 중요한 단계입니다. BME 또는 DDT와 같은 환원제를 SDS-PAGE 샘플에 추가하지 않는 것이 중요합니다.

combining-non-reducing-sds-page-analysis-chemical-crosslinking-to

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

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비 환 원 SDS-PAGE 분석 및 화학적 가교 결합으로 포유류 세포에서 이황화 물 조합에 의해 안정화 된 다이 성체 복합체를 배양에 검출

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