스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

이 프로토콜은 시각 발달 및 유전 질환 모델의 중요한 기능 적 판독을 제공하는 애벌레 얼룩말피에서 전기 전세 사진 또는 ERGs의 측정을 단순화하는 데 도움이됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 전극을 기록하는 부드러운 스폰지 팁은 경제적이고 쉽게 사용할 수있는 재료를 사용하여 제조하기 쉽고 애벌레 눈에 잠재적 인 손상을 방지할 수 있습니다. 부드러운 스폰지 팁 전극은 동일한 눈의 반복된 ERG 측정을 용이하게 할 수 있습니다.

이 절차에 새로운 개인은 절차 전반에 걸쳐 사용되는 희미한 빨간색 조명 아래에서 작업하기가 어려울 수 있습니다. 그러나 어두운 적응을 유지하는 것이 중요합니다. 원뿔 모양의 스폰지 기록 전극을 준비하기 위해 백금 전극 납 연장에서 끝을 자르고 메스를 사용하여 확장의 새로운 끝에서 외부 폴리테트라플루오로틸렌 절연 코팅의 10 밀리미터를 제거합니다.

직경 0.3mm의 실버 와이어의 40밀리미터 조각을 자르고 노출된 내부 와이어로 실버 와이어를 결합하여 전극 리드에 와이어를 단단히 부착합니다. 약 15mm 길이의 실버 와이어를 노출시키는 절연 테이프로 조인트를 감싸는 다. 다른 와이어를 배터리의 음수 단말에 연결하고 와이어의 다른 끝을 식염수에 담급다.

노출된 실버 와이어를 일반 식염수에 담그고 다른 쪽 끝을 9볼트 직류 소스의 양단에 연결합니다. 60초 후, 흡수성 조직에 와이어를 놓아 건조시다. 그 동안, 폴리 비닐 아세테이트 스폰지의 20 ~ 20 밀리미터 사각형을 원뿔 모양으로 자르고 한 번 링거의 버퍼에 스폰지를 포화.

접안렌즈에 스케일 바가 있는 가벼운 현미경아래에서 메스 블레이드를 사용하여 콘의 정점을 약 40 마이크로미터 직경으로 형성합니다. 원뿔 모양의 스폰지를 흡수성 티슈 페이퍼에 공기 건조시고 단단할 때까지 닦습니다. 실버 와이어를 말린 고체 원뿔 모양의 폴리 비닐 아세테이트 스폰지에 삽입하기 전에, 마스크 테이프를 사용하여 과도한 노출된 금속을 절연하여 광전지 유물을 감소시킵니다.

실험 당일, 스폰지 팁 전극을 링거의 버퍼에 15분 간 담그어 스폰지를 완전히 포화시합니다. 녹음 하기 최소 8 시간 전에 뚜껑없이 하나의 15 밀리리터 튜브에 20 마리 이상의 얼룩말 애벌레를 놓고 어두운 인큐베이터에 알루미늄 호일에 싸여 있습니다. 인큐베이션이 끝나면, 광방출 다이오드의 희미한 붉은 조명 아래, 어두운 색으로 조정된 제브라피쉬를 페트리 접시에 붓습니다.

스폰지 플랫폼을 준비하려면, 스폰지가 접시 내에서 잘 맞도록 두께가 35mm 페트리 접시의 깊이와 거의 동일한 폴리 비닐 아세테이트 스폰지 조각을 잘라. 스폰지의 한쪽 끝을 수직으로 잘라 서 참조 전극의 실버 와이어를 수용 하 고 스폰지포화 될 때까지 금붕어 링거의 버퍼에 스폰지를 담그십시오. 그런 다음 스폰지를 깨끗한 35mm 페트리 접시에 넣고 종이 타월을 사용하여 가벼운 손가락 프레스에 대한 응답으로 스폰지에서 용액이 발산되지 않도록 여분의 액체를 흡수합니다.

실험을 위해 동물을 배치하려면 3mm 파스퇴르 파이펫을 사용하여 마취된 유충을 3센티미터 의 종이 타월 사각형에 옮기고 집게를 사용하여 모이스펀지에 사각형을 놓습니다. 링거의 버퍼에 담근 미세한 브러시를 사용하여 애벌레 아래 수건에 있는 액체에서 한쪽 눈을 위쪽으로 향하여 애벌레의 위치를 조정합니다. 전하계 기록 전반에 걸쳐 수분을 공급하는 동물용 젤로 애벌레 본체에 유약.

그리고 패라데이 케이지 안에 위치한 간즈펠트 그릇 의 빛 자극 앞에 작고 가열된 플랫폼에 접시를 놓습니다. 플랫폼 스폰지에서 만든 절단에 기준 전극을 삽입합니다. 그리고 상업적으로 획득한 접지 전극을 패러데이 케이지에 연결합니다.

전극 을 전극 홀더에 부착하고 마이크로 조작기의 스테레오 탁스 암에 홀더를 고정합니다. 3mm 파스퇴르 파이펫을 사용하여 링거 용액 한 방울로 전극의 스폰지 끝을 분해하고 패러데이 케이지의 현미경을 전자 전세판 플랫폼 위에 배치합니다. 흡수 조직의 끝을 사용하여 전극 스폰지 팁과 현미경 아래에 과도한 액체를 제거하고, 스폰지 팁이 애벌레 얼룩말 눈의 중앙 각막 표면에 부드럽게 닿도록 활성 전극을 배치합니다.

그런 다음 간즈펠트 그릇을 스폰지 플랫폼쪽으로 이동하여 애벌레가 그릇에 덮여 있고 케이지를 닫아 불필요한 전자기 소음을 줄입니다. 희미하게 깜박이는 애벌레 얼룩말 망막의 감도는 나이가 들면서 증가합니다. a-파는 4일 후 수정 후 에서 제곱된 미터당 마이너스 1.61 로그 칸델라 초보다 낮은 강도에서 인식할 수 없으므로 오래된 애벌레의 이러한 강도에서 명확한 신호를 감지할 수 있습니다.

b-wave 진폭은 4에서 5번 의 후 수정 사이에 현저하게 증가합니다. 7일 시점에서 미터당 2.48로그 칸델라 초당 2.48로 신호가 5일과 6일 후 수정에 비해 더 큽습니다. A-와 b-wave 암시적 시간은 5일 후 수정 후 훨씬 빨라집니다.

전반적으로, 이러한 결과 4 ~7 일 후 수정 후 제브라피시 망막 기능에 성숙을 보여주는. 이 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 스폰지가 유체로 완전히 포화되어 기록 전극의 전도도를 유지하고 소음 수준을 낮추는 것이 중요합니다. 파도가 특히 관심이 있는 경우, 약리학적 치료가 적용되어 b-wave 성분을 차단하여 전체 파도를 노출시킬 수 있다.